达克利司在制备抗肺纤维化药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及达克利司(dactolisib)在制备抗肺纤维化药物中的应用。


背景技术：

2.转化生长因子
‑
β属于tgf
‑
β超家族其中的一员，从胚胎发育早期到成熟组织的维持和再生以及许多发育和退行性疾病中起着关键作用。tgf
‑
β是目前研究最为广泛的促纤维化因子之一，是肺纤维化中的关键因子。tgf
‑
βi型受体具有atp结合区，而显得更加具有可调控性，i型受体被激活后，激酶才是有活性的。吡非尼酮(pirfenidone)于2011年9月获得我国sfda的新药证书，并于2014年获得美国食品药品监督管理局(fda)批准上市。在博来霉素诱导的特发性纤维化小鼠模型中，与对照组相比吡非尼酮可以降低肺泡灌洗液中的tgf
‑
β含量，使tgf
‑
β表达水平下降三分之一。临床上，吡非尼酮也显示出较为显著的延缓肺纤维化进展的作用。但是因为参与观察的临床病例数有限，其抗肺纤维化的效果还需要进一步评估，且有光过敏反应等较多副作用，加上价格昂贵，导致其在临床上的应用受到很大限制，因而抗肺纤维化新药研究一直都是目前新药研发的热点。而目前以抑制tgf
‑
β受体的酶活性从而实现抗肺纤维化的tgf
‑
β受体抑制剂类药物临床上还没有出现。
3.一种新药的上市平均需要花费大量的时间和研发成本，并且要经过国家食品和药物管理局等部门以及其他监管机构严格的安全性测试。很多新药的研发都是因为其安全性问题被最终放弃。老药新用，顾名思义就是一些原有的药物在被发现全新的医疗价值之后可以被用来治疗其他疾病的观点。一些“老药”在偶然间被发现除了能治疗对应症状的疾病外，还对其他疾病产生不俗的治疗效果，而且副作用很低。因此这种能够快速高效地为现有药物找到新的用武之地的创新性方法越来越受到众多国际制药企业重视和采用。
4.虚拟筛选(vs)是一种计算方法，可搜索化合物的数据库以识别具有所需生物活性的新型小分子。分子对接是虚拟筛选的一项核心技术，旨在预测两个或多个组成分子之间形成的复合物的结构。虚拟筛选的基本步骤包括：受体模型的建立；小分子化合物库的建立；服务器虚拟筛选；命中化合物的后处理。虚拟筛选的目的是从现有药物数据库中，发现有潜在抑制某蛋白靶点的活性的化合物，节省大量的时间。
5.达克利司(英文名称，dactolisib)，结构式如(i)所示。
[0006][0007]
达克利司化合物的分子式为c
30
h
23
n5o，粉末状，分子量为469.55，cas编号为915019
‑
65
‑
7。目前已知它是一种双重atp竞争性pi3k和mtor抑制剂，主要用做作抗肿瘤药。


技术实现要素：

[0008]
基于上述，本发明通过老药新用的方法进行tgf
‑
βi型受体的atp竞争性抑制剂药物的计算机虚拟筛选以及在细胞和酶活水平进行了药物实验，能够对以tgf
‑
β受体为靶点的新药研发提供实验基础，以满足抗肺纤维化效果以及治疗或/和预防过量tgf
‑
β引起的相关疾病。
[0009]
本发明采用的技术方案是：达克利司单用或与其他药物联用在制备以tgf
‑
βi型受体为靶点的药物中的应用。
[0010]
进一步的，达克利司单用或与其他药物联用在制备治疗以tgf
‑
βi型受体为靶点的抗肺纤维化药物中的应用。
[0011]
进一步的，达克利司单用或与其他药物联用在制备治疗合并癌症的以tgf
‑
βi型受体为靶点的肺纤维化药物中的应用。
[0012]
本发明的有益效果是：
[0013]
1、本发明提供了达克利司的新用途，即达克利司在制备以tgf
‑
βi型受体为靶点的药物中的应用属于老药新用，该药物在抗肺纤维化方面也具有重要的应用价值和意义。
[0014]
2、本发明通过前期药物筛选研究，发现达克利司为tgf
‑
βi型受体的酶抑制剂，因而推测其可以做为新型抗肺纤维化药物发挥作用。本发明中，利用hek293细胞实验证明，达克利司可以在细胞水平抑制tgf
‑
