Panx1蛋白在制备神经病理性疼痛防治药物中的作用的制作方法

panx1蛋白在制备神经病理性疼痛防治药物中的作用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及缝隙连接蛋白panx1在制备神经病理性疼痛防治药物中的作用。


背景技术：

2.神经病理性疼痛是一种由神经系统原发性损伤和功能障碍引起的慢性痛。其临床特点是顽固性强，发病率高，病程长，痛觉过敏在数周、数月乃至数年内仍然持续存在。目前治疗慢性神经病理性疼痛的关键难题在于其发生、发展机制还不完全清楚。过去很多年的研究，都集中在神经元，发现初级感觉神经元兴奋性增加导致的外周敏化，以及炎性介质作用于中枢神经元产生的中枢敏化，是神经病理性痛发生和维持的重要病理基础。但近些年越来越多的证据表明：在神经病理性疼痛的发生、发展过程中，神经胶质细胞发挥着重要的作用。神经胶质细胞主要包括中枢神经系统的胶质细胞：星型胶质细胞，少突胶质细胞以及小胶质细胞；以及周围神经系统的胶质细胞：施万细胞和卫星细胞。研究表明：在脑和脊髓中，神经损伤后，激活的小胶质细胞及活化的星型胶质细胞可释放多种疼痛相关的细胞因子，趋化分子等物质调节神经元的兴奋性，促进慢性神经病理性痛的发生、发展和维持；而抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，可阻断或缓解多种慢性神经痛。在周围神经系统中，卫星细胞包绕着背根神经元，其激活早于中枢神经系统的神经胶质细胞，在神经病理性痛的发生过程中，起着重要作用。然而，施万细胞在周围神经损伤后，可分泌多种与疼痛相关的促炎/抑炎因子，但其在神经病理性疼痛发生，发展及维持过程中的作用及可能机制，目前仍知之甚少。
3.pannexins(panxs)是继connexins 后被发现的另一缝隙连接蛋白家族。其是一大孔径的膜通道，对疼痛相关的atp及其他信号分子都具有一定的通透性。pannexins家族成员主要包括pannexin1、pannexin2和pannexin3，其中pannexin1(panx1) 备受关注，在神经系统的胶质细胞及神经元中广泛表达。研究表明：星形胶质细胞、小胶质细胞以及背根神经节中panx1的激活，在各种类型疼痛的发生、发展及治疗过程中，起着一定的调节作用。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供缝隙连接蛋白panx1在制备神经病理性疼痛防治药物中的作用，为panx1作为治疗靶点提供更有力的证据，同时为了进一步丰富施万细胞的生理病理功能及参与慢性神经病理性疼痛的分子调节机制。
5.本发明确定了施万细胞中主要表达panx1，慢性神经性病理损伤能引起其表达量显著增加；panx1的抑制剂和模拟肽，能显著抑制坐骨神经慢性神经病理性损伤引起的机械痛和热痛，同时panx1抑制剂probenecid能显著抑制损伤引起的panx1的表达。这为将来临床利用panx1抑制剂治疗慢性神经性病理疼痛患者提供有力的基础研究证据。
附图说明
6.图1为慢性神经性病理损伤引起坐骨神经panx1的表达结果。其中：a为实时定量pcr实验检测正常坐骨神经panx1、panx2和panx3的表达情况；b
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d为神经损伤后4天和14天，panx1、panx2和panx3 mrna的表达变化；e为免疫印迹检测神经损伤后4天和14天panx1的表达变化；f为e图的统计分析结果。
7.图2为慢性神经性病理损伤引起施万细胞panx1的表达增加。其中：a为坐骨神经中神经丝蛋白标记物nf200与panx1的免疫荧光共标结果；b为背根神经节标记物nissl与panx1的免疫荧光共标实验结果；c为cci损伤后，坐骨神经中施万细胞标记物s100β与panx1的免疫荧光共标实验结果；d为c图的统计分析结果。
8.图3为panx1抑制剂cbx、probenecid及模拟肽
10
panx1能显著抑制神经损伤后引起的机械痛和热痛。
9.图4为panx1 抑制剂probenecid显著抑制损伤后引起的panx1的表达。其中：a为sham组及cci后分别给予pbs，probenecid 3天及7天后，坐骨神经panx1表达变化；b为a图的统计分析结果。
具体实施方式
10.以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
11.实施例1发明人的前期研究发现体外培养的施万细胞主要表达panx1，其在低渗诱导的atp释放过程中起着重要的调节作用。因此，发明人推测施万细胞panx1可能是神经病理性疼痛调节的一靶向分子。
12.本发明先利用坐骨神经慢性压迫损伤（cci）小鼠疼痛模型，利用qpcr检测pannexins在损伤后的表达变化，利用免疫印迹及免疫荧光进一步检测panx1 在损伤后的表达变化；在cci损伤后10天，通过神经外膜下给予panx1抑制剂carbenoxolone (cbx)、probenecid 和 pannexin 1 模拟肽 10
