一种药辅一体仿生玉米醇溶蛋白纳米粒及其制备方法与流程

1.本发明属于纳米粒载药系统技术领域，具体涉及一种药辅一体仿生玉米醇溶蛋白纳米粒及其制备方法。


背景技术：

2.玉米醇溶蛋白(zein)又称玉米阮，系世界各大洲广泛种植的农作物玉米中含量较高的蛋白，是可在乙醇中溶解的蛋白总和，分布于胚乳中，约占47％(％干基，w/w)。组成氨基酸中缺乏带电氨基酸和极性氨基酸，因此不溶于水；缺乏人体必需氨基酸赖氨酸和色氨酸，营养价值不高。但天然来源的zein具有安全廉价、可生物降解、生物相容性好等特点，最早即用作片剂包衣材料。
3.根据其提取方法和分子量大小，可分为α、β、δ、γ
‑
zein。目前玉米阮商业上的主要产品α
‑
zein，溶于50～95％异丙醇溶液，但不溶于30％异丙醇，在sds
‑
page电泳上有两个条带z19和z22，即分子量分别为19 000da和22 000da。研究者对其结构提出了两种模型，一种α
‑
zein分子的二级结构由9个α
‑
螺旋反平行排列，组成同源重复螺旋聚合的扭曲圆筒状结构；另一种则是α
‑
螺旋呈反向平行串联结构模型，长度13nm，以长短轴比为6：1不对称拉长分子结构存在，见图1。两种模型中提及的α
‑
螺旋均通过富含谷氨酰胺的转角结构连接，或疏松的分子内氢键稳定，形成两头亲水(谷氨酰胺)、侧面高度疏水的结构。zein的两亲性特点可引起有序聚集并延伸其结构。
4.wang等对zein自组装结构和机理的研究表明，乙醇开始蒸发时，溶剂极性逐渐增加，zein的结构从α
‑
螺旋结构转向β
‑
折叠结构。随着蒸发的继续，β
‑
折叠由于疏水作用反向排列成长带状结构，之后卷曲为圆盘，层层向中间聚集，直至填充满整个结构，见图2。
5.天然植物蛋白zein由于其来源广泛、产量巨大，且具有生物相容性、可降解性，使其在医药、食品、化妆品等方面的应用开展了广泛研究。近年来在药物传递系统中的作用得到越来越多的关注，尤其是其自组装性、生物粘附性、抗胃酸分解等特性。有报道将其制成载药微球、纳米粒、凝胶、膜剂等，用于抗蛔虫药、抗肿瘤药物和抗凝血剂等的运输实现药物的可控释放。
6.zein易于与其它化合物形成复合物或共轭化合物，有利于控制药物释放，非常适合于口服控释系统。但制成的纳米颗粒存在载药量低，稳定性差等问题。