β诱导的细胞增殖。在酶活水平上，可以抑制tgf
‑
βi型受体介导下游细胞信号转导通路的活性。因此，达克利司可以作为tgf
‑
βi型受体的有效抑制剂。具体应用时，可以直接将达克利司作为治疗药物用于治疗肺纤维化。
[0015]
3、本发明表明，与tgf
‑
βi型受体的抑制剂sb431542比较，达克利司的抑制能力与其相当。
附图说明
[0016]
图1a是atp与tgf
‑
βi型受体的结合情况。
[0017]
图1b是达克利司与tgf
‑
βi型受体的结合情况。
[0018]
图2a是sb431542和达克利司分别与tgf
‑
βi型受体动力学模拟的rmsd图。。
[0019]
图2b是atp、sb431542和达克利司分别与tgf
‑
βi型受体的结合模式图。
[0020]
图3a是sb431542和达克利司分别对hek293细胞增殖活性及形态的影响。
[0021]
图3b是sb431542和达克利司分别刺激导致hek293细胞增殖活性降低。
[0022]
其中，##：与正常组相比，tgf
‑
β诱导组具有统计学差异(p<0.01)，*：与tgf
‑
β诱导组比较，药物组具有统计学差异(p<0.05)。n＝3mean
±
sd,*：p<0.05,**:p<0.01,***：p＜0.001。
[0023]
图4a是pgmsmad
‑
lu质粒图谱。
[0024]
图4b是pgmr
‑
tk质粒图谱。
[0025]
图4c是sb431542(a)和达克利司(b)刺激导致tgf
‑
βi型受体活性降低。
[0026]
其中，##：与正常组相比，tgf
‑
β诱导组具有统计学差异(p<0.01)，*：与tgf
‑
β诱导组比较，药物组具有统计学差异(p<0.05)。n＝3mean
±
sd,*：p<0.05,**:p<0.01,***：p＜0.001。
[0027]
图4d是sb431542和达克利司分别对tgf
‑
βi型受体的抑制率。
具体实施方式
[0028]
sb431542结构式如(ii)所示。该化合物的分子式为c
22
h
16
n4o3，浅黄色粉末，分子量为384.39，cas编号为301836
‑
41
‑
9。它是一种有效的、选择性的tgf
‑
βi型受体的抑制剂，ic
50
值为94nm。以sb431542为阳性对照，进行以下实验。
[0029][0030]
实施例1针对tgf
‑
βi型受体的atp竞争性抑制剂进行的虚拟筛选
[0031]
在pdb数据库中下载tgf
‑
βi型受体结构(pdbid：3tzm)并使用gromacs软件对结构进行优化，接下来使用autodock vina软件将atp小分子结构与优化后的tgf
‑
βi型受体结构进行分子对接，以确定atp结合口袋作为活性区域(如图1a)。利用活性区域进行虚拟筛选并记录筛选结果。按照三个步骤过滤筛选出的候选药物，第一步按照autodock vina软件预测结合能的顺序筛选出排名前60个小分子结构。第二步使用autodock 4和autogrid 4软件对60个小分子分别进行精确对接并对对接结果进行成簇分析。综合考虑预测的结合能、预测ki值、成簇分析结果及药物相关使用信息等，筛选出tgf
‑
βi型受体的atp竞争性抑制剂(表1)。第三步使用autodock vina将筛选出的药物小分子与tgf
‑
βi型受体分别进行5000次的精确对接，确定各复合物初始构象(如图1b)。
[0032]
表1 atp、sb431542和达克利司binding energy和ki值
[0033][0034]
由图1a、图1b和表1的数据，可初步判断达克利司具有潜在抑制tgf
‑
βi型受体活性。
[0035]
实施例2达克利司对tgf
‑
βi型受体活性抑制的机制
[0036]
方法：使用namd和vmd软件进行分子动力学模拟并进行了rmsd分析，结果如图2a。由图2a结果表明，各复合物体系在经过50ns的动力学模拟之后都趋于稳定。
[0037]
使用ambertools 18的mm
‑
