通过抑制EBAG9增强溶细胞性T细胞活性的制作方法

通过抑制ebag9增强溶细胞性t细胞活性
技术领域
1.本发明涉及细胞治疗剂领域，尤其涉及增强适用于治疗癌症的治疗性t细胞的细胞毒活性的手段。
2.本发明涉及一种遗传修饰的细胞毒性t细胞，其包含编码转基因抗原靶向构建体的一种或多种外源核酸分子，其中在所述细胞中，雌激素受体结合片段相关抗原9(ebag9)活性被抑制。本发明还涉及修饰的细胞毒性t细胞，其中抗原靶向构建体是嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)。本发明进一步涉及修饰的t细胞作为治疗增殖性疾病的药物的用途，以及相应的治疗方法，其特别是用于治疗恶性血液病的治疗方法。本发明还涉及一种药物组合物，其包含修饰的t细胞、编码抗原靶向构建体的核酸载体和优选使用rna干扰抑制ebag9的手段，并且涉及提高细胞毒性t细胞裂解活性的体外方法。


背景技术：

3.血液瘤变是异质性的，可以通过侵袭性和惰性过程来区分。护理标准是抗体/化学疗法的组合，通常与自体干细胞移植、免疫调节药物、放射、蛋白酶体抑制剂、信号传导途径抑制剂联合使用，并且对于极少数患者，与同种异体干细胞移植联合使用。因为在许多b
‑
nhl实体中，诊断时的中位年龄>66至72岁，所以还存在合并症，因而无法进行密集和长期的化学疗法，甚至不能进行同种异体骨髓移植。
4.在成熟b细胞淋巴瘤中，bcr信号传导抑制剂，最重要的是依鲁替尼等，在缓解率方面取得了巨大进步。尽管最初对这类激酶抑制剂具有高敏感性，但尚不确定能否根除肿瘤；其次，几项研究表明，克隆性淋巴瘤和白血病的演变导致对btk抑制产生抗性。因此，针对靶向疗法的继发性抗性的迅速出现迫切要求找到可耐受的挽救疗法的方案，该方案适用于改变几种其他化学疗法治疗，因而临床表现(ipi评分)降低的患者。
5.靶向白血病和淋巴瘤b细胞上广泛表达的cd19抗原的过继嵌合抗原受体(car)
‑
t细胞疗法带来了实质性的临床疗效。还已经描述了基于针对作为肿瘤相关抗原的bcma(wo2017/211900)和cxcr5(wo2019/038368a1)的抗原特异性的car
‑
t方法。
6.但是，在针对b
‑
nhl的抗cd19抗体或car
‑
t细胞疗法中，由于抗原丢失或下调，而产生抗性。最近的研究表明，在抗cd19 car
‑
t细胞疗法后，出现了由于选择了替换剪接的cd19同种型而导致的逃逸变体，因此丧失了同源cd19 car表位。因此，除了现有的治疗性mab或car
‑
t细胞疗法之外，还出现其他的car特异性作为b细胞淋巴瘤免疫疗法的替代靶点。同样，对于与多发性骨髓瘤相关的bcma抗原，注意到从肿瘤细胞膜上脱落，导致bcma car的可靶向结构大幅减少。
7.有效的过继t细胞疗法(att)依赖于高亲合力、长寿命的肿瘤抗原特异性cd8 和/或cd4 t细胞的产生。功能亲合力取决于tcr或car对其同源抗原的结构亲合力，还取决于t细胞的溶细胞效率，而t细胞的溶细胞效率受效应细胞因子和溶细胞分子的合成、运输和储存的影响。此外，过继转移的t细胞，无论是配备有tcr还是配备有car，在存在肿瘤微环境的情况下，都容易发展出耐受性或功能失调状态。因此，t细胞用于打破这种功能失调状态或
防止这种状态的功能是有必要的。
8.已在t淋巴细胞中评估了雌激素受体结合片段相关抗原9(ebag9)的功能，并发现ebag9可调节细胞毒活性。r
ü
der等人(j.clin.invest.2009,119:2184
–
2203)教导了ebag9负调节小鼠cd8 t细胞的溶细胞能力。ebag9的丧失导致颗粒酶a的ctl分泌增加。此外，miyazaki等人(oncogenesis(2014)3,e126)教导了ebag9调节小鼠t淋巴细胞的细胞毒性活性，因此通过负调节适应性免疫应答来调控肿瘤生长和转移。尽管有这些发现，但尚没有提出或尝试将ebag9抑制并入包含转基因抗原靶向构建体的人细胞毒性t细胞中。迄今为止，关于ebag9的发现一直是从调控癌细胞中ebag9表达的角度考虑的。根据miyazaki等人，ebag9在癌细胞中表达升高，随后对内源性宿主免疫应答产生负调节。然而，本领域中尚没有提出在对于转移到受试者以增加溶细胞能力具有工程化抗原特异性的治疗性t细胞中抑制ebag9。
9.鉴于上述缺陷和采用对恶性细胞表现出高亲合力和细胞毒性活性的t细胞来开发细胞疗法的固有困难，该领域迫切需要新的手段来提高溶细胞性t细胞的活性和最终治疗效果，以便克服例如肿瘤抗性或肿瘤抗原脱落方面的困难。


技术实现要素：

10.根据现有技术，本发明的技术问题是提供用于增强治疗性t细胞的溶细胞活性的替代或改进手段，特别是那些利用将t细胞导向特定肿瘤靶标的抗原特异性靶向构建体的替代或改进手段。本发明的另一个目的是提供改进car
‑
t或tcr t细胞疗法的手段。本发明的又另一个目的是提供加速制造感受态car t细胞的手段。
11.该问题由独立权利要求的特征解决。本发明的优选实施例由从属权利要求提供。本发明旨在解决上述问题，同时避免现有技术的缺点。
12.因此，本发明涉及遗传修饰的细胞毒性t细胞，其包含编码转基因抗原靶向构建体的一种或多种外源核酸分子，其中在所述细胞中，雌激素受体结合片段相关抗原9(ebag9)活性被抑制。
13.本发明人工程化了ebag9被抑制的修饰的t细胞，以将ebag9缺失或敲低对溶细胞效应分子释放的刺激作用转化为att的治疗环境。
14.如下所示，在优选的实施方式和实例中，本发明人将ebag9的mirna靶向与各种car构建体结合，如本文更详细描述的，所述car构建体最重要的是bcma car、cd19 car和cxcr5 car。产生了逆转录病毒，并转导了人t细胞。这些t细胞被赋予了显著改善的溶细胞活性，如体外溶细胞杀伤作用的增强所证明的。在体内，使用人多发性骨髓瘤细胞对nsg小鼠进行异种移植实验，然后移植少量工程化car t细胞。
15.因此，ebag9表达被沉默的car t细胞被赋予了高溶细胞效率，在一些实例中可见肿瘤完全根除。因此，优选由rnai介导的ebag9抑制导致对于car
‑
t和细胞疗法中类似方法的功效的增加具有令人惊讶的效果。这种增加代表了技术人员无法预料的令人惊讶的效果。
16.本发明以抑制表达抗原靶向构建体的ctl中的ebag9为特征，进一步由不增加自身免疫性风险的优势定义。增强t细胞溶细胞效率的替代细胞生物学方法是现有技术中描述的标准细胞培养程序，包括赋予t细胞趋向效应表型或记忆表型的确定的成熟状态。然而，
对t细胞活化的其他障碍物的下调，例如pd
‑
1或cbl
‑
b的丧失，与自身免疫性的巨大风险相关。令人惊讶的是，在ebag9
‑
ko小鼠中没有观察到自身免疫性，因此在使用本发明的细胞进行att之后，基本上没有发生这种疾病的风险或大幅度地降低发生这种疾病的风险。
17.作为本发明的另一个优点，ebag9靶向细胞过程中的翻译后步骤，并因此干扰确定的分泌途径，该途径仅在t细胞中有效，而在其他体细胞中无效。通过使用成熟t细胞的体外mirna方法选择性地靶向ebag9，风险状况非常低。
18.此外，作为另一个优势，ebag9沉默不是致癌驱动因素，反而赋予了cd8 t细胞(而非nk细胞)增强的免疫能力。ebag9缺陷还与抗原特异性记忆形成的增加有关，这对于预防肿瘤复发是重要的。
19.ebag9抑制(优选沉默)方法的生物学原理是新颖的，并且具有意想不到的优势，如上文所述以及下文更详细地所描述的。首次在ctl中靶向翻译后转运步骤，有助于增强溶细胞效应分子的提供。
20.这种ebag9抑制导致溶细胞能力增强且肿瘤根除效率更高，而不会危及耗竭或功能障碍状态。在临床前模型中没有观察到明显的副作用，这与其他靶向信号传导过程的方法(pd
‑
1、cbl
‑
b)形成鲜明对比。
21.因此，本发明还允许更快速地产生被赋予更好的体外和体内抗肿瘤活性的基因工程化(优选cd8 和cd4 )t细胞。为了提供有效剂量的car t细胞，通常至少需要12天才能使细胞准备好用于施用。当使用ebag9抑制时，该时间框现在可以显著加快，在某些情况下，将制备时间减少到低于10天来产生有效剂量的car t细胞。换句话说，要达到相同的效果，需要较少的car t细胞，因此需要较短的离体和体外扩增阶段。这将节省大量的细胞生产成本且治疗更快。因此，在制造水平、生物学水平和治疗水平上的改进是明显的，从而提供了从现有技术无法预测的一系列优势。
22.本发明人的体外分析进一步揭示，工程化t细胞不容易发展出更快的耗竭阶段，表明应用ebag9工程化car t细胞是改进用于几种恶性血液病的att的可行策略。在一些实施方式中，与未修饰的对照细胞例如其中ebag9未被抑制的ctl相比，本发明的修饰的ctl的特征在于溶细胞活性的耗竭相对较慢。
23.高亲和性(affinity)和高亲合力(avidity)使car
‑
t和tcr
‑
t细胞能够识别肿瘤靶细胞、针对肿瘤靶细胞而被活化和杀死肿瘤靶细胞，所述肿瘤靶细胞具有高和中等同源抗原表面表达。然而，尚未描述亲合力成熟的car。
24.因此，本发明代表了本领域先前未公开或未提出的ctl活性改进的突破性构思。据本发明人所知，目前没有人使用通过改进t细胞中的分泌途径实现att效率增加的竞争性生物学原理。
25.尽管ebag9对溶细胞活性具有已知的负调节功能，但现有技术中尚没有提出或尝试将ebag9抑制并入包含转基因抗原靶向构建体的细胞毒性t细胞中。关于ebag9的现有技术表明，ebag9表达在癌细胞中升高，该癌细胞随后负调节内源性宿主免疫应答。对具有工程化抗原特异性以增加溶细胞能力的治疗性t细胞中的ebag9的抑制代表了一种全新的方法，该方法旨在直接在需要增强溶细胞活性的细胞中操纵ebag9功能。
26.因此，本发明解决了与关于ebag9和溶细胞活性的现有技术文献相比不同的问题，即本发明寻求改进基于car
‑
t或tcr的细胞疗法，这不仅通过增强细胞的溶细胞活性，而且
通过减少治疗应用所需的细胞数量而改进细胞的制造方法来实现。因此，本发明为这些问题提供了一种独特的解决方案，该解决方案是从现有技术中无法得出的。
27.此外，抗原靶向构建体与细胞毒性t细胞中ebag9抑制的组合导致协同效应。通过将t细胞的溶细胞活性导向感兴趣的靶细胞，可以在局部有效地发挥由ebag9抑制引起的增强的溶细胞活性，从而导致溶细胞作用，该溶细胞作用比预期更大，并且大于通过单独地掺入抗原靶向构建体或ebag9抑制而获得的作用的总和。
28.根据本发明，可以通过多种潜在机制并使用各种分子或化学手段获得ebag9抑制。因此，本文公开的关于ebag9抑制的实施方式是示例性的，并且不旨在作为限制性实施方式。
29.在一些实施方式中，ebag9的抑制优选与对照细胞毒性t细胞，即从相当或相同来源获得的细胞毒性t细胞相比来确定，所述对照细胞毒性t细胞中，ebag9的产生或活性未通过例如本文所述的手段而被改变。
30.在一些实施方式中，ebag9活性的抑制与溶细胞颗粒和/或含颗粒酶的分泌性溶酶体的释放增加有关(优选与对照细胞毒性t细胞相比)。合适的测定在下文呈现并且是技术人员无需过度劳动便已知的，利用该测定可以在两个比较细胞群中评估溶细胞颗粒和/或含颗粒酶的分泌性溶酶体的释放。
31.在一些实施方式中，ebag9抑制的可测量效果是溶细胞颗粒的增强递送。在一些实施方式中，ebag9抑制的可测量效果是抗原特异性car介导的识别之后的靶细胞杀伤增加。技术人员能够使用常规和已建立的测定来确定这些功能效果。
32.一种优选的测定是“体外细胞毒性测定”，该测试中比较了有或没有ebag9抑制的ctl在体外杀死靶细胞的功效。在下面的实例中更详细地介绍了这种体外测定的示例。基于ctl功效确定ebag9抑制的体内方法也是可获得的，并且无需大量工作即可由技术人员进行。
33.在一种实施方式中，用ebag9被抑制的转基因抗原靶向构建体修饰的经分离的t细胞的特征为，当与没有ebag9抑制的溶细胞性t细胞相比时，细胞毒活性增加5％或更多、10％或更多、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或300％或更多。用于定量或半定量测定ebag9被抑制的t细胞中溶细胞活性增加的功能测定对于技术人员是可获得的，本文描述了其一些实例。例如，可以应用用于生成以下图7和图8或如实施例中所述的体外测定，以便确定相对于“未修饰的”t细胞(即没有进行特定修饰以减少/抑制ebag9功能的t细胞)的溶细胞活性的增加。
34.在一些实施方式中，ebag9沉默是通过在t细胞转导中使用的基于mirna的逆转录病毒实现的。在鼠源和人源的几种原代细胞类型中，本发明人已展示>90％范围内的ebag9转录物和蛋白质的沉默。
35.在一些实施方式中，与对照ctl相比，ebag9的抑制实现了10％或更多、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更多的抑制。在某些情况下，例如ebag9缺失或表达例如由于基因组修饰而被破坏，可以实现对ebag9的100％抑制。在一些实施方式中，本发明采用与具有各种tcr或car抗原特异性的逆转录病毒表达构建体组合的靶向鼠或人ebag9的mirna。
36.在优选的实施方式中，如本文所述的遗传修饰的ctl是cd4 和/或cd8 t细胞，优选
地，ctl是cd4 和cd8 t细胞的混合物。这些t细胞群，以及优选包含cd4 和cd8 转化的细胞两者的组合物，针对各种恶性血液病，优选针对本文所述的那些细胞和/或相关医学病症，表现出特别有效的溶细胞活性。
37.在一种优选的实施方式中，遗传修饰的ctl是cd4 和cd8 t细胞，优选地cd4 和cd8 t细胞的比例为1:10至10:1，更优选为5:1至1:5、2:1至1:2或1:1。以所提及的比例，优选以1:1cd4 /cd8 的比例施用表达car的修饰的car
‑
t细胞，在治疗本文所提及的疾病期间产生有益的特性，例如这些比例导致改善的治疗响应和降低的毒性。
38.在一种实施方式中，如本文所述的遗传修饰的t细胞的特征为，转基因抗原靶向构建体是嵌合抗原受体(car)。
39.在一种实施方式中，如本文所述的遗传修饰的t细胞的特征为，转基因抗原靶向构建体是t细胞受体(tcr)。
40.特定类型或形式的抗原靶向构建体不旨在作为本发明的限制特征。本发明的构思基于ebag9抑制介导的溶细胞活性增加。因此，将ctl递送至任何给定靶细胞的具体模式不是本发明的限制方面。因此，本发明ctl的增强活性不依赖于抗原靶向构建体，抗原靶向构建体仅被认为是使ctl接近靶(例如肿瘤)细胞的手段。因此，下文更详细描述的car和tcr构建体代表了其中可以有效利用ebag9抑制作用的优选实施方式。
41.在进一步的实施方式中，要采用的car构建体可以容易地交换，因此允许临床上适用的car的模块化组合。car的抗原特异性是可变的并且不限制本发明。
42.在一种实施方式中，如本文所述的遗传修饰的t细胞的特征为，ebag9活性的抑制通过敲低ebag9而获得，优选通过rna干扰ebag9表达而获得，例如通过小干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)和/或微rna(mirna)而获得。基因敲低是一种减少一种或多种基因表达的技术。在一些实施方式中，ebag9表达的降低可以通过遗传修饰或通过用试剂处理发生，所述试剂例如短dna或rna或其他核酸，即具有与ebag9基因或ebag9的mrna转录物互补的序列的寡核苷酸。
43.用于ebag9抑制(即“沉默”或“敲低”)的rna相互参照方法因其在生物系统中的固有优势的多种原因而是优选的。由于不干扰基因组结构或完整性，rnai技术与操纵基因组相比具有优异的安全性谱。
44.在一些实施方式中，用于靶向ebag9的序列是根据以下的序列：
45.h17(seq id no 1；aaataaccgaaactgggtgat)或
46.h18(seq id no 2；ttaaataaccgaaactgggtg)。
47.其他靶向ebag9中的替代位点的序列是：
48.taaataaccgaaactgggtga(seq id no 55)；
49.taggaatgagaatactgttgc(seq id no 56)；
50.cttaatttccgtcctctgcca(seq id no 57)；
51.tttggtctccacttaatttcc(seq id no 58)；
52.ttcaacatctgtctgcttagg(seq id no 59)；
53.aagtccactcttcaacatctg(seq id no 60)；
54.atcccaggaagtccactcttc(seq id no 61)；
55.tactagagaaacctgtgctcc(seq id no 62)。
56.在一些实施方式中，本发明涉及分离形式的或优选在用于ctl转染的载体中的核酸分子，以及此类分子用于抑制ebag9的用途，所述核酸分子选自：
57.a)包含如下的核苷酸序列的核酸分子：
58.‑
该核苷酸序列包含针对ebag9 rna区域的互补或反义序列，其中所述序列能够干扰ebag9 rna稳定性或功能，或
59.‑
该核苷酸序列包含根据seq id no 1、2或seq id no 55
‑
62的序列或由根据seq id no 1、2或seq id no 55
‑
62的序列组成，
60.b)与根据a)的核苷酸序列互补的核酸分子；
61.c)包含具有足够的序列同一性以与根据a)或b)的核苷酸序列在功能上类似/等价的核苷酸序列，包含与根据a)或b)的核苷酸序列的序列同一性为至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的核苷酸序列；
62.d)根据a)至c)的核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列通过缺失、添加、置换、易位、倒位和/或插入而被修饰并且在功能上类似于/等价于根据a)至c)的核苷酸序列。
63.在一些实施方式中，rnai序列可以设计为靶向本文所述的ebag9转录物中的一种或多种，优选根据seq id no 3
‑
6设计rnai序列。
64.技术人员能够基于靶序列和本领域的常识来设计有效的rna靶向序列。用于此类方法的软件通常是可获得的，技术人员可以使用该软件设计另外的用作shrna的序列以沉默ebag9。例如，可以采用来自赛默飞世尔科技公司(thermo fisher)的程序block
‑
it rnai。也可以识别和使用替代软件。
65.在一些实施方式中，为了产生靶向ebag9的mirna，采用mirna。
66.mirna类似于rna干扰(rnai)途径的小干扰rna(sirna)，不同之处在于mirna源自rna转录物的自身折叠形成短发夹的区域，而sirna源自更长的双链rna区域。
67.在一些实施方式中，可以采用内源性mirna，例如内源性mirna
‑
155。可以将ebag9序列特异性靶向序列(例如h17和h18的反义序列)插入内源性mirna中，即包含21个核苷酸的发夹结构内。
68.在一些实施方式中，ebag9敲低可以通过采用用于mirna的表达载体来实现。mirna基因通常由rna聚合酶ii(pol ii)转录，从而可以选择合适的用于表达载体的启动子。聚合酶通常与见于dna序列附近的启动子结合，该dna序列所编码的将成为pre
‑
mirna的发夹环。对得到的转录物在5'端用特殊修饰的核苷酸加帽，用多个腺苷聚腺苷酸化，并可能进行剪接。然后，成熟的mirna成为活性rna诱导的沉默复合体(risc)的一部分，该沉默复合体包含dicer酶和许多相关蛋白。然后可以通过ebag9 mrna降解或阻止ebag9 mrna翻译来发生基因沉默。
69.在一些实施方式中，为了产生靶向ebag9的mirna，采用短干扰sirna。
70.sirna采用例如包含与ebag9编码mrna的区域互补的序列的短(10
‑
50bp，优选20
‑
25bp)双链或发夹rna分子。
71.在一些实施方式中，采用针对seq id no 3、4、5或6中任一个的区域的sirna或mirna来实现ebag9抑制。sirna或mirna(即靶向区域)可以是10
‑
50个核苷酸，优选15
‑
40个核苷酸，更优选18
‑
30个核苷酸，更优选20
‑
25个核苷酸，并且表现出与seq id no 3、4、5或6的转录物的足够的序列互补性以诱导ebag9表达相对于相关对照减少。在一些实施方式中，
短发夹rna和靶mrna之间的互补性可以是50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、或优选100％。优选类似于序列同一性地计算互补性，其中在序列的整个长度(例如对于短干扰rna的长度)上确定互补核苷酸/相同核苷酸的总数。
72.在一些实施方式中，ebag9敲低可以通过采用用于sirna的表达载体来实现。修饰sirna序列以在两条链之间引入短环。由此得到的转录物是短发夹rna(shrna)，它可以被dicer酶以通常的方式加工为功能性sirna。在ebag9待敲低的t细胞中表达sirna的典型转录盒使用rna聚合酶iii启动子(例如u6或h1)来指导小核rna(snrna)的转录(u6参与基因剪接；h1是人rna酶p的rna酶组件)。
73.技术人员无需过度劳动便能够产生有效减少或抑制ebag9产生的进一步的rna干扰构建体。
74.在一种实施方式中，如本文所述的遗传修饰的t细胞的特征为，ebag9活性的抑制是通过用外源核酸分子对t细胞基因组进行遗传修饰而获得的，所述外源核酸分子优选包含编码转基因抗原靶向构建体和用于敲低ebag9的rna干扰序列的载体。
75.在一些实施方式中，采用病毒载体，优选采用逆转录病毒转移和慢病毒转移。
76.在一些实施方式中，转座子可用作编码转基因抗原靶向构建体的载体。
77.病毒载体与多种优势相关，例如它们被监管机构接受，它们显示出良好的技术优势例如可靠的细胞修饰，并且它们具有可容忍的风险状况。
78.在一些实施方式中，本发明的ctl采用mp71载体，所述mp71载体优选与γ逆转录病毒表达系统组合。
79.在这种组合中，可以实现异常高的t细胞转导率。由于car构建体和mirna的模块化设计，转导系统是可变的，这意味着可替代地采用慢病毒和转座子。
80.在一些实施方式中，本发明的ctl采用逆转录病毒sin载体(例如可从biontech、idar
‑
oberstein获得)，所述逆转录病毒sin载体优选与γ逆转录病毒表达系统组合。
81.本发明的这些实施方式因此是进一步有利的，因为由于逆转录病毒、慢病毒或转座子介导的tcr或car(任何抗原特异性的)转移，一步操作受体t细胞足以抑制ebag9活性或表达.