panx 1，检测小鼠机械痛和热痛的变化，同时检测给予probenecid后，不同时间点panx1的表达变化。这些有助于了解施万细胞的panx1在神经病理性疼痛中的作用，为panx1作为临床治疗靶点，提供更多的基础研究依据，同时也进一步丰富了施万细胞的功能及神经病理性疼痛的细胞分子机制。
13.具体实验方法如下：1、构建坐骨神经慢性压迫性损伤模型(cci)：小鼠在手术平台上用异氟烷气体持续麻醉，剃毛消毒后，在股骨外侧上方纵向切开皮肤，顺肌纹钝性分离肌肉，暴露坐骨神经，游离周围组织，在坐骨神经三叉分支的近端约5 mm处，用6.0的手术缝合线做三道结扎，间距约1 mm, 以不影响神经外膜的血运为度，关闭切口后缝合皮肤，消毒。手术实施和术后动物护理均符合美国国立卫生研究院（美国）实验室动物护理和使用指南(nih publication no. 85
‑
23, revised 1996)。使用的实验动物获得南通大学动物伦理委员会批准(no. s20180806
‑
002)。
14.2、实时定量pcr：采用trizol法提取各组实验小鼠坐骨神经损伤处的总rna，分别定量1
µ
g后使用takara试剂盒进行总rna反转录，并合成cdna第一链，使用sybrgreen法定量检测panxs各亚型的表达。
15.panxs引物如下：panx1sensesequence:cctcattaacctcattgtgtat(seqidno.1)anti
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sensesequence：cattgtagccttcagacttg(seqidno.2)；panx2sensesequence:cattgtagccttcagacttg(seqidno.3)anti
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sensesequence:ctcctgctggatgtctag(seqidno.4)；panx3sensesequence:ctcagattatggactatgaacac(seqidno.5)anti
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sense：tcagaaggtaacttggagaat(seqidno.6)；18ssensesequence：gacaggattgacagattgatag(seqidno.7)anti
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sense：cgttatcggaattaaccagac(seqidno.8)；gapdhsensesequence：tccatgacaactttggcattg(seqidno.9)anti
‑
sense：cagtcttctgggtggcagtga(seqidno.10)。
16.3、免疫印迹：动物经处理后，提取cci结扎部位坐骨神经，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，超声波细胞粉碎仪冰上超声5s后，冰上裂解30min，14000rpm4℃离心30min，取上清，使用bca蛋白定量试剂盒定量后，加入1/4体积的5*上样loadingbuffer,沸水浴10min，分装
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20℃保存。于10％的分离胶电泳后转膜，在5％脱脂牛奶中室温封闭2h，加入一抗anti
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panx1(1:200，rabbit，abcam)，anti
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gapdh（1:10000，mouse，sigma）4℃孵育过夜，tbst洗膜3次，每次10min，anti
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rabbithrp标记的二抗（1:1000），室温孵育2h，ecl显色，化学发光成像仪曝光检测。
17.4、免疫组织荧光染色：小鼠经1%戊巴比妥钠深度麻醉后，固定四肢，暴露心脏，先使用生理盐水灌流至小鼠四肢和肝脏发白，后将灌流液换成4%pfa，灌流至小鼠全身变硬，小心取出坐骨神经，放至4%pfa，4℃后固定8
‑
12小时，再换至新鲜配制的30%蔗糖脱水至沉底（约2
‑
4天）。利用冰冻切片机，将坐骨神经纵切成12
µ
m/片，贴至正电荷包被的载玻片，待后续免疫组织荧光染色。
18.免疫组织荧光染色具体步骤如下：0.01mpbs清洗3次，每次10min，后用0.3%tritonx