技术实现要素：

7.发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了一种药辅一体仿生玉米醇溶蛋白纳米粒及其制备方法，所得纳米粒载药量高，促吸收效果好。
8.技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：
9.一种药辅一体仿生玉米醇溶蛋白纳米粒，所述纳米粒主要是由玉米醇溶蛋白和胆固醇结构类似物制成的纳米递药系统。
10.优选的，所述玉米醇溶蛋白和胆固醇结构类似物所占的重量百分比如下：
11.玉米醇溶蛋白61.5～90.9％、胆固醇结构类似物38.5～9.1％。
12.优选的，所述胆固醇结构类似物选自齐墩果酸、熊果酸中的任意一种或几种的组合物。
13.所述的药辅一体仿生玉米醇溶蛋白纳米粒的制备方法，采用溶解分散
‑
蒸发法制备。
14.优选的，所述的药辅一体仿生玉米醇溶蛋白纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
15.取胆固醇结构类似物完全溶解于乙醇溶液中，再加入玉米醇溶蛋白，加热搅拌至澄清，缓慢分散至纯化水中，搅拌均匀，蒸发除去乙醇，微孔滤膜过滤，即得。
16.进一步优选的，所述胆固醇结构类似物选自齐墩果酸、熊果酸中的任意一种或几种的组合物。
17.进一步优选的，所述乙醇溶液的浓度为80％～95％。
18.进一步优选的，所述胆固醇结构类似物与玉米醇溶蛋白的比例为1:10～1:2。
19.进一步优选的，采用旋转蒸发法除去乙醇。
20.进一步优选的，采用0.45μm微孔滤膜过滤。
21.脂蛋白(lipoprotein)是普遍存在于血管中进行脂质运输的生物复合体，主要由载脂蛋白、磷脂层和胆固醇等组成。其中尺寸最小，密度最大的是高密度脂蛋白(high
‑
density lipoprotein，hdl)，蛋白含量最高，主要参与了胆固醇的逆向转运过程，将外周细胞中的胆固醇逆向输送到肝脏进行代谢。新生hdl为盘状结构；成熟的hdl为球形，胆固醇酯和甘油三酯构成其疏水性核，磷脂单层结构，载脂蛋白(主要是apoa
‑
i及apoa
‑
ii)镶嵌于表面，形成脂质
‑
蛋白复合纳米粒子。新生盘状hdl通过摄取细胞中的胆固醇，再由胆固醇酰基转移酶快速酯化为胆固醇酯从而转变为球形hdl。
[0022][0023]
由此根据hdl的“脂质
‑
蛋白复合粒子”的构造及其“新生盘状hdl吸收胆固醇转变为球形hdl”的成熟过程的启发，本发明利用齐墩果酸(oa)、熊果酸(ua)等为代表的药物结构与胆固醇相似的特点，及具有可生物降解、水不溶、两亲性特征的植物蛋白玉米阮(zein)自组装机理，盘状zein吸收oa或ua等药物形成球形纳米粒，构建药辅一体的玉米醇溶蛋白仿生纳米粒。
[0024]
有益效果：相对于现有技术，本发明提供了一种新的药辅一体的仿脂蛋白构造的玉米醇溶蛋白纳米给药系统，该给药系统对于胆固醇结构类似物如齐墩果酸、熊果酸等药物具有较高的载药能力，并且具有良好的增溶、促进药物吸收等作用。
附图说明
[0025]
图1为zein的分子结构模型；a：argos et al；b：matsushima et al；
[0026]
图2为zein从单个分子自组装过程；a：α
‑
螺旋,b：β
‑
折叠，c：压缩，d：带状，e：卷曲为盘状；
[0027]
图3为oa
‑
zein的afm图；
[0028]
图4为oa
‑
zein的dsc图谱；
[0029]
图5为oa
‑
zein的释放曲线；
[0030]
图6为纳米粒的细胞毒性考察(n＝3)；
[0031]
图7为不同肠段ka与papp的比较：a.三种制剂在不同肠段的k
a
；b三种制剂在不同肠段的p
app
。
具体实施方式
[0032]
下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。
[0033]
实施例1给药载体的构建及表征
[0034]
1、给药载体的构建：
[0035]
精密称取适量的齐墩果酸(或熊果酸，熊果酸与齐墩果酸)完全溶解于适宜浓度(80％～95％)乙醇溶液中，再加入处方量的玉米醇溶蛋白(药物与zein的比例由1:10～1:2)，水浴加热下磁力搅拌至澄清。将上述载药的玉米醇溶蛋白乙醇溶液缓慢分散至纯化水中，搅拌均匀。旋转蒸发除去乙醇，0.45μm微孔滤膜过滤即得。
[0036]
2、oa的含量测定方法：
[0037]
采用hplc法测定。色谱条件c18色谱柱(4.6
×
250mm，5um)，流动相为甲醇
‑
水，比例为95：5，流速1ml/min，柱温25℃，检测波长210nm，进样量20ul。
[0038]
包封率测定方法：精密量取制的的oa
‑
zein纳米粒1ml，加甲醇定容至25ml，经0.45μm微孔滤膜过滤后进样测定。
[0039][0040]