82.在一种实施方式中，如本文所述的遗传修饰的t细胞的特征为，ebag9活性的抑制是通过破坏ebag9基因的表达和/或序列来对t细胞基因组进行遗传修饰而获得的。设想了导致功能丧失的ebag9缺失或部分缺失。
83.如下文更详细描述的，可以采用crispr/cas9或talen技术，或其他遗传工程工具。本技术的实施例证明了，多种靶向ebag9外显子4的引导rna与cas9蛋白一起能够实现良好的ebag9敲除效率。在一种实施方式中，crispr/cas9介导的eba9抑制靶向ebag9基因的外显子4，但不限于此。该实施方式代表了ebag9内用于crispr介导的敲除的可实现但非限制性的优选靶标；适用于crispr介导的对ebag9基因进行工程化的替代靶标是技术人员无需过度劳动便已知或者可评估的。
84.在其他实施方式中，基因工程工具(例如定点诱变或基于重组的基因靶向)是技术人员已知的并且也可以采用。然而，遗传(基因组)操作通常需要2次或数次转染或转导，目前其效率低于病毒转移。
85.在一些实施方式中，可以采用转移car或tcr并在第二步转移靶向ebag9的遗传信息来引入必要的遗传修饰。在一些实施方式中，可以采用转移靶向ebag9的遗传信息并在第二步转移car或tcr来引入必要的遗传修饰。在一些实施方式中，修饰在相同的载体或外源核酸分子中或在不同的载体或外源核酸分子中同时进行。
86.在一些实施方式中，编码转基因抗原靶向构建体的外源核酸分子位于ebag9基因内、邻近ebag9基因或与ebag9基因关联的t细胞基因组中，从而破坏所述ebag9基因的表达和/或序列。
87.在一些实施方式中，car序列可以被直接整合到ebag9基因座中，从而阻止ebag9基因表达。
88.用于破坏ebag9基因序列或mrna的各种替代策略对于技术人员来说是可获得的，并且无需过度劳动即可建立。因此，本文公开的ebag9抑制的优选模式是示例性的而不意图是限制性的。
89.在另一方面，本发明因此涉及根据前述权利要求中任一项所述的遗传修饰的t细胞作为药物的用途。考虑到由ebag9抑制定义的新型t细胞，预期了任何给定的医学用途。技术人员能够鉴别可以使用car
‑
t或tcr t细胞治疗的医学病症，并且可以相应地设计修饰的t细胞。在优选的实施方式中，医药用途是增殖性疾病或自身免疫疾病。
90.在另一方面，本发明涉及如本文所述的遗传修饰的t细胞作为治疗增殖性疾病的药物的用途，其中由转基因抗原靶向构建体所靶向的抗原在经历病理性细胞增殖和/或与病理性细胞增殖有关的靶细胞中表达。因此，本发明包括相应的治疗方法，即向有需要的受试者施用治疗有效量的如本文所述的ctl。
91.在一种实施方式中，增殖性疾病是恶性血液病，并且其中由转基因抗原靶向构建体靶向的抗原在所述恶性血液病的癌细胞中表达，所述抗原例如为肿瘤相关抗原(taa)或肿瘤特异性抗原(tsa)。
92.恶性血液病的非限制性实例是非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病和/或多发性骨髓瘤。下面提供了另外的示例。
93.在一些实施方式中，由抗原特异性构建体靶向的抗原是肿瘤相关抗原(taa)。taa与主要或优选在肿瘤细胞中表达的抗原有关，但通常这些抗原并非排他地在此类细胞中表达。cd19属于这个定义，因为它可以发生在转化的和良性的b细胞上。bcma也在正常浆细胞和转化的细胞(如多发性骨髓瘤细胞)上表达。
94.在一些实施方式中，待治疗的恶性血液病是表达cd19的b细胞癌，并且其中转基因抗原靶向构建体结合cd19。
95.针对cd19的抗体可用于开发用于car构建体的抗原靶向构建体，所述car构建体靶向表达cd19的细胞。在一些实施方式中，转基因抗原靶向构建体包含从结合cd19的抗体中获得的氨基酸序列(抗原结合域)。cd19抗体包括但不限于博纳吐单抗、雷星
‑
考妥昔单抗(coltuximabravtansine)、mor208、medi
‑
551、玛汀
‑
地宁妥珠单抗(denintuzumabmafodotin)、b4、来自merck的di
‑
b4、帕他莫单抗(taplitumomabpaptox)、xmab 5871、mdx
‑
1342或afm11。
96.本领域描述了多种靶向cd19的car构建体。ebag9沉默原则上可以应用于任何一种或多种此类car
‑
t细胞疗法。临床研究中的已知cd19 car
‑
t细胞是包含具有fmc63或sj25c1
的scfv的抗原结合结构域的car，但不限于此。如park等人(blood,2016,127:3312
‑
3320)所综述的，具有4
‑
1bb或cd28共刺激域的car构建体是已知的。临床研究中的car
‑
t细胞是但不限于：novartis的tisagenlecleucel、gilead sciences的axicabtagene ciloleucel、juno therapeutics的jcar015和jcar017、ziopharm oncology的car cd19、cellectis的ucart19、allogene的allo
‑
501、bellicum制药公司的bpx
‑
401，博生吉医药科技(苏州)有限公司(persongen biomedicine suzhou)的pcar
‑
019，precision biosciences的pbcar
‑
0191，河北森朗生物科技有限公司(hebei senlang biotechnology)的senl
‑
001，uwell生物制药公司的uwc
‑
19。
97.在一些实施方式中，待治疗的恶性血液病是表达bcma的b细胞癌，并且其中转基因抗原靶向构建体结合bcma。
98.针对bcma的抗体可用于开发用于car构建体的抗原靶向构建体，所述car构建体靶向表达bcma的细胞。在一些实施方式中，转基因抗原靶向构建体包含从结合bcma的抗体中获得的氨基酸序列(抗原结合域)。bcma抗体包括但不限于：本文所述的那些，以及抗体
‑
药物缀合物gsk2857916、hdp
‑
101或medi2228中或双特异性抗体em801、ab
‑
957、afm26或tnb383b中采用的抗体。
99.本领域描述了多种靶向bcma的car构建体。ebag9沉默原则上可以应用于任何一种或多种此类car
‑
t细胞疗法。如cho等人(front immunol.2018；9:1821)所综述的，临床研究中的已知bcma car
‑
t细胞是但不限于：bluebird bio的bb2121、南京传奇生物科技有限公司(nanjing legend biotech)的lcar
‑
b38m、novartis的cart
‑
bcma、kite pharma的kite
‑
585和pfizer/cellectis sa的bcma car、poseida therapeutics的p
‑
bcma
‑
101、tenebrioas的fhvh74
‑
cd828z、fhvh32
‑
cd828z、fhvh33
‑
cd828z、fhvh93
‑
cd828z、cartesian therapeutics的descartes
‑
08、poseida therapeutics的p
‑
bcma
‑
allo1和juno的egfrt/bcma
‑
41bbz。
100.在一些实施方式中，待治疗的恶性血液病是表达cxcr5的癌症，并且其中转基因抗原靶向构建体结合cxcr5。
101.能够由抗原特异性构建体(例如car或tcr构建体)靶向的其他肿瘤相关抗原可以选自以下的那些：
102.car
‑
t或tcr抗原可以选自用于开发car构建体并且在临床或临床前测试中的那些抗原，包括恶性血液病相关的taa，例如cd30、cd20、cd22、ror1、cd138、cd70、ley、cd123、cd16v、cd123、cd33、igκ、igλ、il
‑
1rap、nkg2d配体、muc1、gpc3、epcam、cd38、cd5、il
‑
13rα2、cd133或cs1(cd319)，但不限于此。
103.也可以靶向来自实体恶性肿瘤的taa，包括但不限于gpc3、her2、gd2、egfr变体iii(egfr viii)、egfr、cea、psma、frα、epcam、muc1、ror1、muci16eto、vegfr2、cd171、psca和epha2、fap、caix、c
‑
met、cd171、l1
‑
cam、间皮素、muc1、pd
‑
l1。
104.包括mart
‑
1、mage
‑
a1、mage
‑
a3、mage
‑
a4、gp100、cea、til 1383i、p53、hpv
‑
16e6、hpv
‑
16e7和hbv，的其他肿瘤相关抗原(taa)也可以被选择作为tcr
‑
t或car靶标。
105.mo等人(癌症期刊,2017；8(9):1690
‑
1703)、hartmann等人(embo分子医学,2017；9(9):1183
‑
1197)和townsend等人(实验和临床癌症研究期刊,2018,37:163)公开了已发表的嵌合抗原受体t细胞(car
‑
t)和tcr转导t细胞(tcr
‑
t)的临床试验的详细总结。
106.尽管血癌(恶性血液病)似乎更适合t细胞疗法，但也可以治疗实体瘤，正如正在进行的研究car
‑
t或tcr
‑
t细胞对实体瘤疾病的溶细胞作用的多项临床试验所证明的那样。
107.例如，对于肺癌，候选taa可能包含间皮素、egfr、muc1、rori、cea、wt1、ny
‑
eso
‑
1或mage
‑
a3/4。
108.也可以采用基于针对上述抗原中两种或更多种的抗原靶向构建体的组合方法，例如通过使用一种或多种靶向cd19和cd20的靶向构建体来进行。
109.此外，通过靶向胶质母细胞瘤上的异质表达抗原人表皮生长因子受体2(her2)和il13rα2，在胶质母细胞瘤中进行过继串联car
‑
t疗法似乎有效。
110.不仅一种靶向的癌症中表达的肿瘤类型特异性和多样化的taa，而且一种taa也在多种癌症中表达。也可以靶向这些taa。例如，ny
‑
eso
‑
1在黑色素瘤、多发性骨髓瘤、nsclc、滑膜肉瘤、乳腺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、食管癌、卵巢癌和膀胱癌中高表达。类似地，间皮素在间皮瘤和乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌和子宫内膜癌中高表达。
111.上述抗原的缩写：pd
‑
1：程序性死亡受体
‑
1；nsclc：非小细胞肺癌；hla：组织相容性白细胞抗原；ror1：酪氨酸激酶样孤儿受体1；bcma：b细胞成熟抗原；ley：lewis(le)
‑
y；gpc3：磷脂酰肌醇聚糖
‑
3；her2：人表皮生长因子受体
‑
2；gd2：肿瘤相关神经节苷脂gd2；egfr：表皮生长因子受体；cea：癌胚抗原；psma：前列腺特异性膜抗原；frα：叶酸受体
‑
α；epcam：上皮细胞粘附分子；muc1：粘蛋白1；vegfr2：血管内皮生长因子受体
‑
2；psca：前列腺干细胞抗原；epha2：产生促红细胞生成素的肝细胞癌a2；hpv：人乳头瘤病毒；mage：黑色素瘤相关抗原编码基因；tnf
‑
α：肿瘤坏死因子
‑
α。
112.本文描述的具体taa具有示例性性质，并且代表本发明的优选非限制性实施方式。ebag9抑制的发明构思可以应用于任何给定的修饰的t细胞，而无论t细胞的抗原特异性如何。
113.在另一方面，本发明涉及一种适用于治疗增殖性疾病的药物组合物，其包含如本文所述的遗传修饰的t细胞，另外还包含药学上可接受的载体。
114.在另一方面，本发明涉及一种核酸载体或核酸载体的组合，所述核酸载体或核酸载体的组合包含编码抗原靶向构建体和用于敲低雌激素受体结合片段相关抗原9(ebag9)的rna干扰序列的序列。
115.在另一方面，本发明涉及一种用于增加遗传修饰的细胞毒性t细胞的溶细胞活性的体外方法，所述t细胞包含一种或多种编码转基因抗原靶向构建体的外源核酸分子，该方法包括抑制所述t细胞中雌激素受体结合片段相关抗原9(ebag9)的活性。
116.在另一方面，本发明涉及体外方法的产物，即一组用ebag9被抑制的转基因抗原靶向构建体修饰的分离的t细胞。
117.在一种实施方式中，通过本发明的方法产生的用ebag9被抑制的转基因抗原靶向构建体修饰的分离的t细胞的特征为，与对照ctl相比，ebag9被抑制10％或更多、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更多。在某些情况下，例如ebag9缺失或表达由于例如基因组修饰而被破坏，可以实现对ebag9的100％抑制。
118.在一种实施方式中，通过本发明的方法产生的用ebag9被抑制的转基因抗原靶向构建体修饰的分离的t细胞的特征为，当与没有ebag9抑制的溶细胞性t细胞相比时，细胞毒活性增加5％或更多、10％或更多、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、
150％、200％或300％或更多。用于定量或半定量测定ebag9被抑制的t细胞中溶细胞活性增加的功能测定对于技术人员是可获得的，本文描述了其一些实例。例如，可以应用用于生成以下图7和图8或如实施例中所述的体外测定，以便确定相对于“未修饰的”t细胞(即没有进行特定修饰以减少/抑制ebag9功能的t细胞)的溶细胞活性的增加。在一些实施方式中，该测定可用于确定本发明的方法是否已经实施，即确定ebag9功能的任何降低。
119.用于增加细胞的溶细胞活性的体外方法代表了本发明的重要方面，因为t细胞治疗剂通常需要在施用于患者之前进行体外处理。在典型的过继t细胞疗法(att)中，从患者身上分离出t细胞，然后进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)。在此制备过程中，可以进一步修饰ctl以增加其溶细胞活性。
120.因此，本发明能够使得在制备细胞的过程中在不增加额外负担或难度的情况下增强细胞治疗剂的功效的方法称为可能。因此，用于治疗应用的t细胞在制备过程中不会受到过度压力，因为在一些实施方式中，ebag9抑制可以在用抗原靶向构建体修饰ctl的相同遗传修饰步骤中实现。
121.在一些实施方式中，本文所述的体外方法的特征为，抑制ebag9活性包括敲低ebag9，优选通过rna干扰ebag9表达来进行，例如通过小干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)和/或微rna(mirna)来进行。
122.在一些实施方式中，本文所述的体外方法的特征为，抑制ebag9活性包括通过破坏ebag9基因的表达和/或序列，优选地通过crispr/cas9或talen来对t细胞基因组进行遗传修饰。
123.在本发明的其他实施方式中，可以采用crispr/cas和talen介导的car或tcr编码核酸的插入。技术人员已知的适应于细菌中天然存在的过程的crispr/cas可用于精确有效地编辑dna，以将合适的编码序列插入感兴趣的免疫细胞，优选t细胞中。cas9是充当分子对剪刀的一种蛋白质，可通过相关的rna分子(引导rna)引导至特定的dna序列。当cas9到达其在dna上的靶标位置时，它有助于本地遗传密码的变化，从而影响该基因的功能。crispr/cas9可以将car或tcr基因递送到t细胞基因组内的非常特定的位点，这可以降低基因插入在错误或不期望的位置处的风险。
124.如上所提及的，本技术的实例证实了，多种靶向ebag9外显子4的引导rna与cas9蛋白一起能够实现良好的ebag9敲除效率。在增强细胞治疗剂功效的方法的一种实施方式中，采用crispr/cas9介导的eba9抑制，这种抑制优选靶向ebag9基因的外显子4。该实施方式代表了ebag9内用于crispr介导的敲除的可实现但非限制性的优选靶标；适用于crispr介导的对ebag9基因工程化的替代靶标是技术人员无需过度劳动便已知或者可评估的。
125.本发明进一步涉及治疗本文所述的医学病症的方法，通常包括向需要所述治疗的患者施用治疗有效量的修饰的ctl。
126.在一些实施方式中，由于ctl的活性增加，本文所述的治疗可以在新的或独特的患者组中进行。例如，在优选实施方式中，本文所述的ctl适用于治疗不符合其他疗法条件的患者。更具体地，本发明的实施方式涉及以下患者集的治疗：
127.i)具有多药耐药性的患者，
128.ii)不符合同种异体干细胞移植条件的患者，
129.iii)具有无法进行进一步的化学疗法的合并症的患者，
130.iv)不耐受化学疗法的老年患者，
131.v)甚至在进行性疾病和多种其他标准护理疗法失败后，ctl也适用于抢救疗法，
132.vi)甚至适用于抗体可能失效的在靶肿瘤细胞上的抗原密度低的情况，和/或
133.vii)适用于作为对抗体来说并非如此的单一疗法。
134.此外，特异性靶向b细胞和/或浆细胞的能力对于治疗自身免疫疾病将大有裨益。轻度形式的自身免疫疾病通常最初会使用非甾体类抗炎药(nsaid)或缓解疾病抗风湿药(dmard)进行治疗。系统性红斑狼疮(sle)的更严重形式，包括由于活动性疾病引起的器官功能障碍，通常用类固醇结合强力免疫抑制剂(例如环磷酰胺，一种靶向循环细胞的细胞毒性剂)进行治疗。
135.最近，car
‑
t细胞也被讨论作为治疗自身抗体介导的疾病的靶向方法(ellebrecht等人(2016)科学353:179
‑
184)。存在于骨髓中的存活生态位(survival niches)中的长寿的固着浆细胞通常对传统的免疫抑制和细胞毒性药物以及靶向b细胞及其活化的疗法具有抗性。可以通过使用car
‑
t细胞构建体，尤其是那些具有ebag9抑制的car
‑
t细胞构建体来应对这一治疗挑战。
136.因此，本发明进一步涉及如本文所述的遗传修饰的t细胞作为治疗自身免疫疾病的药物的用途。
137.在另一方面，本发明因此涉及如本文所述的遗传修饰的t细胞作为治疗自身抗体依赖性自身免疫疾病的药物的用途，其中由转基因抗原靶向构建体所靶向的抗原在与自身抗体产生相关的靶细胞中表达，优选其中医学疾病是系统性红斑狼疮(sle)或类风湿性关节炎。下文提供了自身免疫相关疾病的另外的实施方式。技术人员能够为本发明的t细胞的抗原靶向构建体选择合适的靶抗原。一种靶向产生自身抗体的浆细胞的相关抗原是bcma。
138.本说明书和本文的实施例提供的治疗癌细胞的技术指导也延伸到自身免疫疾病的治疗。通过选择合适的要被工程化t细胞的抗原特异性靶向构建体靶向的抗原，可以有效地靶向自身反应性b细胞。ebag9在工程化t细胞中的表达是主要关注点；ebag9的表达/活性被降低/抑制，因此增强了t细胞不依赖于靶细胞中的ebag9表达的细胞毒性。因此，任何给定的靶细胞都可以被工程化t细胞攻击，所述工程化t细胞由于ebag9抑制而具有增强的细胞毒性。
139.关于修饰的t细胞、其作为药物的用途、关于载体的相关实施方式、药物组合物和体外方法的特征由修饰的溶细胞性t细胞的新构思进行了统一，包含ebag9被抑制的抗原特异性靶向构建体。本文公开的关于修饰的t细胞、其作为药物的用途、关于载体的相关实施方式、药物组合物和体外方法的特征被认为是在替代的发明方面的上下文中公开的，从而使得细胞的特征也可以用来描述例如本文公开的方法或组合物，反之亦然。
140.关于嵌合抗原受体构建体和car t细胞的实施方式：