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100室温破膜10min；0.01mpbs清洗3次，每次10min，后用10%bsa室温封闭2小时；使用含有3%bsa及0.1%tritonx
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100的0.1mpbs稀释如下抗体：anti
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nf200（1:500，mouse，sigma），anti
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s100β（1:400，mouse，sigma）,anti
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panx1（1:300，rabbit，abcam），4℃孵育1
‑
2天，0.01mpbs清洗3次，每次10min，然后根据一抗选择合适的荧光标记二抗，室温下避光标记2h，0.01mpbs清洗3次，每次10min。对于背根神经节nissl染色（1:200，thermofish），室温孵育20min,清洗过程与二抗孵育后相同，最后使用90%的甘油封片，室温晾片，利用激光共聚焦显微镜进行图像采集。
19.5、坐骨神经外膜下注射：cci模型小鼠经麻醉后在股骨外侧上方纵向切开皮肤，钝性分离肌肉，暴露坐骨神经，在cci第一道结扎处，于坐骨神经外膜下利用微量注射泵缓慢注射6
µ
lpbs，panx1相关抑制剂及模拟肽（包括抑制剂carbenoxolone(cbx，100μm),probenecid，500μm和pannexin1模拟肽
10
panx1，100μm），完成注射后停针约5
‑
10min，关闭切口，缝合皮肤并消毒。
20.6、疼痛行为学检测：所有动物行为学实验采取“双盲”的实验设计方案。小鼠在cci模型前，筛选机械痛觉阈值均值在1.0左右，热痛阈值均值在10 s；于损伤后第十天，经坐骨神经外膜下给予panx1抑制剂及模拟肽后检测机械痛和热痛的变化。
21.（1）机械痛觉异常实验：用von frey纤维丝以up
‑
down法推算50%缩足阈值：将一有机透明玻璃箱置于金属筛网上，待小鼠在有机玻璃箱中适应30 min 后，用von frey纤维丝垂直刺激小鼠后肢 足底中部，持续时间1
‑
2 s，小鼠出现抬足或舔足行为视为阳性反应，否则视为阴性反应。
22.（2）热痛觉过敏实验：将有机玻璃箱置于3 mm 厚玻璃板上，按hargreaves 法用热辐射刺激以照射小鼠足底紧贴玻璃板部位。记录照射开始至小鼠出现抬足时间，截止时间为20 s。
23.结果如下：1、坐骨神经慢性神经性病理损伤引起施万细胞panx1的表达增加实时定量pcr结果显示正常小鼠坐骨神经中panx1的表达显著高于panx2和panx3（图1a），同时慢性神经性病理损伤（cci）能显著引起panx1的表达增加（至少维持14天），而panx2和panx3的表达下降（图1b
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d）。免疫印迹结果进一步从蛋白水平证实神经损伤能显著增加panx1的表达（图1e
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f）。为了进一步证明损伤后panx1的表达增加主要是施万细胞中的panx1表达增加，发明人检测了panx1在坐骨神经及drg中的表达，免疫荧光双标实验（图2a
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b）结果显示panx1主要表达在背根神经节的胞体（nissl标记），较少表达于突起（nf200标记）；与施万细胞的标记物s100β具有良好的共定位，同时在cci后4天及14天，施万细胞panx1的表达均显著增加。
24.2、panx1抑制剂能显著缓解慢性神经性病理损伤引起的机械痛和热痛行为学实验证实，在慢性神经性病理损伤后10天，经坐骨神经外膜下注射panx1抑制剂carbenoxolone (cbx)、probenecid 和 pannexin 1 模拟肽 10
panx 1，能显著抑制神经损伤引起的机械痛和热痛，效果可以维持3
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4天（图3）。
25.3、panx1抑制剂probenecid显著降低神经损伤引起的panx1表达上调免疫荧光实验结果显示：神经损伤后给予抑制剂probenecid 和pbs，panx1的表达与sham组（假手术组）相比，均显著增加，但给予probenecid后3天，panx1的表达量显著低于pbs组（图4）。