gbsa方法对受体与候选药物的结合自由能进行了计算以便于预测达克利司与tgf
‑
βi型受体的结合潜力，结果如表2。
[0038]
表2 atp、sb431542和达克利司与tgf
‑
βi型受体结合自由能
[0039][0040]
表2结果表明，与sb431542相比，达克利司可能具有更好的竞争性抑制tgf
‑
βi型受体与atp结合的作用。
[0041]
使用ligplot和pymol软件共同分析结合模式，结果如图2b。图2b结果表明，底物atp与受体的作用是与ile13，val21，lys15,gly16,arg17,asp153,lys139,leu142,ser89,asp92,gly88,tyr84发生相互作用，与其中的ser89，asp92和lys139产生氢键作用。从sb431542和达克利司与tgf
‑
βi型受体结合的相互作用来看，它们产生疏水作用和氢键作用的残基范围以及结合位置基本相同，提示达克利司与atp和tgf
‑
βi型受体的结合中心一致，具有高度相似的结合方式，暗示其可能与atp具有较强的竞争性抑制作用。
[0042]
综合分析图2a、图2b和表2结果，得出达克利司具有与tgf
‑
βi型受体的atp结合口袋较强结合潜力。
[0043]
实施例3达克利司对tgf
‑
β诱导的hek293细胞增殖的抑制
[0044]
1、将生长状态良好的hek293细胞接种到96孔板上进行培养，分别添加达克利司和sb431542刺激细胞4h后，使用tgf
‑
β诱导24h后，在显微镜下观察，结果如图3a所示。图3a表明，与溶剂组dmso组相比，tgf
‑
β/dmso组细胞数量显著增多，而加入不同剂量的达克利司或sb431542组的细胞数量与tgf
‑
β/dmso组相比显著减少，说明不同浓度的达克利司或sb431542都可以抑制tgf
‑
β诱导的细胞增殖。
[0045]
2、采用cck
‑
8实验对达克利司和sb431542对tgf
‑
β诱导的hek293细胞活性进行定量性的分析，结果如图3b所示。图3b表明，与对照组相比，加入tgf
‑
β的细胞活性显著增强，阳性对照药sb431542在1μmol/l和10μmol/l的浓度时显示出显著的抑制效果。与此相似，加入达克利司后，在所使用的0.1μmol/l，1μmol/l和10μmol/l的三个剂量组中，细胞活性均受到非常明显的抑制，并且它们的抑制效果随浓度递增而变强，呈现出明显的剂量依赖性的方式。这些结果暗示它们可能通过抑制tgf
‑
β信号通路来影响tgf
‑
β所诱导的hek293细胞的增殖。
[0046]
实施例4达克利司对tgf
‑
βi型受体酶活水平的影响
[0047]
在对hek293细胞共转染pgmsmad
‑
lu质粒(图4a)和pgmr
‑
tk质粒(图4b)后，使用sb43152和达克利司分为0.1μmol/l和1μmol/l两个浓度梯度刺激并加入终浓度为10μg/l的
tgf
‑
β诱导细胞。使用双荧光素酶报告基因试剂盒通过检测萤火虫荧光素酶的相对表达情况，来分析药物对tgf
‑
βi型受体活性的抑制强度。如图4c所示，与空白对照组相比，tgf
‑
β/dmso组的萤火虫荧光素酶表达组的荧光显著增加，说明hek293细胞在tgf
‑
β的刺激下tgf
‑
β/smad信号通路活跃程度显著提高。而加入sb431542和达克利司之后，萤火虫荧光素酶表达组的相对荧光信号强度显著减弱。药物对tgf
‑
βi型受体的抑制率计算公式如下：
[0048]
抑制率(％)＝(rlu
溶剂组
‑
rlu
给药组
)/rlu
溶剂组
×
100％
[0049]
对抑制率的计算结果如图4d所示，达克利司在0.1μmol/l、1μmol/l两个浓度下对萤火虫荧光素酶表达的荧光强度的抑制率分别为32.8％和48.0％。总体来说，与sb431542相比，达克利司具有相近的tgf
‑
βi型受体抑制能力。实验结果充分证明，达克利司在hek293细胞水平可以直接通过抑制tgf
‑
βi型受体进而抑制tgf
‑
β/smad信号转导通路。