141.在一种实施方式中，本发明涉及包含嵌合抗原受体多肽(car)的如本文所述的ctl，所述car包含：
142.‑
胞外抗原结合域，包含结合靶抗原的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含单链抗体片段的vh和vl域，其中优选地，接头多肽位于vh和vl域之间，其中所述接头优选被构造为不干扰抗体片段
‑
抗原相互作用；
143.‑
间隔区多肽(也称为铰链)，位于胞外抗原结合域和跨膜域之间，其中所述间隔区
多肽优选构造为当所述car在表达所述car的t细胞中表达时不干扰抗体片段
‑
抗原相互作用和/或t细胞活化；
144.‑
跨膜域，其中所述跨膜域优选被构造为当所述car在表达所述car的t细胞中表达时不干扰抗体片段
‑
抗原相互作用和/或t细胞活化；
145.‑
和胞内域，其中所述胞内域包含共刺激域和信号传导域，其中所述胞内域优选被构造为例如通过增加细胞因子产生和/或促进t细胞复制而与抗原靶标结合时提供信号以刺激t细胞活化，从而导致细胞毒性作用。
146.因此，本发明的car可以采用各种形式，包括用于本文所述的每个功能域的可能不同的蛋白质序列。技术人员可以例如基于以下实施例中证明的实验方法来选择和测试car的期望功能。因此，本领域技术人员可以使用常规方法来评估在本文讨论的任何功能域中选择待用于本发明的car的任何给定的特定蛋白质序列的功能功效。例如，可以使用各种位于vh和vl域之间的接头多肽序列、各种位于胞外抗原结合域和跨膜域之间的间隔区多肽序列(也称为铰链)、各种跨膜域和优选包含共刺激域和信号传导域的各种胞内域。也可以串联使用各种共刺激域(例如cd28 4
‑
1bb)。
147.在本发明的实施方式中，car以及本文提及的每个元件或域被构造为，不有害地干扰抗体片段
‑
抗原相互作用，当所述car在表达所述car的t细胞中表达时不有害地干扰t细胞活化，并且在与靶标结合时不有害地干扰car提供信号来刺激t细胞活化。在优选的实施方式中，选择car的元件以不干扰ebag9抑制和溶细胞活性的伴随增加。
148.与car的抗原结合域有关的实施方式：
149.作为非限制性实例提供的car的抗原结合域可以针对bcma、cxcr5或cd19。在其他实施方式中，可以基于被认为是恶性细胞的靶标的任何给定的期望抗原来选择抗原结合片段。cxcr5和bcma car的几个特定非限制性的实施方式描述如下，这些实施方式已经由发明人评估并且显示与ebag9抑制组合存在于t细胞中时表现出增强的溶细胞活性。
150.cxcr5特异性抗原结合域：
151.在一种实施方式中，本发明的ctl包含如本文所述的cxcr5特异性嵌合抗原受体(car)多肽，其中抗原结合域包含：
152.‑
根据seq id no 7(gftfstsg)的h
‑
cdr1，
153.‑
根据seq id no 8(issssgfv)的h
‑
cdr2，
154.‑
根据seq id no 9(arseaaf)的h
‑
cdr3，
155.‑
根据seq id no 10(ksrlsrmgitp)的l
‑
cdr1，
156.‑
根据包含rms或由rms组成的序列的l
‑
cdr2，和
157.‑
根据seq id no 11(aqfleyppt)的l
‑
cdr3。
158.在一种实施方式中，cxcr5特异性car多肽包含：
159.‑
vh域，其与seq id no 12(evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfstsgmnwfrqapgkglewvsyissssgfvyadsvkgrftisrdnaqnslylqmnslraedtavyycarseaafwgqgtlvtvss)具有至少80％序列同一性，
160.‑
或与seq id no 13(evqlvesggglvqpgkslklscsasgftfstsgmhwfrqapgkgldwvayissssgfvyadavkgrftisrdnaqntlylqlnslksedtaiyycarseaafwgqgtlvtvss)具有至少80％序列同一性；
161.‑
以及vl域，其与seq id no 14(divltqsprslpvtpgepasiscrssksrlsrmgitplnwylqkpgqspqlliyrmsnrasgvpdrfsgsgsgtdftlkiskvetedvgvyycaqfleypptfgsgtkleik)具有至少80％序列同一性，
162.‑
或与seq id no 15(divltqaprsvsvtpgesasiscrsnksrlsrmgitplnwylqkpgkspqlliyrmsnlasgvpdrfsgsgsetdftlkiskvetedvgvyycaqfleypptfgsgtkleik)具有至少80％序列同一性。
163.bcma特异性抗原结合域：
164.在一种实施方式中，本发明的ctl包含如本文所述的bcma特异性嵌合抗原受体(car)多肽，其中抗原结合域包含：
165.‑
h
‑
cdr1:gftfsryw(seq id no.16)，
166.‑
h
‑
cdr2:inpsssti(seq id no.17)，
167.‑
h
‑
cdr3:aslyydygdaydy(seq id no.18)，
168.‑
l
‑
cdr1:qsvesn(seq id no.19)，
169.‑
l
‑
cdr2:sas，和
170.‑
l
‑
cdr3:qqynnyplt(seq id no.20)。
171.或其中抗原结合域包含：
172.‑
h
‑
cdr1:rywfs(seq id no.21)，
173.‑
h
‑
cdr2:einpssstinyapslkdk(seq id no.22)，
174.‑
h
‑
cdr3:slyydygdaydyw(seq id no.23)，
175.‑
l
‑
cdr1:kasqsvesnva(seq id no.24)，
176.‑
l
‑
cdr2:saslrfs(seq id no.25)，和
177.‑
l
‑
cdr3:qqynnypltfg(seq id no.26)，
178.在一种实施方式中，bcma5特异性car多肽包含：vh域，其与以下序列具有至少80％的序列同一性：
179.seq id no 27(evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsrywfswvrqapgkglvwvgeinpssstinyapslkdkftisrdnakntlylqmnslraedtavyycaslyydygdaydywgqgtlvtvss)；
180.以及vl域，其与seq id no 28(eivmtqspatlsvspgeratlsckasqsvesnvawyqqkpgqapraliysaslrfsgiparfsgsgsgteftltisslqsedfavyycqqynnypltfgagtklelk)具有至少80％序列同一性，
181.与接头、间隔区、跨膜域和信号传导域相关的实施方式：
182.以下针对实施例中采用的特定非抗原特异性car域呈现了几种实施方式。
183.在其他实施方式中，本发明涉及包含嵌合抗原受体(car)多肽的如本文所述的ctl，所述car多肽包含一个或多个接头、间隔区、跨膜域和信号传导域。
184.在一种实施方式中，car包含胞内域，所述胞内域包含一个或两个共刺激域和信号传导(活化)域。
185.在一种实施方式中，car包含具有位于vh和vl域之间的接头多肽的胞外抗原结合域，其中所述接头优选选自：
186.‑
惠特洛(whitlow)(seq id no 29：gstsgsgkpgsgegstkg)，或
187.‑
gly
‑
ser(seq id no 30：ssggggsggggsggggs)接头，或
188.‑
与seq id no 29或30具有至少80％的序列同一性的接头。
189.在一种实施方式中，car还包含位于胞外抗原结合域和跨膜域之间的间隔区多肽，其中所述间隔区选自：
190.‑
igg1间隔区(seq id no 31：paepkspdkthtcppcpappvagpsvflfppkpkdtlmiartpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkkdpk)，
191.‑
igg1δ间隔区(seq id no 32：paepkspdkthtcppcpappvagpsvflfppkpkdtlmiartpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslsslspgkk)，
192.‑
igg4(hi
‑
ch2
‑
ch3)间隔区(seq id no 33：eskygppcppcpapefeggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk)，
193.‑
igg4(hi
‑
ch3)间隔区(seq id no 34：eskygppcppcpgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk)，
194.‑
igg4(hi)间隔区(seq id no 35：eskygppcppcp)，或
195.‑
与seq id no 31至35中的任一个具有至少80％的序列同一性的间隔区。
196.在一种实施方式中，跨膜域选自：
197.‑
cd8α域(seq id no 36：iyiwaplagtcgvlllslvitlyc)或
198.‑
cd28域(seq id no 37：fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv)，或
199.‑
与seq id no 36或37具有至少80％的序列同一性的跨膜域。
200.在一种实施方式中，胞内域包括：
201.‑
共刺激域，其选自4
‑
1bb共刺激域(seq id no 38：krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel)，和/或
202.‑
cd28共刺激域(seq id no 39：rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsl)，或
203.‑
同时包含相邻排列的4
‑
1bb(seq id no 38)和cd28共刺激域(seq id no 39)的共刺激域，或
204.‑
与seq id no 38或39具有至少80％的序列同一性的共刺激域。
205.在一种实施方式中，car另外包含信号传导域(也称为活化域)，其中所述信号传导域是
206.‑
cd3ζ(4
‑
1bb或cd28)信号传导域(seq id no 24：lrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr)，或
207.‑
与seq id no 40具有至少80％的序列同一性的信号传导域。
208.本发明进一步涉及用于本发明的ctl的(分离的)核酸分子，所述核酸分子优选以
载体，例如病毒载体或转座子载体，优选γ逆转录病毒载体的形式，并选自由以下组成的组：
209.a)包含如下的核苷酸序列的核酸分子
210.‑
该核苷酸序列编码根据本文所述的car的任何实施方式的嵌合抗原受体(car)多肽，
211.‑
该核苷酸序列编码胞外抗原结合域、前导区、跨膜域、间隔区、接头或胞内域，优选根据seq id no 7
‑
41，或
212.‑
该核苷酸序列编码前导区、跨膜域、间隔区、接头或胞内域，该核酸序列包含seq id no 43
‑
54中的一个或多个或由seq id no 43
‑
54中的一个或多个组成，
213.b)与根据a)的核苷酸序列互补的核酸分子；
214.c)包含以下核苷酸序列的核酸分子，该核苷酸序列具有足够序列同一性以与根据a)或b)的核苷酸序列在功能上类似/等价；包含与根据a)或b)的核苷酸序列的序列同一性为至少80％、优选90％或95％的核苷酸序列的核酸分子，其中功能上类似涉及形成car构建体，并且当相应的t细胞表达所述构建体时，car
‑
t细胞产物赋予t细胞细胞毒活性；和/或
215.d)由于遗传密码而简并为根据a)至c)的核苷酸序列的核酸分子。
216.信号传导域的交换满足了对强而快速的效应阶段(cd28共刺激域)或由t细胞记忆群保证的长期复发控制(4
‑
1bb信号域)的需求。各种信号传导域可以以多种构型交换，从而在其设计方面为car提供了灵活性，而没有丧失有利的结合特性。
217.在优选的实施方式中，与mp71
‑
载体和γ
‑
逆转录病毒表达系统结合，可以实现对人t细胞的异常高的转导率。转导系统由于tcr或car构建体的模块化设计而可变，这意味着慢病毒以及转座子均可使用，这取决于技术人员在实施本发明时的需要和偏好。用于tcr、car和ebag9抑制的遗传信息/核酸分子的转移还包括crispr/cas和talen介导的插入到ctl。
218.本发明涵盖将用于tcr、car和ebag9抑制的遗传信息/核酸分子转移到表达所述car的细胞中的所有合适方法，本领域技术人员在实施本发明时可以选择合适的方法。例如，多种转化t细胞的方法是本领域已知的，包括任何给定的基于病毒的基因转移方法(例如基于修饰的逆转录病毒科的方法)以及非病毒方法(例如基于dna的转座子、游离型cdna载体和通过电穿孔直接转移mrna的方法)。
219.另外，可以以简单的三步克隆程序交换car构建体的信号传导组件，该三步克隆程序允许临床上可应用的car的模块化组成和由技术人员进行定制化构建。
220.本发明的另一方面涉及包含本文所述的核酸分子的载体，所述载体优选为病毒载体，更优选为γ逆转录病毒载体。在本发明的另一方面，本发明涉及编码并且优选能够表达本发明的tcr、car和ebag9抑制的转座子载体，所述转座子载体优选为睡美人载体。
221.在优选的实施方式中，使用“睡美人”转座子系统，特别是睡眠美人转座酶，用如本文所述的核酸对旨在施用以治疗本文提及的疾病的ctl进行遗传修饰，所述核酸编码并表达如本文所述的tcr、car和ebag9沉默分子，例如mirna。在本发明的上下文中，出于修饰免疫细胞以表达本文所述的car或tcr的目的，睡美人转座子系统是设计用于将精确定义的dna序列引入脊椎动物染色体中的合成dna转座子。睡美人转座子结合了病毒和裸露dna的优势。已根据病毒在新宿主细胞中感染和复制的能力对病毒进行了进化选择。同时，细胞已
经进化出主要的分子防御机制来保护自己免受病毒感染。出于社会和法规方面的原因，避免使用病毒也很重要。因此，使用非病毒载体，例如睡美人系统，可以避免细胞对抗载体使用的许多但不是全部防御。由于这个原因，睡美人系统能够对免疫细胞进行特别有效和安全的遗传修饰，以便施用于患者。
222.本发明优选的氨基酸和核苷酸序列：
223.224.225.226.227.228.229.230.231.232.具体实施方式
233.引用的所有文件及其美国对应文件均通过引用并入本文。
234.本发明涉及工程化t细胞，所述工程化t细胞通过抑制ebag功能而被修饰，从而增强细胞的溶细胞活性。增强tcr
‑
t细胞或配备有car的t细胞的功能亲合力将导致更高的溶细胞能力，从而提高对抗肿瘤的效率。如本文所述，具有与赋予更高溶细胞能力的修饰t细胞(工程化t细胞)相关的特别的优势。
235.在许多情况下，肿瘤患者先前已经接受了几种治疗方案，导致强烈的骨髓抑制，随后导致低效率地动员外周淋巴细胞作为离体培养和转导的起始材料。这个过程被称为自体移植。为少量t细胞赋予增强的溶细胞能力有助于绕过定量问题，因为在单个细胞基础上，工程化t细胞的表现要强得多。换句话说，t细胞工程化改进并促进了制造过程。
236.制造过程的另一个方面是离体扩增阶段的持续时间。如果t细胞被赋予了更高的
溶细胞能力，则可以更早地终止体外扩增，从而降低生产成本，更早地获得治疗，并减少分化的t细胞群。后一方面很重要，因为来自体外培养的t细胞的分化状态越高，它们在体内的持久性就越短。
237.在同种异体骨髓移植中，一个严重的风险因素是移植物抗宿主病(gvhd)的发展。这种疾病或综合征与移植的t细胞的数量密切相关。赋予t细胞更高的溶细胞能力可减轻对更高t细胞数量的需求，因此，少量工程化t细胞可提供相同的治疗效率而不介导gvhd。
238.工程化t细胞的活化和效应功能的阈值水平较低。因此，包括新抗原、自身抗原和次要组织相容性抗原在内的弱肿瘤抗原，甚至少量所显示的抗原已经可以触发从仅携带tcr或配备有car的工程化t细胞释放效应分子。
239.为了防止肿瘤复发，在第一轮肿瘤根除后产生记忆t细胞具有很大的优势。然而，一些肿瘤细胞可能会逃避t细胞攻击，并且最终开始随后的增殖。然而，发明人已经表明，溶细胞能力与抗原特异性记忆t细胞的形成相关。提高att的抗肿瘤作用，而不会导致可能因诱导炎症而有害的更多细胞因子的释放。
240.考虑到上述情况，本发明人提出了基于ebag9抑制来提高t细胞溶细胞活性的新手段，在下文更详细地进行描述。提供以下术语和定义是为了更清楚。除非另有定义，否则所有术语均保持其技术人员所理解的共同含义。
241.细胞毒性t细胞和溶细胞活性：
242.细胞毒性t细胞(也称为tc、细胞毒性t淋巴细胞、ctl、t杀伤细胞、溶细胞性t细胞、t细胞或杀伤性t细胞，并且在本文中可互换地使用)是对例如癌细胞具有溶细胞活性的t细胞(一种白细胞)。在一些实施方式中，溶细胞活性可以与cd8 t细胞和/或cd4 t细胞相关。两种t细胞亚群都可以产生和释放裂解性颗粒内容物，即颗粒酶等溶细胞酶。
243.术语“溶细胞”是指t细胞通过释放裂解性颗粒内容物来杀死靶细胞的能力，裂解性颗粒内容物也称为分泌性溶酶体。
244.作为适应性免疫应答的中心元件，t细胞能够消除感染和转化的肿瘤细胞。cd8 t细胞可以成熟为细胞毒性t淋巴细胞(ctl)，主要涉及通过将溶细胞颗粒释放到免疫突触中来破坏受感染或转化的细胞。这些颗粒包括穿孔素和颗粒酶，它们在ca
2
依赖性调节分泌途径中被释放并诱导靶细胞内的细胞凋亡。
245.一旦ctl识别并结合其靶细胞，分泌性溶酶体就会移动并聚集在微管组织中心周围。膜融合后，穿孔素和颗粒酶被释放到免疫突触中。穿孔素是一种能够进行膜透化的成孔分子，对于颗粒酶进入靶细胞胞质溶胶很重要。在靶细胞内，程序性细胞死亡途径由颗粒酶启动。在某些活化条件下，配备有car受体的cd4 t细胞也可以通过颗粒酶释放而获得溶细胞特性。因此，可以以与溶细胞cd8 t细胞相同的方式通过ebag9沉默操纵它们。
246.颗粒酶a诱导以产生单链dna切口为特征的半胱天冬酶非依赖性细胞凋亡。由于颗粒酶a的作用，线粒体内膜电位丧失，导致活性氧(ros)的释放。结果，诱导了dna单链切口。相反，除了活化半胱天冬酶非依赖性细胞死亡程序外，颗粒酶b还能够通过切割和活化半胱天冬酶3、7、8和10以及它们的数个下游底物来诱导半胱天冬酶依赖性细胞凋亡。此外，颗粒酶b诱导ros产生和细胞色素c从线粒体中释放。
247.ebag9及其在调节效应分子分泌中的作用：
248.蛋白质从反式高尔基网络(tgn)到分泌性溶酶体的转移受到高度调节。发明人已
经证明了调节蛋白，例如雌激素受体结合片段相关抗原9(ebag9)的存在，ebag9是效应分子的ca
2
依赖性调节分泌的负调节剂。