载药量测定方法：精密称取适量的oa
‑
zein冻干品，加甲醇超声萃取，定容至10ml。经0.45μm微孔滤膜过滤后进样测定。
[0041][0042]
3、载药工艺优化：
[0043]
采用星点面效应面法优选处方工艺，以齐墩果酸和zein的比例(a)、醇水比例(b)、oa的浓度(c)为考察因素，以包封率(ee)为主要考察指标进行工艺优化。
[0044]
表1星点面效应面法优化oa
‑
zein处方因素及水平
[0045][0046]
采用design
‑
expert进行数据分析，以粒径在一定范围内，电位相对较高，包封率
高为目标可得
[0047]
ee＝132.94052 37.89411*a 7.32742*b
‑
12.34225*c
[0048]
zeta potential＝
‑
1.124
‑
72.52*a 168.32*b 4.07*c
‑
5.49*ab 3.04*ac
‑
7.40*bc 40.44*a2‑
130.84*b2‑
0.12*c2[0049]
diameter＝83.99
‑
10.57*a 66.04*b 8.04*c。优选出最佳处方为oa:zein以0.53，醇水按3.8:10，oa浓度为6.06mg/ml。制备所得纳米粒平均粒径142.5
±
1.6nm，平均电位30.4
±
1.7mv，包封率为79.9
±
2.4％，平均载药量为24.5
±
1.8％。与预测值为包封率81.29％，zeta电位28.6mv，粒径153.78nm相比结果基本一致。
[0050]
优化后oa
‑
zein在原子力显微镜下纳米粒形态如图3所示，纳米粒表面光滑，粒径为114.7
±
10.5nm，与马尔文粒径测定结果相比稍偏小，可能与其测定时失去水分有关。差示扫描热分析图谱如图4所示。齐墩果酸与玉米醇溶蛋白仍保留有各自的吸热峰，而形成oa
‑
zein纳米粒后，齐墩果酸峰消失，说明齐墩果酸被包裹或以分子或无定形分散于玉米醇溶蛋白载体中。
[0051]
实施例2给药载体的性能考察
[0052]
采用上述最佳处方：oa:zein为0.53，醇水比为3.8:10，oa浓度为6.06mg/ml，按照实施例1方法制备oa
‑
zein纳米粒，进行如下考察。
[0053]
1、体外释放行为
[0054]
分别取载药仿生纳米粒和原药物，以齐墩果酸计均为5mg，放入到预先处理好的透析袋(截留相对分子质量为7000～14000)中，并将透析袋置于200ml释放介质中(含有0.5％的sls)，于(37
±
0.5)℃的恒温水浴振荡(100r/min)，分别于1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h取样1ml，并补充同温等量释放介质。样品用0.45μm微孔滤膜滤过，hplc测定药物含量后进行计算，累积释放百分率与时间关系见图5。
[0055]
结果表明oa
‑
zein在oa的漏槽条件下能维持较长时间稳定，不易发生泄露。
[0056]
2、caco
‑
2细胞中的生物转运
[0057]
采用mtt法进行细胞毒性试验，结果如图6所示，按质量浓度5～500μg/ml。结果表明实验范围内，细胞存活率均在95％以上，载药纳米粒与空白纳米粒对于细胞增殖的影响与对照组趋于接近，说明该药辅一体的玉米醇溶蛋白纳米粒具有较低的细胞毒性，生物安全性良好。
[0058]
caco
‑
2细胞株接种于transwell板上，至teer值>450ω/cm2。配置含药(以药物浓度为10μg/ml计)纳米粒，加入tranwell转运孔中，测定两侧的药物含量，评价ap
→
bl(基底侧至肠腔侧)和bl
→
ap的表观渗透系数(papp)。评价不同浓度的载药纳米粒在caco
‑
2细胞模型上的转运效果，结果见表2。
[0059]
表2齐墩果酸、熊果酸仿生纳米粒在caco
‑
2细胞模型上的转运
[0060][0061]
结果表明制成药辅一体的仿生纳米粒具有明显的促进齐墩果酸、熊果酸等胆固醇类似物的跨膜渗透的作用。
[0062]
3、在体肠吸收
[0063]
麻醉sd大鼠，分离肠段。利用蠕动泵将药液自肠段入口处泵入，平衡30min后在肠段出口处连接西林瓶作为样品收集瓶，10min时迅速更换收集瓶，即每隔10min收集灌流液，直至90min结束。实验结束，将所灌流的肠段剪下，测定灌流肠段的准确长度和半径。灌流前后西林瓶内，按体积比1:1加甲醇，3000r/min离心10min，微孔滤膜过滤，取滤液采用hplc法测定药物含量。采用重量法校正试验中灌流液体积的变化。
[0064]
按下式计算ka和papp。各肠段比较见图7。
[0065]
结果表明齐墩果酸在各肠段吸收较差，与zein纳米粒混合后稍有提高，可能是zein空白纳米粒对于齐墩果酸产生的增溶作用。而制成oa
‑
zein后吸收明显提高，各肠段papp均>1.2x10
‑3，因而口服吸收良好。