249.人ebag9包含213个氨基酸并显示出结构域结构。通过c末端卷曲螺旋结构，人ebag9形成具有n末端定位的跨膜域的同源寡聚体。ebag9是一种在大多数组织中表达的雌激素诱导蛋白。
250.发明人已经证明，ebag9的丧失通过促进从cd8 t细胞中释放含有颗粒酶a的分泌性溶酶体来增强体内ctl的溶细胞活性。
251.从机制上讲，ebag9与ap
‑
1的γ2亚基相互作用并抑制ap
‑
1活性网格蛋白包被的囊泡的形成。此外，ebag9还被确定为作为溶酶体相关细胞器复合体
‑
1(bloc
‑
1)的亚基的snapin和blos2的相互作用伴侣。在分泌途径中，bloc
‑
1调节蛋白质从内体到分泌性溶酶体的分选。因此，ebag9负调节囊泡从tgn到分泌性溶酶体的转移，并且是增加过继转移的t细胞的溶细胞活性的有吸引力的目标。
252.ebag9施加的转运调节的净效应是抑制分泌性溶酶体成熟，这涉及含有前体形式的蛋白水解酶的载体的转运和融合过程。可替代地，对分泌的裂解颗粒内容物的再吸收可能被ebag9抑制，导致回收的溶细胞活性颗粒酶的可用性降低。
253.ebag9被鉴定为雌激素反应基因。雌激素对转录的调节由雌激素受体介导，雌激素受体与该基因5'
‑
侧翼区域中发现的雌激素反应元件结合。所编码的蛋白质是在多种癌症中高频率表达的肿瘤相关抗原。交替剪接导致多种转录物变体。已在10号染色体上定义了该基因的假基因。
254.在一些实施方式中，本发明优选地涉及根据ncbi数据库的gene id：9166的智人(homo sapiens)(人)的雌激素受体结合位点相关抗原9(ebag9)。该基因位于8号染色体上。ebag9也可称为eb9或pdaf。
255.因此可以使用rnai靶向根据seq id no 3
‑
6的转录物变体，以抑制ebag9。技术人员能够基于感兴趣的靶序列设计合适的工具，即反义、sirna、mirna或shrna。示例性ebag9转录物选自但不限于nm_004215.5(ebag9)，转录物变体1，mrna，seq id no 3，nm_198120.2(ebag9)，转录物变体2，mrna，seq id no 4，nm_001278938.1(ebag9)，转录物变体3，mrna，seq id no 5，xm_017013960.1(ebag9)，转录物变体x1，mrna，seq id no 6。
256.用于评估ebag9抑制的优选方法与本文公开的那些方法有关，并且包括通过定量或半定量评估含有颗粒酶a的分泌性溶酶体从例如cd8 t细胞的释放，在体内或体外评估ctl的溶细胞活性的方法。下文公开了适用于本技术的体外实施例中的合适方案。
257.rna干扰(rnai)：
258.rnai是一种转录后介导的基因沉默机制，由双链rna(dsrna)触发以诱导序列特异性翻译抑制或mrna降解。历史上，rnai有其他名称，包括共抑制、转录后基因沉默(ptgs)和抑制。
259.在细胞核中，微小rna(mirna)基因在rna聚合酶ii的作用下被转录成500
‑
3000个核苷酸的pri
‑
mirna。这些pri
‑
mirna被加帽并聚腺苷酸化。此外，pri
‑
mirna包含一个或多个茎环序列，并被drosha
‑
dgcr8复合物切割成60
‑
100个核苷酸的双链pre
‑
mirna发夹结构。ran gtp酶和输出蛋白
‑
5介导pre
‑
mirnas从细胞核向细胞质的输出。在那里，它们被称为dicer的rna酶iii进一步加工成22个核苷酸的不完美双链体结构。其中一条链类似于与
argonaut(ago)蛋白结合的成熟mirna，并掺入rna诱导的沉默复合体(risc)中。作为risc结合的结果，mrna降解或蛋白质翻译的抑制被诱导。靶mrna分子的命运取决于靶mrna分子和mirna之间的互补程度，但也受掺入的ago蛋白的影响。虽然ago 2的掺入导致靶mrna的直接切割，但其他ago蛋白会对mrna稳定性产生负面影响或减弱翻译。
260.对于特定靶标的工程化敲低，可以使用在不同位置进入rnai途径的几种dsrna分子。用进入胞质溶胶中的rnai途径的小干扰rna(sirna)分子转染只会导致瞬时蛋白质敲低。对于基因表达的长期操作，需要通过整合基因转移载体来递送dsrna分子。因此，可以应用短发夹rna(shrna)或mirna分子。
261.两者都进入细胞核中的rnai途径，然后被加工成sirna样分子。shrna模仿pre
‑
mirna茎环结构。它们的表达由强rna聚合酶iii启动子驱动，导致高水平表达和稳定的基因敲低。然而，显示shrna过表达通过mirna加工途径的饱和来介导毒性。
262.另一种可能性是应用人工mirna来介导原代t细胞内的稳定敲低。这些人工mirna与pri
‑
mirna类似，因此进一步朝向模仿天然mirna生物学的步骤。这对于潜在的临床应用有几个优点。最重要的是，使用内源性mirna加工机制不会触发细胞自卫机制，如干扰素诱导。
263.此外，人工mirna由与大多数天然mirna相当的rna聚合酶ii启动子转录。这些启动子介导受调节的和组织特异性的表达，并进一步使选择器或治疗性转基因的同时表达成为可能。此外，可以将一个表达盒中的多个mirna组合到相同或不同mrna中的目标区域，从而在目标下调中获得累加效应。这种目标下调在本文中称为例如敲低、沉默或rna干扰。
264.crispr工程化：
265.在一些实施方式中，抑制ebag9包括通过crispr破坏ebag9基因的表达和/或序列来对t细胞基因组进行遗传修饰。在本发明的进一步实施方式中，可以采用crispr介导的插入car或tcr编码核酸。
266.crispr是聚簇规律间隔的短回文重复序列的缩写，是细菌中的一个dna序列家族。这些序列包含来自攻击了细菌的病毒的dna小片段。细菌使用这些小片段来检测和破坏dna，使其免受类似病毒的进一步攻击。这些序列在细菌防御系统中发挥着关键作用，并构成了crispr/cas技术的基础，该技术可有效且特异性地改变生物体内的基因。
267.crispr基因座的序列被转录并加工成crispr rna(crrna)，crrna和反式活化crrna(tracrrna)一起与crispr相关(cas)蛋白复合，以通过核酸之间的watson
‑
crick碱基配对来决定cas核酸酶对dna切割的特异性(wiedenheft,b等人(2012).自然482:331
–
338；horvath,p等人(2010).科学327:167
–
170；fineran,pc等人.(2012).病毒学434:202
–
209)。
268.结果表明，ii型crispr核酸酶系统所需的三个组件是cas9蛋白、成熟的crrna和tracrrna，其可以通过将crrna和tracrrna融合成单一引导rna(sgrna)而减少为两个组件，并且将cas9/sgrna复合物重新定位到新位点可以通过改变grna的一小部分的序列来实现(garneau,je等人(2010).自然468:67
–
71；deltcheva,e等人(2011).自然471:602
–
607,jinek,m等人(2012)科学337:816
–
821)。
269.crispr
‑
cas系统是细菌和古细菌的rna引导的适应性免疫系统，其提供针对病毒或其他入侵遗传物质的序列特异性抗性。根据负责靶标识别和入侵核酸切割的效应模块的结构，这种免疫样应答被分为两类(makarova ks等人nat rev microbiol.2015nov；13
(11):722
‑
36.)。1类包括多亚基cas蛋白效应子，2类由单个大效应蛋白组成。1类和2类都使用crispr rna(crrna)将cas核酸酶组件引导到其靶位点，cas核酸酶在靶位点切割入侵的核酸。由于其简单性，2类crispr
‑
cas系统是研究最多且应用最广泛的基因组编辑系统。使用最广泛的crispr
‑
cas系统是crispr
‑
cas9。结果表明，crispr/cas9系统可以针对在哺乳动物细胞中进行有效的遗传修饰而进行工程化。
270.在本发明的一些实施方式中，采用了rna引导的dna核酸内切酶。在本发明的上下文中，术语“rna引导的dna核酸内切酶”是指与至少一种rna分子相互作用的dna核酸内切酶。dna核酸内切酶是切割dna多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶。在rna引导的dna核酸内切酶的情况下，相互作用的rna分子可以将rna引导的dna核酸内切酶引导到dna中核酸内切酶变得有活性的位点或位置。特别地，术语rna引导的dna内切核酸酶是指天然存在的或遗传修饰的cas核酸酶组件或crispr
‑
cas系统，其包括但不限于1类crispr
‑
cas系统的多亚基cas蛋白效应器以及2类系统的单一大效应cas蛋白。
271.crispr/cas系统和合适的rna引导的核酸内切酶的技术应用的细节是技术人员已知的，并且已经在文献中详细描述，例如barrangou r等人(nat biotechnol.2016sep 8；34(9):933
‑
941)、maeder ml等人(mol ther.2016mar；24(3):430
‑
46)和cebrian
‑
serrano a等人(mamm genome.2017；28(7):247
–
261)。本发明不限于使用特定的rna引导的核酸内切酶，因此包括在本发明意义上适用于本文所述方法的任何给定的rna引导的核酸内切酶的使用。
272.根据本发明，可以使用本领域已知的任何rna引导的dna内切核酸酶。rna引导的dna核酸内切酶包括但不限于1类crispr
‑
cas系统的cas蛋白，例如cas3、cas8a、cas5、cas8b、cas8c、cas10d、cse1、cse2、csy1、csy2、csy3、gsu0054、cas10、csm2、cmr5、csx11、csx10和csf1；2类crispr
‑
cas系统的cas蛋白，例如cas9、csn2、cas4、cpf1、c2c1、c2c3和c2c2；来自各种细菌和古细菌物种的相应直系同源酶/crispr效应子；工程化crispr效应子，其例如具有新的pam特异性、更高保真度(如spcas9
‑
hf1/espcas9)或改变的功能(如切口酶)。本发明的特别优选的rna引导的dna内切核酸酶是酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)cas9(spcas9)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)cas9、嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)cas9、脑膜炎奈瑟氏菌(neisseria meningitidis)cas9(nmcas9)、新凶手弗朗西丝菌(francisella novicida)cas9(fncas9)、空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni)cas9(cjcas9)、cas12a(cpf1)和cas13a(c2c2)(makarova ks等人.(november 2015).自然评论微生物学.13(11):722
‑
36)。
273.本文提供的定义和解释主要集中在spcas9 crispr/cas系统上。然而，本领域技术人员知道如何使用替代的crispr/cas系统以及提供或允许获得关于这样的替代系统的细节信息的工具和方法。
274.根据本发明的方法，rna引导的dna内切核酸酶可以作为蛋白质而被引入，但可替代地，rna引导的dna内切核酸酶也可以以编码所述蛋白质的核酸分子的形式而被引入。应当理解，核酸分子以可表达的形式编码所述rna引导的dna核酸内切酶，使得在细胞中的表达产生功能性rna引导的dna核酸内切酶蛋白，例如cas9蛋白。确保功能性多肽表达的手段和方法是本领域熟知的。例如，内切核酸酶的编码序列可以被包含在载体中，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或例如在基因工程中常规使用的其他载体。
275.此外，本发明的方法包括将至少一种引导rna引入细胞。在本发明的上下文中，“引导rna”是指与rna引导的dna核酸内切酶相互作用而导致被rna引导的dna核酸内切酶切割的靶序列被识别的rna分子。根据本发明，术语“引导rna”因此包括但不限于靶序列特异性crispr rna(crrna)、反式活化crrna(tracrrna)和嵌合单一引导rna(sgrna)。
276.如本文所述，编码crispr/cas系统元件(例如cas9、tracrrna和crrna)的基因通常以操纵子形式组织。与rna引导的核酸内切酶(例如其他细菌物种的cas9蛋白)一起起作用的dr序列可以通过对出现在各自crispr/cas操纵子中的序列重复进行生物信息学分析以及通过cas9蛋白和tracrrna以及推定的dr序列侧翼靶序列进行实验结合研究来鉴定。
277.在一些实施方式中，可以采用包含这种靶序列特异性crrna和tracrrna的嵌合单一引导rna序列。这样的嵌合(ch)rna可以通过将具有部分dr序列或整个dr序列(定义为crrna的一部分)的20个或更多个核苷酸的靶特异性序列与整个或部分tracrrna融合来设计，如jinek等人(科学337：816
‑
821)所示。在嵌合rna内，dr的一段和tracrrna序列互补，能够杂交并形成发夹结构。
278.此外，本发明的至少一种引导rna还可以由引入细胞的核酸分子编码。本文所述的关于编码核酸内切酶的核酸分子的定义和优选实施方式同样适用于编码这些rna的核酸分子。用于表达rna的调节元件例如u6启动子是本领域技术人员已知的。
279.细胞疗法或过继细胞转移(att)：
280.il
‑
2疗法的发现提出了这样的假设，即可以从患者身上提取t淋巴细胞，在体外扩增，并作为癌症疗法重新施用该t淋巴细胞。这在1988年在人类中实现，研究人员使用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞系在转移性黑色素瘤患者中产生消退。att的工作原理是切除肿瘤标本并将其消化成单细胞悬液。在开发这些方法的过程中，出现了两种新的att方法：tcr和嵌合抗原受体(car)方法，这两种方法目前都很成熟。
281.在tcr疗法中，通常从患者的血液中分离出正常的循环t细胞，并将该循环t细胞通过转染逆转录病毒载体或转座子进行遗传修饰以表达针对肿瘤抗原的tcr。从针对目标taa进行免疫的人患者或小鼠中收集特定的tcr。tcr疗法的局限性在于重组tcr仍依赖于mhc识别来实现细胞毒性。在2010年开发并推出了嵌合抗原受体技术以规避这个问题。该方法再次利用通过病毒载体进行转染，但将抗体可变区引入了t细胞，该可变区将在膜上表达并与胞内信号传导域连接。与cd3
‑
ζ相关的首个car和该方法后来被改进以涉及共刺激受体，如cd28、ox40等，如下文更详细的描述。
282.外源核酸：
[0283]“外源核酸”、“外源遗传元件”或“转基因”核酸或构建体涉及引入细胞的任何不是细胞“原始”或“天然”基因组或未修饰t细胞中“天然”发现的核酸库的组分的核酸。外源核酸可以整合或未整合到靶t细胞的遗传物质中或与稳定转导的核酸相关。可通过外源核酸分子在初始细胞中的永久整合，外源核酸的递送导致初始细胞的遗传修饰。然而，外源核酸的递送也可以是瞬时的，这意味着所递送的用于提供一种或多种tf的遗传物质在一定时间后从细胞中消失。技术人员可使用常用技术进行并确定生物细胞(即t细胞)的核酸分子递送和潜在遗传修饰。例如，为了检测遗传修饰，可以对细胞的基因组或其部分进行测序，从而鉴定是否存在外源核酸。可替代地，可以应用其他分子生物学技术，例如聚合酶链反应(pcr)，以鉴定/扩增外源遗传物质。外源核酸可以通过载体序列或载体序列的一部分(例如
留在遗传修饰位点的那些)来检测。在修饰后可从基因组中去除载体序列(例如治疗性转基因侧翼的载体序列)或不保留载体序列的情况下(例如通过crispr技术)，仍然可以通过在基因组中的“非天然”位置检测包含外源序列的序列进行测序工作来检测转基因的添加。
[0284]
本发明的实施方式涉及遗传修饰的细胞毒性t细胞，其包含一种或多种编码转基因抗原靶向构建体的外源核酸分子。在本发明的实施方式中，外源核酸代表，基于例如与未修饰的人基因组序列的比较，非天然地存在于t细胞中的核酸序列。在本发明的实施方式中，转基因抗原靶向构建体是编码抗原靶向构建体的核酸序列，该抗原靶向构建体的编码序列，基于例如与未修饰的人基因组序列的比较，非天然地存在于t细胞中。在一些实施方式中，该序列存在于基因组的“非天然位置”。在一些实施方式中，靶向构建体包含非天然存在的序列或由非天然存在的序列组成，该非天然存在的序列为使用重组技术或其他分子生物学技术设计和产生的合成序列。根据本发明，ebag9活性被抑制(与对照细胞毒性t细胞相比)。在一些实施方式中，可以通过ebag9的功能评估来补充外源核酸序列的存在，以进一步指示ebag9抑制。
[0285]
抗原靶向构建体：
[0286]
如本文所用，术语“抗原靶向构建体”或“靶向构建体”是指能够将t细胞引导至特定抗原或抗原组的转基因分子(由外源核酸分子编码)。因此，抗原靶构建体优选为嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)。工程化t细胞已成为精准癌症疗法的新阶段，通过在优选自体或供体t细胞上强制表达这些抗原靶向分子，它们导致特异性识别肿瘤抗原并增强其治疗特异性和功效。
[0287]
嵌合抗原受体：
[0288]
根据本发明，嵌合抗原受体多肽(car)包括胞外抗原结合域、跨膜域和胞内域，该胞外抗原结合域包含结合靶抗原的抗体或抗体片段。通常将car描述为包含衍生自抗体的胞外域(抗原结合域)和包含衍生自t细胞信号传导蛋白的信号传导组件的胞内域。
[0289]
在优选的实施方式中，胞外域优选包含来自免疫球蛋白的重链和轻链的被构造为单链可变片段(scfv)的可变区。scfv优选通过将跨膜部分锚定于胞内信号传导域而连接于提供灵活性并转导信号的铰链区。该跨膜域优选来源自cd8α或cd28。在第一代car中，信号传导域由tcr复合体的ζ链组成。术语“代”是指胞内信号传导域的结构。第二代car配备有来源于cd28或4
‑
1bb的单一共刺激域。第三代car已经包含两个共刺激域，例如cd28、4
‑
1bb、icos或ox40、cd3ζ。优选地，本发明涉及第二代或第三代car。
[0290]
在各种实施方式中，提供了将免疫效应细胞的细胞毒性重定向至b细胞的遗传工程化受体。这些遗传工程化受体在本文中称为嵌合抗原受体(car)。car是将针对所期望抗原的基于抗体的特异性与活化t细胞受体的胞内域相结合以产生表现出抗原特异性细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。如本文所用，术语“嵌合”描述了由来自不同来源的不同蛋白质或dna的部分组成。
[0291]
本文考虑的car包含与靶抗原结合的胞外域(也称为结合域或抗原结合域)、跨膜域以及胞内域或胞内信号传导域。car的抗原结合域在靶细胞表面上的接合导致car聚集，并将活化刺激传递至含car的细胞。car的主要特性是car重定向免疫效应细胞特异性的能力，从而以主要组织相容性复合体(mhc)非依赖性方式触发增殖、细胞因子产生、吞噬作用或产生可以介导靶抗原表达细胞的细胞死亡的分子，从而利用单克隆抗体、可溶性配体或
细胞特异性共受体的细胞特异性靶向能力。
[0292]
在各种实施方式中，car包含：胞外结合域，其包含人源化抗原特异性结合域；跨膜域；一个或多个胞内信号传导域。在特别的实施方式中，car包含：胞外结合域，其包含其人源化抗原结合片段；一个或多个间隔区域；跨膜域；一个或多个胞内信号传导域。
[0293]“胞外抗原结合域”或“胞外结合域”可互换使用，并为car提供与目标靶抗原cxcr5特异性结合的能力。结合域可以衍生自天然、合成、半合成或重组来源。优选的是scfv域。
[0294]“特异性结合”应被理解为是通过本领域技术人员来理解的，由此技术人员清楚地知道可用于测试结合和结合特异性的各种实验程序。确定平衡缔合或平衡解离常数的方法是本领域已知的。在许多蛋白质
‑
蛋白质相互作用中，一些交叉反应或背景结合可能是不可避免的；这不减损car和表位之间结合的“特异性”。“特异性结合”描述了抗体或其抗原结合片段(或包含抗体或其抗原结合片段的car)以比背景结合更大的结合亲和力与靶抗原结合。当理解抗体和表位之间的相互作用中考虑术语“特异性”时，术语“直接针对”也适用。
[0295]“抗原(ag)”是指可以刺激动物中抗体的产生或t细胞应答的化合物、组合物或物质。在特别的实施方式中，靶抗原是期望的多肽的表位。“表位”是指结合剂结合的抗原区域。表位可以由通过蛋白质的三级折叠并列的连续氨基酸或不连续氨基酸形成。
[0296]“单链fv”或“scfv”抗体片段包含抗体的vh和vl域，其中这些域以单一多肽链并以任一方向(例如vl
‑
vh或vh
‑
vl)存在。通常，scfv多肽在vh和vl域之间进一步包含使得scfv能够形成用于抗原结合的期望结构的多肽接头。在优选的实施方式中，本文考虑的car包含抗原特异性结合域，该抗原特异性结合域是scfv并且可以是鼠、人或人源化scfv。单链抗体可以从对所期望靶标特异的杂交瘤的v区基因克隆。scfv也可以从噬菌体展示文库中获得，从而绕过传统的杂交瘤技术。在特别的实施方式中，抗原特异性结合域是结合人靶抗原多肽的人源化scfv。
[0297]
适用于构建本文考虑的抗cxcr5 car的可变重链的说明性实例包括但不限于seq id no:13所示的氨基酸序列。适用于构建本文考虑的抗cxcr5 car的可变轻链的说明性实例包括但不限于seq id no:15所示的氨基酸序列。
[0298]
抗体和抗体片段：
[0299]
car包含胞外抗原结合域，所述胞外抗原结合域包含结合靶多肽的抗体或抗体片段。因此，本发明的抗体或抗体片段包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链片段(scfv)、单可变片段(ssfv)、单域抗体(例如来自纳米抗体的vhh片段)、fab片段、f(ab')2片段、由fab表达文库产生的片段、抗独特型抗体和表位结合片段或以上任意的组合，只要它们保留优选包含相应的cdr或如本文所述的vh和vl区的本文所述的car的相似结合特性。微型抗体和多价抗体(例如双抗体、三抗体、四价抗体和肽体)也可以用于本发明的方法。本发明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类(即igg、ige、igm、igd和iga)或亚类。因此，如本文所用的术语抗体还包括通过修饰完整抗体产生或使用重组dna方法从头合成的本发明的car所包含的抗体和抗体片段。
[0300]
如本文所用，“抗体”通常是指由基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。当使用术语“抗体”时，也可以认为是指术语“抗体片段”。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，分别依次定义了免疫球蛋白的类igg、
igm、iga、igd和ige。已知基本的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体或二聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”(l)链(约25kd)和一条“重”(h)链(约50至70kd)。每条链的n端定义了约100至110个或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语“可变轻链”和“可变重链”分别是指轻链和重链的这些可变区。任选地，抗体或抗体的免疫学部分可以与其他蛋白化学缀合或与其他蛋白表达为融合蛋白。
[0301]
本发明的car旨在结合哺乳动物，特别是人的蛋白质靶标。蛋白质名称的使用可能对应于小鼠或人形式的蛋白质。
[0302]
可以使用常规技术，例如通过竞争性elisa(酶联免疫吸附测定)或通过结合缔合，或使用标记的配体的置换测定，或使用表面等离子体共振装置(例如biacore)，容易地确定结合域多肽和根据本公开的car蛋白的亲和力。
[0303]
可以使用本领域已知的任何方法来制备人源化抗体，所述人源化抗体包含本发明的抗体的一个或多个cdr或衍生自所述抗体的一个或多个cdr。例如，可以使用四个通用步骤来使单克隆抗体人源化。它们是：(1)确定起始抗体轻链和重链可变域的核苷酸和预测的氨基酸序列，(2)设计人源化抗体，即，决定在人源化过程中使用哪种抗体框架区，(3)实际人源化方法/技术，和(4)人源化抗体的转染和表达。参见，例如，美国专利号4,816,567；5,807,715；5,866,692；6,331,415；5,530,101；5,693,761；5,693,762；5,585,089；6,180,370；5,225,539；6,548,640。
[0304]
术语人源化抗体是指，免疫球蛋白的至少一部分框架区，以及任选地一部分cdr区或参与结合的其他区域衍生或被调节至人免疫球蛋白序列。人源化、嵌合或部分人源化形式的小鼠单克隆抗体可以例如通过重组dna技术由编码h和l链的小鼠和/或人基因组dna序列或由编码h和l链的cdna克隆来制备。人源化形式的小鼠抗体可以通过重组dna技术将非人抗体的cdr区与人恒定区连接而产生(queen等人，1989；wo 90/07861)。可供选择地，用于本发明方法的单克隆抗体可以是人单克隆抗体。人抗体可以例如使用噬菌体展示方法(wo91/17271；wo 92/01047)获得。
[0305]
如本文所用，人源化抗体还指作为包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如fv、fab、fab'、f(ab')2或抗体的其他抗原结合亚序列)的非人(例如鼠、骆驼、美洲驼、鲨鱼)形式的抗体。
[0306]
如本文所用，人或人源化抗体或抗体片段是指，具有与由人产生的抗体的氨基酸序列和/或使用本领域已知或本文公开的制备人抗体的任何技术已经制备的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体。人抗体或其片段可以通过竞争性结合实验来选择，或者以其他方式选择为具有与特定小鼠抗体相同的表位特异性。令人惊奇地，本发明的人源化抗体在很大程度上共享了小鼠抗体的有用的功能特性。人多克隆抗体也可以以用免疫原性剂免疫的人血清形式提供。任选地，这样的多克隆抗体可以通过使用淀粉样原纤维和/或非原纤维多肽或其片段作为亲和试剂通过亲和纯化来浓缩。可以根据wo 99/60846中描述的技术从血清中获得单克隆抗体。
[0307]
可变区和cdr
[0308]
抗体的可变区是指单独或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。重链和轻链的可变区均由三个互补决定区(cdr)(也称为高变区)连接的四个框架区(fr)组成。每条链中的cdr通过fr紧密保持在一起，并且与另一条链中的cdr一起有助于形成抗体的抗原
结合位点。
[0309]
有许多可用于确定cdr的技术，例如基于跨物种序列变异性的方法(例如，kabat等人，免疫学感兴趣的蛋白质序列(sequences of proteins of immunological interest)，(第5版，1991年，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州))；以及基于抗原
‑
抗体复合物的晶体学研究的方法(al
‑
lazikani等人(1997)j.molec.biol.273:927
‑
948)。可供选择的方法包括imgt国际immunogenetics信息系统(marie
‑
paule lefranc)。kabat定义基于序列变异性，是最常用的方法。chothia定义基于结构环区域的位置，其中abm定义是牛津分子公司的abm抗体建模软件使用的两者之间的折衷方案(请参阅www.bioinf.org.uk：andrew crmartin博士课题组)。如本文所用，cdr可指通过一种或多种方法或通过这些方法的组合定义的cdr。
[0310]
在一些实施方式中，本发明提供了并入car的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含与本发明的抗体的至少一个cdr、至少两个、至少三个或更多个cdr基本相同的至少一个cdr、至少两个、至少三个或更多个cdr。其他实施方式包括具有至少两个、三个、四个、五个或六个cdr的抗体，这些cdr与本发明的抗体或衍生自本发明的抗体的至少两个、三个、四个、五个或六个cdr基本相同。在一些实施方式中，至少一个，两个，三个，四个，五个或六个cdr与本发明的抗体的至少一个、两个或三个cdr的同一性为至少约70％、75％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。应当理解，出于本发明的目的，尽管活性程度与所述抗体相比可能有变化(可能更大或更小)，但结合特异性和/或总体活性通常被保留。
[0311]
car的其他组件
[0312]
在某些实施方式中，本文考虑的car可以在各个域之间包含接头残基，所述接头残基被添加以用于分子的适当间隔和构型，例如包含如下的氨基酸序列的接头，所述氨基酸序列连接vh和vl域，并提供与两个亚结合域的相互作用兼容的间隔区功能，从而使所得多肽对与包含相同轻链和重链可变区的抗体相同的靶分子保持特异性结合亲和力。本文考虑的car可包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个接头。在特别的实施方式中，接头的长度为约1至约25个氨基酸，约5至约20个氨基酸或约10至约20个氨基酸，或任何中间长度的氨基酸。
[0313]
接头的说明性实例包括甘氨酸聚合物；甘氨酸
‑
丝氨酸聚合物；甘氨酸
‑
丙氨酸聚合物；丙氨酸
‑
丝氨酸聚合物；以及本领域已知的其他柔性接头，例如惠特洛(whitlow)接头。甘氨酸和甘氨酸
‑
丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此可能能够充当融合蛋白(例如本文所述的car)的结构域之间的中性系链。
[0314]
在特别的实施方式中，在car的结合域之后是一个或多个“间隔区”或“间隔区多肽”，所述“间隔区”或“间隔区多肽”是指将抗原结合域移动至远离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化的区域。在某些实施方式中，间隔区域是免疫球蛋白的一部分，包括但不限于一个或多个重链恒定区，例如ch2和ch3。间隔区域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。在一种实施方式中，间隔区域包含igg1或igg4的ch2和ch3域。在一种实施方式中，以防止car与巨噬细胞和其他先天免疫细胞上表达的fc受体结合的方式，使这种间隔区/铰链区的fc结合域突变。
[0315]
在一些实施方式中，在car的结合域之后可以是一个或多个“铰链域”，所述“铰链
域”在使抗原结合域远离效应细胞表面定位以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化中起作用。car可以在结合域和跨膜域(tm)之间包含一个或多个铰链域。铰链域可以衍生自天然、合成、半合成或重组来源。铰链域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。适用于本文所述的car的说明性铰链域包括衍生自1型膜蛋白(例如cd8α、cd4、cd28、pd1、cd152和cd7)的胞外区的铰链区，所述铰链区可以是来自这些分子的野生型铰链区或可以被改变。在另一种实施方式中，铰链域包含pd1、cd152或cd8α铰链区。
[0316]“跨膜域”是car的一部分，该部分融合胞外结合部分和胞内信号传导域并将car锚定至免疫效应细胞的质膜。tm域可以衍生自天然、合成、半合成或重组来源。tm域可以衍生自t细胞受体的α、β或ζ链、cd3ε、cd3ζ、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd27、cd28、cd33、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd152、cd154和pd1。在一种实施方式中，本文考虑的car包含衍生自cd8α或cd28的tm域。
[0317]
在特别的实施方式中，本文考虑的car包含胞内信号传导域。“胞内信号传导域”是指car的一部分，该部分参与将与人靶标多肽有效结合的信息转导到免疫效应细胞内部以引发效应细胞功能，例如活化、产生细胞因子、增殖和细胞毒性活性，包括向car结合的靶细胞释放细胞毒性因子或抗原结合至胞外car域引起的其他细胞响应。术语“效应功能”是指免疫效应细胞的专门功能。t细胞的效应功能例如可以是溶细胞活性或帮助或包括细胞因子分泌的活性。因此，术语“胞内信号传导域”是指蛋白质的转导效应子功能信号并指导细胞执行专门的功能的一部分。本文考虑的car包含一个或多个共刺激信号传导域，以增强表达car受体的t细胞的功效、扩增和/或记忆形成。如本文所用，术语“共刺激信号传导域”是指共刺激分子的胞内信号传导域。共刺激分子是除抗原受体或fc受体以外的细胞表面分子，共刺激分子在结合抗原后提供t淋巴细胞的有效活化和功能所需的第二信号。
[0318]
在一种实施方式中，car包含胞内域，该胞内域包含共刺激域和信号传导(活化)域。因此，car构建体可包括原生t细胞受体复合物的胞内信号传导域(cd3ζ)和提供第二信号以刺激完全t细胞活化的一个或多个共刺激域。共刺激域被认为增加car t细胞细胞因子的产生并促进t细胞复制和t细胞持久性。共刺激域也已显示出潜在地防止car t细胞消耗，增加t细胞抗肿瘤活性并增强患者中car t细胞的存活。作为非限制性实例，在临床前研究中，具有4
‑
1bb共刺激域的car构建体与逐步持续扩增和效应功能、持久性增强以及t细胞亚群组成中的中央记忆细胞(tcm)富集相关。4
‑
1bb是肿瘤坏死因子(tnf)超家族的成员，并且是主要在抗原活化的cd4和cd8t细胞上表达的体内诱导型糖蛋白受体。作为非限制性实例，cd28是免疫球蛋白(ig)超家族的成员。它在静止和活化的cd4和cd8 t细胞上组成型表达，并通过刺激pi3k
‑
akt信号转导途径在t细胞活化中起关键作用。在一种实施方式中，胞内域同时包含4
‑
1bb和cd28共刺激域。其他共刺激域包括可与cd3ζ信号传导(活化)域结合的icos和ox40。
[0319]
t细胞受体：
[0320]
t细胞受体或tcr是在t细胞或t淋巴细胞的表面上发现的分子，该分子负责识别为与主要组织相容性复合体(mhc)分子结合的肽的抗原片段。tcr由两条不同的蛋白链构成。在人体中，在95％的t细胞中，tcr由α链和β链(分别由tra和trb编码)组成，而在5％的t细胞中，tcr由γ和δ(γ/δ)链(分别由trg和trd编码)组成。每条链由两个胞外域组成：可变(v)
区和恒定(c)区，两者都属于免疫球蛋白超家族(igsf)结构域，形成反向平行的β
‑
折叠。恒定区靠近细胞膜，然后是跨膜区和短胞质尾，而可变区与肽/mhc复合物结合。
[0321]
tcrα链和β链的可变域均具有三个高变或互补决定区(cdr)。β链(hv4)上还有额外的高变区，它通常不接触抗原，因此不被视为cdr。
[0322]
这些可变域中的残基位于tcr的两个区域，即，α链和β链的界面处以及被认为靠近cd3信号转导复合物的β链框架区中。cdr3是负责识别加工抗原的主要cdr，尽管还显示α链的cdr1与抗原肽的n端部分相互作用，而β链的cdr1与肽的c端部分相互作用。
[0323]
重组tcr先前已被转染到旨在治疗增殖性疾病的治疗性t细胞中。例如，通过用编码识别目标肽和cd3z基因的tcr(通常是与β链非共价结合的α链)的逆转录病毒或慢病毒载体转导优选自体α
‑
β或γ
‑
δ细胞，对tcr
‑
t细胞进行工程化。当工程化t细胞识别与抗原呈递细胞或肿瘤细胞的表面上的主要组织相容性复合体(mhc)结合的肽时，它们会被活化并开始扩增。首个tcr
‑
t细胞疗法用于转移性黑色素瘤的临床试验，其tcr识别来自黑色素细胞分化抗原(即t细胞识别的黑色素瘤抗原1(mart
‑
1))的hla
‑
a2限制肽。
[0324]
多肽
[0325]
除非有相反的说明，否则“肽”、“多肽”、“多肽片段”和“蛋白质”可以互换使用，并且按照常规含义，即作为氨基酸序列使用。多肽不限于特定长度，例如，它们可以包含全长蛋白质序列或全长蛋白质的片段，并且可以包括多肽的翻译后修饰(例如糖基化、乙酰化、磷酸化等)，以及天然存在和非天然存在的本领域已知的其他修饰形式。
[0326]
在各种实施方式中，本文考虑的car多肽在蛋白质的n端包含信号(或前导)序列，其以共翻译或翻译后方式指导蛋白质的转移。可以使用多种熟知的重组和/或合成技术中的任一种来制备多肽。本文考虑的多肽具体涵盖本公开的car，或缺失、添加和/或取代如本文公开的car的一个或多个氨基酸的序列。
[0327]
如本文所用，“分离的肽”或“分离的多肽”等是指从细胞环境以及与细胞的其他组件的缔合中体外分离和/或纯化肽或多肽分子，即，所述肽或多肽分子与体内物质没有显著关联。类似地，“分离的细胞”是指已经从体内组织或器官获得并且基本上不含胞外基质的细胞。
[0328]
核酸
[0329]
如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸分子”是指信使rna(mrna)、rna、基因组rna(grna)、正链rna(rna( ))、负链rna(rna(
‑
))、基因组dna(gdna)、互补dna(cdna)或重组dna。多核苷酸包括单链和双链多核苷酸。优选地，本发明的多核苷酸包括与本文所述的任何参考序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多核苷酸或变体，通常其中变体维持参考序列的至少一种生物学活性。在各种说明性实施方式中，本发明部分地考虑了包括表达载体、病毒载体和转移质粒的多核苷酸，组合物以及包含它们的细胞。
[0330]
可以使用本领域已知和可获得的多种成熟技术中的任一种来制备、操纵和/或表达多核苷酸。为了表达所期望的多肽，可以将编码该多肽的核苷酸序列插入适当的载体中。载体的实例是质粒、自主复制序列和转座元件(transposable element)。另外的示例性载体包括但不限于质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体(例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1衍生的人工染色体(pac))、噬菌体(例如λ噬菌体或m13噬菌体)和动物病毒。
可用作载体的动物病毒类别的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)，腺病毒，腺相关病毒，疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)，痘病毒，杆状病毒，乳头瘤病毒和乳多空病毒(例如sv40)。表达载体的实例是用于在哺乳动物细胞中表达的pclneo载体(promega)、用于慢病毒介导的基因转移和在哺乳动物细胞中表达的plenti4/v5
‑
desttm、plenti6/v5
‑
desttm和plenti6.2/v5
‑
gw/lacz(invitrogen)。在特别的实施方式中，可以将本文公开的嵌合蛋白的编码序列连接到这样的表达载体中，以在哺乳动物细胞中表达嵌合蛋白。表达载体中存在的“控制元件”或“调控序列”是载体的那些非翻译区
‑
复制起点、选择盒、启动子、增强子、翻译起始信号(shine dalgarno序列或kozak序列)内含子、聚腺苷酸化序列，5'和3'非翻译区
‑
它们与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译。这样的元件的强度和特异性可能有所不同。取决于所使用的载体系统和宿主，可以使用许多合适的转录和翻译元件，包括遍在启动子和诱导型启动子。
[0331]
载体
[0332]
在特别的实施方式中，用编码car的逆转录病毒载体(例如慢病毒载体)转导细胞(例如免疫效应细胞，如t细胞)。例如，用编码car的载体转导t细胞，该car包含结合靶多肽的人源化抗原特异性域、抗体或抗原结合片段以及跨膜域和胞内信号传导域，使得这些转导的细胞可以引发car介导的细胞毒性响应。
[0333]
逆转录病毒是基因递送的常用工具。在特别的实施方式中，逆转录病毒用于将编码嵌合抗原受体(car)的多核苷酸递送至细胞。如本文所用，术语“逆转录病毒”是指将病毒的基因组rna逆转录为线性双链dna拷贝并随后将其基因组dna共价整合到宿主基因组中的rna病毒。一旦病毒整合到宿主基因组中，就被称为“前病毒”。前病毒充当rna聚合酶ii的模板，并指导rna分子的表达，该rna分子编码产生新的病毒颗粒所需的结构蛋白和酶。
[0334]
适用于特别的实施方式的说明性逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(m
‑
mulv)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(momsv)、哈维鼠肉瘤病毒(hamusv)、鼠乳腺肿瘤病毒(mumtv)、长臂猿白血病病毒(galv)、猫白血病病毒(flv)、泡沫病毒、弗林德鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒(mscv)和劳斯肉瘤病毒(rsv)和慢病毒。
[0335]
如本文所用，术语“慢病毒”是指一组(或属)的复杂的逆转录病毒。说明性慢病毒包括但不限于：hiv(人免疫缺陷病毒；包括1型hiv和2型hiv)；维斯纳梅迪病毒(vmv)病毒；山羊关节炎
‑
脑炎病毒(caev)；马传染性贫血病毒(eiav)；猫免疫缺陷病毒(fiv)；牛免疫缺陷病毒(biv)；和猿猴免疫缺陷病毒(siv)。在一种实施方式中，基于hiv的载体骨架(即hiv顺式作用序列元件)是优选的。在特别的实施方式中，慢病毒用于将包含car的多核苷酸递送至细胞。
[0336]
本文使用的术语“载体”是指能够转移或运输另一种核酸分子的核酸分子。转移的核酸通常与载体核酸分子连接，例如插入载体核酸分子。载体可以包括指导细胞中自主复制的序列，或者可以包括足以允许整合入宿主细胞dna的序列。有用的载体包括，例如质粒(例如dna质粒或rna质粒、允许游离定位和持久性的dna质粒)、转座子、粘粒、细菌人工染色体和病毒载体。有用的病毒载体包括，例如复制缺陷型逆转录病毒和慢病毒。在本发明的其他实施方式中，可以采用crispr/cas和talen介导的car或tcr编码核酸的插入。适合于crispr/cas和talen介导的插入的载体是技术人员已知的。
[0337]
对本领域技术人员显而易见的是，术语“病毒载体”被广泛地用于指包含通常有助
于核酸分子转移或整合到细胞基因组中的病毒来源的核酸元件的核酸分子(例如转移质粒)，或指介导核酸转移的病毒颗粒。病毒颗粒通常将包含各种病毒组件，有时除了核酸以外还包含宿主细胞组件。
[0338]
术语病毒载体可以指能够将核酸转移到细胞中的病毒或病毒颗粒，或者是指转移的核酸本身。病毒载体和转移质粒包含主要来自病毒的结构和/或功能遗传元件。术语“逆转录病毒载体”是指包含主要衍生自逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。
[0339]
因此，在优选的实施方式中，本发明涉及一种用编码car的表达载体转染细胞的方法。例如，在一些实施方式中，载体包含另外的序列，例如促进car表达的序列，例如启动子、增强子、poly
‑
a信号和/或一个或多个内含子。在优选的实施方式中，编码car的序列的侧翼是转座子序列，使得转座酶的存在允许编码序列整合到转染细胞的基因组中。
[0340]
在一些实施方式中，将遗传转化的细胞进一步用促进编码car的序列整合到转染细胞的基因组中的转座酶转染。在一些实施方式中，转座酶以dna表达载体提供。然而，在优选的实施方式中，转座酶以可表达的rna或蛋白质的形式提供，使得转座酶在转基因细胞中不会长期表达。例如，在一些实施方式中，转座酶以mrna(例如，包含帽和聚
‑
a尾的mrna)的形式提供。根据本发明的实施方式，可以使用任何转座酶系统。然而，在一些实施方式中，转座酶是鲑科鱼型tel样转座酶(sb)。例如，转座酶可以是所谓的“睡美人”转座酶，参见例如美国专利6,489,458，其通过引用并入本文。在一些实施方式中，转座酶是具有增加的酶活性的工程化酶。转座酶的一些具体实例包括但不限于sb 10、sb 11或sb 100x转座酶(参见，例如mates等人,2009,nat genet.41(6):753
‑
61或us9228180，其通过引用并入本文。例如，方法可以包括用编码sb 10，sb 11或sb 100x转座酶的mrna对细胞电穿孔。
[0341]
序列变体
[0342]
本发明的范围内还包括保持本发明的相似结合特性的要求保护的核酸、蛋白质、抗体、抗体片段和/或car的序列变体(例如由％序列同一性定义的序列变体)。这样的变体显示可供选择的序列，但是基本上保持相同的结合特性(例如靶标特异性)，正如所提供的特定序列被称为功能类似物或功能类似的。序列同一性涉及进行序列比对时相同核苷酸或氨基酸的百分比。
[0343]
本文所用的“序列同一性”是指在比较窗口中，序列在核苷酸对核苷酸基础上或氨基酸对氨基酸基础上相同的程度。因此，“序列同一性百分比”可以通过比较在比较窗口中两个最佳比对的序列，确定相同核酸碱基(例如a、t、c、g、i)或相同氨基酸残基(例如ala、pro、ser、thr、gly、val、leu、he、phe、tyr、trp、lys、arg、his、asp、glu、asn、gin、cys和met)在两个序列中存在的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的总位置数(即窗口大小)，然后将结果乘以100即可得出序列同一性百分比。包括与本文所述的任何参考序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸和多肽，通常其中多肽变体维持参考多肽的至少一种生物学活性。
[0344]
本领域普通技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码如本文所述的多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性或序列同一性。然而，由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸是本发明特别考虑的。
在本发明中还包括被归入所述序列同一性的序列的缺失、取代和其他变化。
[0345]
本发明的范围内还包括可以通过取代而发生的蛋白质序列修饰。如本文所定义的取代是对蛋白质的氨基酸序列进行的修饰，其中一个或多个氨基酸被相同数目的(不同)氨基酸取代，从而产生了包含与初级蛋白质不同的氨基酸序列的蛋白质。可以进行优选不显著改变蛋白质功能的取代。如添加一样，取代可以是自然的也可以是人工的。在本领域中熟知的是，可以进行氨基酸取代而不显著改变蛋白质的功能。当修饰涉及“保守”氨基酸取代时，尤其如此，“保守”氨基酸取代是一种氨基酸被另一种具有相似性质的氨基酸取代。这样的“保守”氨基酸可以是天然或合成氨基酸，它们由于大小、电荷、极性和构象可以被取代而不会显著影响蛋白质的结构和功能。通常，许多氨基酸可以被保守氨基酸取代，而不会有害地影响蛋白质的功能。
[0346]
通常，非极性氨基酸gly、ala、val、ile和leu；非极性芳族氨基酸phe、trp和tyr；中性极性氨基酸ser、thr、cys、gln、asn和met；带正电荷的氨基酸lys、arg和his；带负电荷的氨基酸asp和glu代表几组保守氨基酸。此列表并不详尽。例如，众所周知，即使ala、gly、ser以及有时cys可以彼此替代，即使它们属于不同的组。
[0347]
取代变体在抗体分子中去除了至少一个氨基酸残基，并在该位置处插入了不同的残基。取代诱变最感兴趣的位点包括高变区，但也考虑了fr改变。如果这样的取代导致生物活性的变化，则可以引入下表中被称作“示例性取代”或如以下参考氨基酸类别进一步描述的更实质性的变化，并筛选产物。
[0348]
潜在的氨基酸取代：
[0349]
原始残基优选的保守取代示例性取代的示例ala(a)valval；leu；ileasg(r)lyslys；gln；asnasn(n)glngln；his；asp,lys；argasp(d)gluglu；asncys(c)serser；alagln(q)asnasn,gluglu(e)aspasp；glngly(g)alaalahis(h)argasn；gln；lys；argile(i)leuleu；val；met；ala；phe；正亮氨酸leu(l)ile正亮氨酸；ile；val；met；ala；phelys(k)argarg；gln；asnmet(m)leuleu；phe；ilephe(f)tyrleu；val；ile；ala；tyrpro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyrtyr；phetyr(y)phetrp；phe；thr；ser
val(v)leuile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸
[0350]
抗体生物学特性的实质性修饰是通过选择对保持以下的作用显著不同的取代而实现的：(a)在取代区域的多肽骨架结构，例如呈片状或螺旋状构型，(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或(c)侧链的多少。
[0351]
保守氨基酸取代不限于天然存在的氨基酸，还包括合成氨基酸。常用的合成氨基酸是：各种链长的ω氨基酸和环己基丙氨酸，它们是中性非极性类似物；瓜氨酸和甲硫氨酸亚砜，它们是中性非极性类似物；苯基甘氨酸，它是芳族中性类似物；磺基丙氨酸，它是带负电荷的类似物；鸟氨酸，它是带正电荷的氨基酸类似物。如天然存在的氨基酸一样，该列表不是穷举的，而仅仅是本领域熟知的取代的实例。
[0352]
遗传修饰的细胞和t细胞
[0353]
在特定实施方式中，本发明考虑了经遗传修饰以表达本文考虑的抗原特异性靶向构建体的t细胞，用于治疗细胞增殖疾病。本发明的t细胞还包括cd8 和cd4 t细胞。
[0354]
如本文所用，术语“遗传工程化的”或“遗传修饰的”是指将dna或rna形式的另外的遗传物质添加到细胞中的总遗传物质中。术语“遗传修饰的细胞”、“修饰的细胞”和“重定向的细胞”可互换使用。如本文所用，术语“基因疗法”是指以永久性或暂时性地将dna或rna形式的另外的遗传物质引入细胞中的总遗传物质中，以恢复、校正或修饰基因的表达，或用于表达治疗性多肽(例如car)的目的。在特别的实施方式中，本文考虑的tcr或car被引入ctl并在ctl中表达，以便将ctl的特异性重定向至感兴趣的靶抗原。
[0355]
免疫效应细胞，例如本发明的ctl，可以是自体的/同体的(autogeneic)(“自身”)或非自体的(“非自身的”，例如同种异体的、同基因的或异种的)。如本文所用，“自体的”是指来自同一受试者的细胞，并且代表本发明的优选实施方式。如本文所用，“同种异体的”是指在遗传上与所比较的细胞不同的相同物种的细胞。如本文所用，“同基因的”是指在遗传上与所比较的细胞相同的不同受试者的细胞。如本文所用，“异种的”是指与所比较的细胞不同物种的细胞。在优选的实施方式中，本发明的细胞是自体的或同种异体的。
[0356]
术语“t细胞”或“t淋巴细胞”是本领域公认的，并且旨在包括胸腺细胞、未成熟t淋巴细胞、成熟t淋巴细胞、静息t淋巴细胞，细胞因子诱导的杀伤细胞(cik细胞)或活化的t淋巴细胞。细胞因子诱导的杀伤(cik)细胞通常是cd3和cd56阳性的非主要组织相容性复合物(mhc)限制的自然杀伤(nk)样t淋巴细胞。t细胞可以是辅助t细胞(th；cd4 t细胞)，例如辅助t细胞1(th1)或辅助t细胞2(th2)。t细胞可以是细胞毒性t细胞(ctl；cd8 t细胞)，cd4 cd8 t细胞，cd4 cd8 t细胞或任何其他t细胞亚群。适用于特别的实施方式的t细胞的其他示例性群体包括幼稚t细胞和记忆t细胞以及干细胞样记忆细胞(tscm)。
[0357]
例如，当自体细胞移植后重新引入患者时，如本文所述用本发明的构建体修饰的t细胞可以识别并杀伤肿瘤细胞。
[0358]
本发明提供了制备表达本文描述的考虑的构建体的ctl的方法。在一种实施方式中，该方法包括转染或转导从个体分离的ctl，使得免疫效应细胞表达一种或多种如本文所述的抗原特异性构建体(car或tcr)。在某些实施方式中，ctl是从个体中分离出来的，并且在没有进一步体外操作的情况下遗传修饰。然后可以将这样的细胞直接重新施用给个体。在进一步的实施方式中，在被遗传修饰以表达car或tcr以及可能的ebag9沉默剂之前，首先激活ctl并刺激ctl在体外增殖。在这方面，可以在遗传修饰之前和/或之后培养ctl。
[0359]
在特别的实施方式中，在本文所述的免疫效应细胞的体外操作或遗传修饰之前，细胞来源从受试者获得。在特别的实施方式中，t细胞可从多种来源获得，包括但不限于外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、诱导的多能干细胞(ipsc)、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。某些实施方式中，t细胞可以使用本领域技术人员已知的多种技术从收集自受试者的单位血液中获得，如沉淀(例如ficoll
tm
分离)、基于抗体缀合的珠子的方法(例如macs
tm
分离(miltenyi))。在一种实施方式中，通过单采血液分离术获得来自个体循环血液的细胞。单血液分离术产物通常包含包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞的淋巴细胞，其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一种实施方式中，可以洗涤通过单采血液分离术收集的细胞以除去血浆部分，并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中以用于后续处理。可以用pbs或缺少钙、镁和大多数(如果不是所有其他的)二价阳离子的其他合适溶液洗涤细胞。如本领域普通技术人员将理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法来完成，例如通过使用半自动流过离心机。例如，cobe 2991单元处理器，baxter cytomate等。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液或其他含有或不含缓冲液的盐溶液中。在某些实施方式中，单采血液分离术样品的不希望的组分可以在直接重悬浮的细胞培养基中去除。
[0360]
在某些实施方式中，通过裂解红细胞并消耗单核细胞，例如通过经percoll
tm
梯度离心，从外周血单核细胞(pbmc)分离t细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离t细胞的特定亚群。本文使用的一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，其使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。
[0361]
pbmc可以使用本文考虑的方法直接遗传修饰以表达car。在某些实施方式中，在分离pbmc之后，进一步分离t淋巴细胞，并且在某些实施方式中，可以在遗传修饰和/或扩增之前或之后将细胞毒性和辅助t淋巴细胞分选为幼稚、记忆和效应t细胞亚群。可以通过使用标准方法获得cd8 细胞。在一些实施方式中，通过鉴定与那些类型的cd8 细胞中的每种相关的细胞表面抗原，将cd8 细胞进一步分类为幼稚、中央记忆和效应细胞。
[0362]
在一些实施方式中，本文所述的t细胞可以使用技术人员已知的方法从诱导性多能干细胞(ipsc)获得。
[0363]
生产car t细胞的接受方法依赖于成熟的循环t细胞的遗传修饰和扩增。这样的过程利用自体t细胞，并通过内源tcr表达以及通过mhc不相容性排斥，降低了异体t细胞发生移植物抗宿主病(gvhd)的风险。作为可供选择的方案，从多能干细胞(例如诱导性多能干细胞)体外直接分化工程化的t细胞提供了基本上无限的可被遗传修饰以表达本发明的car的细胞来源。在一些实施方式中，可以维持所谓的主ipsc系，这代表可一致且重复地生产同质细胞产品的可再生来源。在一些实施方式中，在扩增和分化成所期望的t细胞之前，考虑用编码car的核酸转化主ipsc细胞系。t淋巴细胞可以例如从ipsc产生，使得ipsc可以用编码car的核酸修饰，随后扩增并分化为t细胞以施用于患者。也可以从ipsc分化为合适的t细胞，然后用编码car的核酸进行转化，然后在施用前扩增。在本发明中考虑了ipsc扩增、遗传修饰和扩增以提供用于施用的合适数目的细胞的所有可能组合。
[0364]
t细胞可以在使用已知方法分离后进行遗传修饰，或者t细胞可以在进行遗传修饰之前在体外活化和扩增(或在祖细胞的情况下进行分化)。在特别的实施方式中，t细胞用本文考虑的嵌合抗原受体遗传修饰(例如用包含编码car的核酸的病毒载体转导)，然后在体
外活化和扩增。在各种实施方式中，t细胞可以使用例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；以及美国专利申请公开第20060121005号中描述的方法，在遗传修饰以表达car之前或之后活化和扩增。
[0365]
在另一种实施方式中，可以使用例如一种、两种、三种、四种、五种或更多种不同表达载体的混合物来遗传修饰t细胞的供体群，其中每种载体编码如本文考虑的不同的抗原靶向构建体。
[0366]
在一种实施方式中，本发明提供了一种存储表现出ebga9抑制的遗传修饰的t细胞的方法，该方法包括冷冻保存t细胞，使得细胞在解冻后保持活力。可以通过本领域已知的方法将免疫效应细胞的一部分冷冻保存，以提供这样的细胞的永久来源，用于将来治疗患有要治疗的病症的患者。需要时，可以将冷冻保存的细胞解冻，生长和扩增为更多这样的细胞。
[0367]
组合物和制剂
[0368]
如本文考虑的，本文考虑的组合物可以包含一种或多种多肽、多核苷酸、包含它们的载体、遗传修饰的t细胞等。组合物包括但不限于药物组合物。“药物组合物”是指在药学上可接受的或生理学上可接受的溶液中配制的组合物，所述组合物用于单独地或与一种或多种其他治疗方式组合地施用于细胞或动物。还应理解，如果需要，本发明的组合物也可以与其他药剂(例如细胞因子、生长因子、激素、小分子、化学治疗剂、前药、药物、抗体或其他各种药物活性剂)组合施用。实际上，对于还可以包含在组合物中的其他组分没有限制，条件是另外的药剂不会不利地影响组合物递送预期疗法的能力。
[0369]
本文所用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适合于与人类和动物的组织接触而没有过多的毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，并且与合理的获益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
[0370]
如本文所用，“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括但不限于已被美国食品药品监督管理局批准可用于人类或家畜的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、混悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂或乳化剂。示例性的药学上可接受的载体包括但不限于糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；可可脂，蜡、动植物脂肪、石蜡、硅酮、膨润土、硅酸、氧化锌；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，例如丙二醇；多元醇类，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及药物制剂中使用的任何其他兼容性物质。
[0371]
在特别的实施方式中，本发明的组合物包含本文考虑的一定量的t细胞。如本文所用，术语“量”是指遗传修饰的治疗细胞(例如t细胞)实现包括临床结果的有益或期望的预防或治疗结果的“有效量(amount effective/effective amount)”。
[0372]“预防有效量”是指有效达到期望的预防结果的遗传修饰的治疗细胞的量。通常但不是必须的，因为预防剂量在疾病之前或疾病的早期阶段中用于受试者，所以预防有效量小于治疗有效量。术语预防性不一定指完全禁止或预防特定的医学疾病。术语预防性还指
某一医学疾病在其症状发生或恶化方面的风险的降低。
[0373]
遗传修饰的治疗细胞的“治疗有效量”可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及干细胞和祖细胞在个体中引起期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量也是治疗有益作用超过病毒或转导的治疗细胞的任何毒性或有害作用的量。术语“治疗有效量”包括有效地“治疗”受试者(例如患者)的量。当指示治疗量时，医师可以考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度以及患者(受试者)状况的个体差异来确定要施用的本发明组合物的精确剂量。
[0374]
通常可以规定，包含本文描述的t细胞的药物组合物可以以102至10
10
个细胞/kg体重，优选105至107个细胞/kg体重的剂量施用，其中包括这些范围内的所有整数值。细胞的数量将取决于组合物的预期的最终用途，包含在组合物中的细胞类型也将取决于最终用途。对于本文提供的用途，细胞通常为1升或更少的体积，可以为500ml或更少，甚至250ml或100ml或更少。因此，所期望的细胞密度通常大于106个细胞/ml，通常大于107个细胞/ml，通常大于108个细胞/ml或更大。临床相关数量的细胞可以分配成多次输注，该多次输注累积等于或超过105、106、107、108、109、10
10
、10
11
、或10
12
个细胞。在本发明的一些方面，特别是当所有输注的细胞被重定向至特定的靶抗原时，可以施用较少数量的细胞。可以以这些范围内的剂量多次施用细胞组合物。细胞对于接受治疗的患者可以是同种异体的、同基因的、异种的或自体的。
[0375]
通常，包含如本文所述活化和扩增的细胞的组合物可用于治疗和预防免疫受损的个体中出现的疾病。特别地，包含本文考虑的修饰的t细胞的组合物用于治疗恶性血液病。本发明的修饰的t细胞可以单独施用，或者作为药物组合物与载体、稀释剂、赋形剂和/或与其他成分(例如il
‑
2或其他细胞因子)或细胞群组合施用。在特别的实施方式中，本文考虑的药物组合物包含与一种或多种药学或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的一定量的遗传修饰的t细胞。
[0376]
包含t细胞的本发明的药物组合物，可以包含缓冲剂，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于肠胃外施用，例如血管内(静脉内或动脉内)、腹膜内或肌内施用。
[0377]
液体药物组合物，无论是溶液、悬浮液还是其他类似形式，都可以包括以下中的一种或多种：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液，优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠，固定油(例如作为可用作溶剂或悬浮介质的合成的聚甘油单酯或甘油二酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲液，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的药剂，例如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以装在用玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器、多剂量小瓶或包中。可注射药物组合物优选是无菌的。
[0378]
在具体的实施方式中，本文考虑的组合物包含单独或与一种或多种治疗剂组合的有效量的t细胞。因此，t细胞组合物可以单独施用或与其他已知的癌症治疗(例如放射疗法、化学疗法、移植、免疫疗法、激素疗法、光动力疗法等)组合施用。组合物也可以与抗生素组合施用。这样的治疗剂在本领域中作为用于本文所述的特定疾病状态(例如特定癌症)的
标准治疗可以被接受。考虑的示例性治疗剂包括细胞因子、生长因子、类固醇、nsaid、dmard、抗炎药、化学疗法、放射疗法、治疗性抗体或其他活性剂和辅助剂。
[0379]
t细胞产物可在液氮气相中冷冻保存在二甲亚砜(dmso)/人血清白蛋白(10％/90％vol/vol)中，直至对患者施用调理治疗。这样的储存不会妨碍t细胞产品的活力和功能。
[0380]
治疗方法
[0381]
本文考虑的遗传修饰的细胞提供了过继免疫疗法的改进方法，该方法用于治疗与不希望的细胞增殖的存在有关的医学病症，优选恶性血液病。
[0382]
在特别的实施方式中，本文考虑的包含修饰的t细胞的组合物用于治疗血液系统恶性肿瘤，包括但不限于b细胞恶性肿瘤，例如具有或不具有白血病肿瘤细胞播散的非霍奇金淋巴瘤(nhl)(例如b细胞nhl或t细胞非霍奇金淋巴瘤)。
[0383]
在进一步的实施方案中，该方法涉及治疗恶性血液病，该恶性血液病选自非霍奇金淋巴瘤(nhl)、慢性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病和/或多发性骨髓瘤。
[0384]
非霍奇金淋巴瘤涵盖了一大组淋巴细胞(白细胞)癌症。非霍奇金淋巴瘤可发生在任何年龄，通常以大于正常的淋巴结、发烧和体重减轻为特征。非霍奇金淋巴瘤也可出现在结外部位，例如中枢神经系统和包括肺、肠、结肠和内脏的粘膜组织。非霍奇金淋巴瘤有许多不同类型。例如，非霍奇金淋巴瘤可分为侵袭性(快速增长)和惰性(缓慢增长)类型。
[0385]
非霍奇金淋巴瘤可源自b细胞和t细胞。如本文所用，术语“非霍奇金淋巴瘤”包括“b细胞”和“t细胞”非霍奇金淋巴瘤。b细胞非霍奇金淋巴瘤(nhl)包括伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(cll/sll)、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体b淋巴母细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。骨髓或干细胞移植后发生的淋巴瘤通常是b细胞非霍奇金淋巴瘤。
[0386]
t细胞淋巴瘤约占美国所有nhl的15％。t细胞淋巴瘤有许多不同的形式，例如血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤(aitl)，它是血液或淋巴管免疫母细胞的成熟t细胞淋巴瘤。t细胞淋巴瘤的其他形式涉及皮肤t细胞淋巴瘤和具有白血病播散的t细胞淋巴瘤。
[0387]
慢性淋巴细胞白血病(cll)也可以用本car进行治疗，是一种会导致未成熟白细胞(b淋巴细胞)缓慢增加的惰性(缓慢生长的)癌症。癌细胞通过血液和骨髓扩散，还会影响淋巴结或其他器官，例如肝脏和脾脏。cll最终导致骨髓衰竭。该疾病的另一种表现形式称为小淋巴细胞淋巴瘤，主要分布在次要淋巴器官，例如淋巴结和脾脏。
[0388]
多发性骨髓瘤是一种成熟浆细胞形态的b细胞恶性肿瘤，其特征为这些类型细胞的单个克隆的肿瘤性转化。这些浆细胞在bm中增殖并可能侵入邻近的骨骼，有时还会侵入血液。多发性骨髓瘤的变异形式包括显性多发性骨髓瘤、阴燃性多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、非分泌性骨髓瘤、igd骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、骨孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤。
[0389]
急性髓性白血病(aml)是一种血细胞髓系癌症，其特征是在骨髓和血液中中建立的异常细胞快速生长并干扰正常血细胞。aml的遗传风险似乎是存在的。aml中的恶性细胞是成髓细胞。在正常的造血过程中，成髓细胞是髓样白细胞的未成熟前体。正常的成髓细胞会逐渐成熟为成熟的白细胞。在aml中，单个成髓细胞会积累遗传变化，使细胞处于未成熟状态并阻止分化。单独的这种突变不会导致白血病，然而当与其他突变结合时，会破坏控制
增殖的基因，结果是未成熟细胞克隆不受控制的生长，从而导致aml。
[0390]
急性淋巴母细胞性白血病(all)是一种淋巴系血细胞癌症，其特征是大量未成熟淋巴细胞的发育。在大多数情况下，原因不明。可能存在遗传风险因素，环境风险因素可能包括辐射暴露或化疗。all中的癌细胞是淋巴母细胞。正常淋巴母细胞发育成成熟的抗击感染的b细胞或t细胞，也称为淋巴细胞。在all中，淋巴细胞的正常发育和对淋巴细胞数量的控制都变得存在缺陷。
[0391]
进一步的恶性血液病基本上包括血液中、血细胞或前体血细胞中的任何其他赘生物，例如任何给定的白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
[0392]
本文考虑的遗传修饰的细胞还提供了过继免疫疗法的改进方法，该方法用于治疗与不希望的免疫细胞增殖的存在相关的医学疾病，优选与自身抗体的产生相关的自身免疫疾病。
[0393]
在本发明的一种实施方式中，具有ebag9沉默的本文描述的t细胞旨在用于治疗自身免疫疾病，优选自身抗体依赖性自身免疫疾病，优选具有炎性组分的自身免疫疾病，由此，自身免疫疾病优选选自高安氏动脉炎，巨细胞动脉炎，家族性地中海热，川崎病，结节性多动脉炎，皮肤型结节性多动脉炎，肝炎相关性动脉炎，白塞氏综合征，韦格氏肉芽肿，anca血管炎，丘
‑
施二氏综合征(churg
‑
strauss syndrome)，显微镜下多血管炎、结缔组织病血管炎、hennoch
‑
紫癜、冷球蛋白血管炎、皮肤白细胞破碎性脉管炎、热带性主动脉炎、结节病、柯根综合征(cogan’s syndrome)、威斯科特
‑
奥尔德里奇综合征(wiskott
‑
aldrich syndrome)、麻风结节动脉炎、cns原发性脉管炎、闭塞性血栓性血管炎、副肿瘤性动脉炎(paraneoplasticateritis)、荨麻疹、德高病(dego’sdisease)、骨髓增生异常综合征、持久性隆起性红斑、高免疫球蛋白d、过敏性鼻炎、支气管哮喘、慢性阻塞性肺病、牙周炎、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、淀粉样变性、科隆病(morbus chron)、溃疡性结肠炎、自身免疫性肌炎、糖尿病、格林
‑
巴利综合征(guillain
‑
barre syndrome)、组织细胞增生症、骨关节炎、特应性皮炎、牙周炎、慢性鼻窦炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、显微镜结肠炎、肺纤维化、肾小球肾炎、惠普耳氏病(whipple’s disease)、斯提耳氏病(still’sdisease)、结节性红斑、耳炎、冷球蛋白血症、干燥综合征(sjogren’s syndrome)、红斑狼疮(优选系统性红斑狼疮(sle))、再生障碍性贫血、骨髓纤维化、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、木村氏病、系统性硬化症、慢性织脉周炎、慢性前列腺炎、特发性肺纤维化、慢性肉芽肿性疾病、特发性失弛缓症、博来霉素诱导的肺部炎症、阿糖胞苷诱导的肺部炎症、自身免疫性血小板减少、自身免疫性嗜中性粒细胞减少、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性淋巴细胞减少症、恰加斯氏病、慢性自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性肝炎、桥本氏甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎、格雷夫斯病(graves disease)、自身免疫性多腺体综合征、自身免疫性阿狄森综合征、寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、疱疹样皮炎、自身免疫性秃头症、白癜风、抗磷脂综合征、重症肌无力、僵硬综合征(stiff
‑
man syndrome)、古德帕斯彻氏综合征、交感性眼炎、毛囊炎、夏普综合征(sharpsyndrome)和/或伊文综合征(evans syndrome)，特别是枯草热、牙周炎、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎，最优选sle。
[0394]
系统性红斑狼疮(sle)也称为狼疮，是一种身体的免疫系统攻击身体各部位的健康组织的自身免疫性疾病。症状因人而异，可能从轻度到重度。常见症状包括关节疼痛和肿大、发热、胸痛、脱发、口腔溃疡、淋巴结肿大、感觉疲劳，以及最常见于脸上的红色皮疹。
[0395]
如本文所用，术语“个体”和“受试者”通常可互换使用，并且是指表现出可以用本文别处公开的基因治疗载体、基于细胞的治疗剂和方法治疗的疾病、病症或病况的症状的任何动物。在优选的实施方式中，受试者包括表现出可以用本文公开的基于细胞的治疗剂和方法治疗的造血系统的疾病、病症或病况(例如b细胞恶性肿瘤)的症状的任何动物。适合的受试者包括实验动物(例如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和家畜或宠物(例如猫或狗)。包括非人灵长类动物，并且优选包括人类患者。典型的受试者包括具有癌症恶性血液病，已被诊断患有恶性血液病或处在具有恶性血液病的风险中的人类患者。
[0396]
如本文所用，“治疗(treatment/treating)”包括对疾病或病理状况的症状或病理学的任何有益或期望的作用，并且可包括所治疗的疾病或病况的一种或多种可测量标记物的甚至最小的减少。治疗可任选地涉及疾病或病况的症状的减轻或改善，或疾病或病况的进展的延迟。“治疗”不一定表示完全根除或治愈疾病或病况或其相关症状。
[0397]
如本文所用，“防止(prevent)”和类似的词语，例如“防止(prevented/preventing)”或“预防(prophylactic)”等，表示防止、抑制或降低疾病或病况发生或复发的可能性的方法。它还指延迟疾病或病况的发作或复发，或延迟疾病或病况的症状的发生或复发。如本文所用，“防止”和类似词语还包括在疾病或病况发作或复发之前降低疾病或病况的强度、影响、症状和/或负担。
附图说明
[0398]
本发明通过以下附图举例说明。这些附图应当被认为是对潜在优选的实施方式提供进一步描述，这些实施方式增强了本发明的一个或多个非限制性实施方式的支持。
[0399]
附图的简要说明：
[0400]
图1：生成对靶向ebag9的mirna和gfp进行编码的逆转录病毒mp71。
[0401]
图2：用对不同的靶向ebag9的mirna进行编码的
‑
逆转录病毒载体转导后，jurkat细胞中人ebag9表达降低。
[0402]
图3：在体外功能测定之前对人原代t细胞进行逆转录病毒转导的实验时间表。
[0403]
图4：ebag9下调促进了颗粒酶a从活化的人cd8 t细胞中不依赖于抗原的释放。
[0404]
图5：mp71载体适用于同时表达靶向ebag9的mirna和car。
[0405]
图6：转导的原代人t细胞中的bcma和cd19 car表达。
[0406]
图7：可以通过下调ebag9增加bcma car t细胞的抗原特异性溶细胞活性。
[0407]
图8：通过沉默ebag9来提高car t细胞的细胞溶解活性是普遍适用的细胞生物学机制。
[0408]
图9：具有沉默的ebag9的体内工程化bcma car t细胞更有效地根除多发性骨髓瘤细胞。
[0409]
图10：crispr介导的ebag9敲除的靶位点验证。1
[0410]
附图的详细说明：
[0411]
图1：生成对靶向ebag9的mirna和gfp进行编码的逆转录病毒mp71。靶向ebag9的mirna是通过将内源性mirna
‑
155的发夹反义序列与预测的ebag9靶位点序列交换而产生的。将得到的mirna编码序列在内含子位置引入编码gfp的逆转录病毒mp71载体。(ltr：长末端重复序列；pre：翻译后调控元件；amp r：氨苄青霉素抗性；gfp：绿色荧光蛋白)。
[0412]
图2：用对不同的靶向ebag9的mirna进行编码的γ逆转录病毒载体转导后，jurkat细胞中人ebag9表达降低。用表达针对人ebag9的不同mirna的不同的编码gfp的载体对人jurkat细胞进行逆转录病毒转导。阳性转导的gfp 细胞通过荧光激活细胞分选(facs)进行富集，并通过蛋白质印迹进行分析。使用钙联蛋白(calnexin)作为加样对照。分析了1x10e6个jurkat细胞的裂解物。ut，未转导
[0413]
图3：在体外功能测定之前对人原代t细胞进行逆转录病毒转导的实验时间表。
[0414]
图4：ebag9下调促进了颗粒酶a从活化的人cd8 t细胞中不依赖于抗原的释放。使用编码sp6或bcma car与靶向ebag9的mirna h18结合的载体或单独编码bcma car的载体转导活化的人cd8 t细胞。在cd8 t细胞活化后第15天测量上清液中的酶活性。通过用抗人cd3和抗cd28抗体重新刺激t细胞4小时来诱导颗粒酶a释放。值以相对于总含量的百分比显示释放。棒代表每组n＝4个独立供体的n＝3次实验的平均值
±
sem。*p<0.05，**p<0.01，*p<0.001；ns，不显著。进行了配对t检验。
[0415]
图5：mp71载体适用于同时表达靶向ebag9的mirna和car。通过使用noti和ecori限制性位点，在指定位置将sp6、bcma或cd19 car引入到含mirna的mp71载体中。(ltr
‑
长末端重复序列；pre
‑
翻译后调控元件；amp r
‑
氨苄青霉素抗性；car
‑
嵌合抗原受体)
[0416]
图6：转导的原代人t细胞中的bcma和cd19 car表达。通过用抗人cd3和抗人cd28抗体刺激48小时来活化原代人t细胞。使用编码各自与靶向ebag9的mirna h18或h17结合的bcma(a
‑
b)或cd19(c
‑
d)car的载体转导人t细胞，进行了两次。细胞在il
‑
7/il
‑
15补充下培养。facs在培养的第6天进行，每组示出一个代表性实例。转导率以门控的百分比表示。
[0417]
图7：可以通过下调ebag9增加bcma car t细胞的抗原特异性溶细胞活性。(a
‑
b)通过用抗人cd3和抗人cd28抗体刺激48小时来活化人cd8 t细胞。使用单独编码sp6或bcma car的载体或编码sp6或bcma car与靶向ebag9结合的mirna h18的载体转导人cd8 t细胞，进行了两次。细胞在高il
‑
2补充下培养13天。在体外细胞毒性测定之前，car t细胞在低il
‑
2补充下培养48小时。在car t细胞培养的第15天进行体外细胞毒性测定。通过添加ut将转导率调整为20％
‑
30％。[
51
cr]铬标记的mm(a)和b
‑
nhl(b)细胞系与转导的人t细胞以不同的效应物/靶标比共培养4小时。数据代表平均值
±
sem误差棒，n＝5次实验以一式两份进行，每组有4
‑
8个不同的供体。*p<0,05，**p<0,01，***p<0,00.1；ns，不显著。使用了mann
‑
whitney u检验。
[0418]
图8：通过沉默ebag9来提高car t细胞的溶细胞活性是普遍适用的细胞生物学机制。通过用抗人cd3和抗人cd28抗体刺激48小时来活化人cd8 t细胞。使用单独编码sp6或cd19 car的载体或编码sp6或cd19 car与靶向ebag9的mirna h17结合的载体转导人cd8 t细胞，进行了两次。细胞在高il
‑
2补充下培养13天。在体外细胞毒性测定之前，car t细胞在低il
‑
2补充下培养48小时。在car t细胞培养的第15天进行体外细胞毒性测定。通过添加ut将转导率调整为15％。[
51
cr]铬标记的jeko
‑
1细胞系与转导的人t细胞以不同的效应物/靶标比共培养4小时。数据代表平均值
±
sem误差棒，n＝3次实验以一式两份进行，每组有3
‑
6个不同的供体。*p<0,05，**p<0,01，***p<0,00.1；ns，不显著。使用了mann
‑
whitney u检验。
[0419]
图9：具有沉默的ebag9的体内工程化bcma car t细胞更有效地根除多发性骨髓瘤细胞。(a)将nsg小鼠植入稳定表达gfp和萤火虫荧光素酶的1x10e7 mm.1s细胞。在第6天，通过ivis暴露150秒观察肿瘤接种。一天后，转移1x10e6 car 细胞(补充il
‑
7/il
‑
15培养的第
10
‑
13天)，通过ivis暴露60秒观察处理效率。(b)在一个实验中为每个组和时间点绘制从覆盖整个身体的感兴趣区域获得的生物发光信号强度的平均值
±
sem。(c)在第15天和第16天，处死动物，并通过流式细胞术定量骨髓中的cd138 gfp 肿瘤细胞。绘制了n＝2次实验的平均值
±
sem。*p<0,05，**p<0,01，***p<0,00.1；ns，不显著。使用了mann
‑
whitney u检验。
[0420]
图10：crispr介导的ebag9敲除的靶位点验证。(a)由7个外显子组成的人ebag9基因的示意图。设计了靶向外显子4中不同区域的六个引导rna(e1
‑
e6)。(b
‑
c)通过用人cd3/cd28免疫磁珠(dynabeads)刺激48小时活化原代人t细胞，然后用各引导rna(e1
‑
e6)和cas9蛋白电穿孔。在激活后的第9天，分别采集基因组dna和蛋白质样本用于分析基因编辑效率(b)或ebag9蛋白质表达水平(c)。示出了三个实验中的一个代表性蛋白质印迹。2
[0421]
实施例
[0422]
本发明通过以下公开的实施例进行说明。这些实施例为本发明的潜在优选的非限制性实施方式的更详细描述提供技术支持。
[0423]
实施例概要
[0424]
1.将靶向鼠或人ebag9的mirna克隆到逆转录病毒表达载体中，然后转导人或鼠cd8 t细胞。蛋白质印迹分析显示，人和小鼠cd138 t细胞中ebag9的敲低达到了>90％。
[0425]
2.用编码靶向ebag9的mirna的γ
‑
逆转录病毒进行抗原特异性鼠t细胞(多克隆)的转导，随后将它们过继转移到rag2
‑
ko小鼠中。这些小鼠用sv40大t抗原(肽iv)脉冲脾细胞进行攻击。在体内杀伤测定中，与未修饰的或对照t细胞相比，ebag9敲低的工程化t细胞在杀伤方面更有效。
[0426]
3.用编码靶向ebag9的mirna的γ
‑
逆转录病毒结合各car转导人t细胞。这些细胞用于体外细胞毒性测定，其中靶细胞表达所选car的同源抗原。当car阳性t细胞频率较低(<30％)时，我们获得了增强的对表达bcma或cd19的靶细胞的细胞溶解。
[0427]
4.用编码靶向ebag9的mirna的γ
‑
逆转录病毒结合抗bcma car转导人t细胞。将多发性骨髓瘤细胞系mm.1s移植到nsg小鼠，并通过ivis成像测量肿瘤发作。然后用表达对照car、常规bcma car和共表达靶向人ebag9的mirna的工程化bcma car的t细胞处理这些小鼠。在car t细胞施用后14天测量肿瘤进展。car t细胞的数量保持在较低水平，以更好地识别少数溶细胞强度增强的t细胞的性能。具有沉默ebag9的mirna的抗bcma car t细胞在肿瘤控制方面具有优势，并导致从骨髓中完全根除肿瘤细胞。
[0428]
逆转录病毒载体设计
[0429]
克隆和mirna序列
[0430]
为了沉默人ebag9，生成了不同的靶向人ebag9基因的开放阅读框内的区域的mirna。使用四种不同的靶位点预测程序进行mirna设计，其反映了内源性rnai机制识别合适的目标位点的要求(wisirna、blockit、sidesign、oligowalk)。mirna二级结构对于rnai机制的识别和加工很重要。mirna结构的性能特征是相当非结构化的骨架和编码反义序列的高度碱基配对的发夹。
[0431]
为了生成靶向ebag9的mirna，使用了内源性mirna
‑
155。将发夹结构中含有21个核苷酸的反义序列与预测的ebag9靶位点序列交换(表1)。表1：针对人ebag9基因的发夹序列。1
[0432]
表1：针对人ebag9基因的发夹序列。1
[0433][0434]
使用mlui和nsii限制性位点将得到的mirna编码序列在内含子位置引入编码gfp的逆转录病毒mp71载体。mp71载体以在原代t细胞中的高转导效率和稳定的转基因表达而已知。由于mirna转录受聚合酶ii启动子调节，因此mp71的高活性5'ltr可用于驱动mirna和转基因表达。
[0435]
靶向ebag9的mirna的敲低效率
[0436]
在人急性t细胞白血病细胞系jurkat j76中测试了在蛋白质水平上mirna介导的ebag9下调的效率。与未转导的t细胞(ut)相比，可以检测到h16、h17和h18的ebag9敲低效率约为80％。相比之下，h19没有实现ebag9蛋白下调。不含mirna的mp71
‑
gfp载体用作对照。选择最有效的mirna h17和h18用于在原代人t细胞中进行进一步分析。
[0437]
应用例：
[0438]
从健康自愿供体中分离出人外周血单核细胞(pbmc)，并通过磁性细胞分离(负选择)富集cd8 t细胞。通过用抗人cd3和抗人cd28抗体刺激48小时来活化cd8 t细胞。然后对活化的人cd8 t细胞进行两轮逆转录病毒转导，并在高il
‑
2(100iu/ml)和il
‑
15补充(10ng/ml)下进行培养。在cd8 t细胞活化后的第13天，将细胞因子补充降至10iu/ml il
‑
2和1ng/ml il
‑
15。48小时后进行功能测定(图3)。为了确定颗粒酶a的活性，将人car t细胞(活化后第15天)用板结合的抗人cd3和抗人cd28抗体再刺激4小时。通过与颗粒酶a底物溶液一起温育来分析上清液的颗粒酶a活性。产物浓度与酶活性相关。将car t细胞的上清液转移到未包被的板上，用作颗粒酶a基础分泌的对照。
[0439]
为了证明ebag9沉默会增加效应分子(如颗粒酶a)从活化的t细胞中的释放，进行了体外释放试验。来自健康供体的cd8 t细胞被分离、转导两次，并在高il
‑
2补充下培养13天。在第15天进行的功能性体外测定之前，将il
‑
2补充降低48小时。在培养的第15天，通过用抗人cd3/cd28抗体重新刺激t细胞4小时来诱导颗粒酶a释放。从bcma car转导的t细胞中释放的颗粒酶a的量与ut相似。相比之下，用h18
‑
bcma car构建体转导的t细胞释放了2倍量的颗粒酶a。同样，h18 mirna也使sp6 car t细胞的溶细胞效应分子分泌增强(图4)。
[0440]
同时表达靶向ebag9的mirna和car
[0441]
克隆
[0442]
为了生成允许同时表达ebag9特异性mirna和car的逆转录病毒载体，使用gfp侧翼的noti和ecori限制性位点将编码mirna的mp71
‑
gfp载体的gfp基因交换为car盒。使用该策略，克隆了编码ebag9特异性mirna h18和bcma car的逆转录病毒载体以及编码ebag9特异性mirna h17和cd19 car的逆转录病毒载体(图5)。作为功能测定的阴性对照，不含任何天然存在的配体的sp6 car与靶向ebag9的mirna h17和h18相结合。
[0443]
car表达
[0444]
使用单独编码bcma或cd19 car的mp71载体或编码bcma或cd19 car与ebag9特异性mirna h18或h17结合的mp71载体分别对抗人cd3/cd28激活的原代人t细胞进行逆转录病毒
转导，进行了两次。细胞在il
‑
7和il
‑
15补充下培养。在第6天对igg铰链区进行染色，以分析car表达并确定转导效率(图6)。
[0445]
体外应用例
[0446]
进行体外细胞毒性测定以研究ebag9下调对car t细胞的抗原特异性溶细胞能力的影响。体外溶细胞活性报告了颗粒酶和穿孔素的释放，这是一种由ebag9控制的分泌过程。
[0447]
来自健康供体的cd8 t细胞被分离，用抗人cd3和抗cd28抗体活化48小时，转导两次，并在高il
‑
2补充下培养13天。在第15天进行的体外细胞毒性测定之前，将il
‑
2补充降低48小时。在第15天，将car t细胞与靶细胞系共培养4小时。对测定上清液的由裂解的靶细胞释放的[
51
cr]
‑
铬进行计数。靶细胞最大释放通过直接计数标记细胞来确定。通过单独温育靶细胞来测量自发释放。
[0448]
高表达bcma的多发性骨髓瘤(mm)细胞系opm
‑
2以及低表达bcma的b细胞非霍奇金淋巴瘤(b
‑
nhl)细胞系dohh
‑
2被用作bcma car t细胞的靶细胞。在培养的第15天与car t细胞共培养之前，将靶细胞与[
51
cr]
‑
铬一起培养。以不同的效应物/靶标比共培养4小时后，在bcma car转导的cd8 t细胞中观察到溶细胞活性，而在ut或sp6 car t细胞中没有或几乎没有检测到活性。因此，在ebag9下调后没有发生非特异性t细胞激活。在80:1的最高效应物/靶标比下，bcma car t细胞的靶细胞裂解率约为30％。h18
‑
bcma car t细胞中bcma car与ebag9沉默的组合导致所有测试的细胞系中car t细胞介导的溶细胞效率显著增加。例如，在mm细胞系opm
‑
2中，h18
‑
bcma car t细胞的裂解率是仅bcma car的裂解率的约1.5倍。在不同的计算中，bcma car转导的t细胞(e:t 80:1)的最大杀伤率可以通过仅四分之一到八分之一的ebag9敲低bcma car t细胞来实现。因此，有效剂量水平显著降低。
[0449]
为了证实rnai介导的car t细胞毒性活性增加，在cd19 car中使用了另一种mirna序列h17。h17靶向与h18相同的ebag9基因开放阅读框内的区域。对于bcma car，进行了体外细胞毒性测定。使用ut将逆转录病毒转导的cd8 t细胞的转导率调整到15％左右。高表达cd19的b
‑
nhl细胞系jeko
‑
1在铬释放测定中用作靶细胞。共培养4小时后，几乎检测不到ut和对照h17
‑
sp6 car t细胞的裂解活性。在jeko
‑
1细胞中，cd19 car转导的t细胞实现了约20％(e:t 80:1)的特定靶细胞裂解。与之前的结果一致，ebag9沉默使car t细胞在杀伤活性方面有了实质性的提高。rnai介导的t细胞工程化导致细胞毒性增加2倍。此外，对于实现cd19 car t细胞对jeko
‑
1细胞的最大裂解，仅需要五分之一到八分之一的h17
‑
cd19 car t细胞(图8)。
[0450]
体内应用例
[0451]
为了将体外功能测定的结果转化为体内模型，建立了多发性骨髓瘤异种移植模型。用于人多发性骨髓瘤细胞系和原代人car t细胞的异种移植的合适动物模型是免疫缺陷nod scidγ
‑
链缺陷(nsg)小鼠品系。这些小鼠没有成熟的t细胞或b细胞。此外，nk细胞分化被阻断。用表达bcma的多发性骨髓瘤细胞系mm.1s接种nsg小鼠。通过稳定表达萤火虫荧光素酶
‑
egfp构建体的mm.1s细胞系的生物发光成像监测肿瘤进展。转移后6天通过ivis成像检测到肿瘤细胞植入。在用il
‑
7/il
‑
15补充培养的第10
‑
13天，一天后静脉注射单次剂量的1x10e6个car t细胞。肿瘤发展之后进行连续ivis成像，直到转移后第14天。在第15
‑
16天处死小鼠。通过流式细胞术分析骨髓中剩余肿瘤细胞和car t细胞的数量。
[0452]
连续ivis成像显示第6天至第14天肿瘤快速生长。与肿瘤活性相关的最高特异性荧光素酶信号可以定位于骨髓。用非靶向h18
‑
sp6 car t细胞治疗无法控制肿瘤生长。在该组的小鼠中观察到最高的肿瘤负荷。因此，由于ebag9沉默和随后增加的效应分子释放能力，没有不依赖于抗原的t细胞活化。用bcma car t细胞处理的小鼠的肿瘤进展较小。然而，这种低数量的效应car t细胞的临床疗效是适度的。相比之下，接受h18
‑
bcma car t细胞的小鼠几乎没有显示肿瘤信号(图9a
‑
b)。因此，当分析骨髓中的肿瘤细胞数量(gfp cd138 )时，骨髓瘤细胞归巢的主要生态位，即肿瘤细胞定量揭示h18
‑
sp6 car对照组的数量是bcma car组的2倍。值得注意的是，用bcma car t细胞中rnai介导的ebag9沉默处理的小鼠中几乎不存在肿瘤细胞。总而言之，即使在低效应细胞数量下，rnai介导的ebag9下调也会导致抗肿瘤效率大大提高(图9c)。
[0453]
crispr介导的ebag9敲除
[0454]
在上面的实施例中，ebag9下调是通过用允许表达ebag9特异性mirna的逆转录病毒载体转导细胞来证明的。此类载体还用于在转导的t细胞中同时表达ebag9 mirna和抗原特异性car构建体。在体外和体内都证明了ebag9下调的car t细胞的溶细胞能力增强。
[0455]
为了补充上述实施例，已经评估了下调ebag9的其他方法。以下实施例使用crispr介导的ebag9敲除，证明了ebag9可以通过crispr从处理过的t细胞中被有效去除或减少，从而实现在细胞毒性t细胞中抑制ebag9的其他手段。
[0456]
产生了靶向人ebag9基因的外显子4的不同引导rna(grna)(e1
‑
e4)，以敲除原代人t细胞中的ebag9。从健康自愿供体中分离出人外周血单核细胞(pbmc)，并通过人抗cd3/cd28 dynabeads的刺激活化cd3 t细胞。然后用grna和cas9蛋白对活化的人cd3 t细胞进行电穿孔，并在il
‑
2补充下进行培养。在cd3 t细胞活化后的第9天，分离出基因组dna并产生蛋白质裂解物。通过tide分析(通过分解跟踪插入缺失)以及ebag9蛋白质水平的蛋白质印迹分析对ebag9基因座中的基因编辑效率进行分析，结果表明grna的e2、e4和e6的敲除效率为50％。相比之下，grna的e1、e3和e5的内源性ebag9表达水平仅略有下降。用非靶向grna电穿孔的cd3 t细胞作为对照(ctl)。结果如图10所示。因此，crispr介导的基因编辑可以靶向人ebag9基因座，并代表了在表达转基因抗原靶向构建体的细胞毒性t细胞中抑制ebag9的可行手段。
[0457]
研究crispr介导的ebag9基因编辑对car t细胞的抗原特异性溶细胞能力的影响的体外细胞毒性测定正在进行中，预计通过颗粒酶和穿孔素的释放证明此类ebag9
‑
crispr编辑的car t细胞的溶细胞活性增强，正如mirna介导的ebag9下调所示，如上所述。