Notch信号通路抑制剂及其在癌症治疗中的用途的制作方法

notch信号通路抑制剂及其在癌症治疗中的用途
1.本技术是申请日为2012年12月21日、申请号为201280070333.0、 发明名称为“notch信号通路抑制剂及其在癌症治疗中的用途”的中国专 利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及notch信号通路抑制剂、尤其是6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基) 吡啶
‑3‑
胺(i3)(cas号218457
‑
67
‑
1)及其衍生物在治疗和/或预防 癌症中的用途。


背景技术：

3.notch信号通路代表在发育、细胞生存和细胞增殖过程中控制细 胞命运的分子环路的一个重要的组成部分(shih iem，wang tlcancerres 2007；67(5):1879
‑
82)。该通路的异常激活导致肿瘤发生。notch家 族成员被揭示为越来越多的癌症的致癌基因。近来，通过存在notch 基因在人类癌症中的激活性突变和扩增，以及通过证明notch信号通 路中的基因可为潜在的治疗靶标，已突出notch在人癌症中的作用。 已清楚的是，notch通路中的主要治疗靶标之一是notch受体，其中γ
‑ꢀ
分泌酶抑制剂阻止notch分子中致癌(细胞内)结构域的生成并抑制 notch活性。
4.虽然在详细分析该信号通路的复杂活动中已取得显著进展，但针 对notch抑制剂可进行的选择非常有限。然而，开创类的notch抑制 剂已在针对少数几个癌症类型的临床试验中使用，例如merck sharp &dohme corp.mk0752的γ
‑
分泌酶抑制剂mk0752，和ro4929097 (roche)，一种抑制notch信号通路的合成的小分子，其可引起notch 信号通路过度激活的肿瘤细胞的诱导生长停滞(growth arrest)和细 胞凋亡。
5.根据目前市场或调查，使用γ
‑
分泌酶抑制剂阻断notch信号的缺 点之一是其具有宽范围的其他靶标如淀粉样前体蛋白，且其在通过全 部四个配体(notch1、2、3和4)阻断notch信号中无选择性。由于 其具有通过全部四个受体(notch1、2、3和4)阻断notch信号的能 力，γ
‑
分泌酶抑制剂已知引起小肠杯状细胞化生(goblet cellmetaplasia)。另外，一些恶性血液肿瘤和实体瘤包含notch受体突变 (如染色体易位)，导致nicd主要活化形式的组成性表达，独立于通 过γ
‑
分泌酶复合物的裂解。因此，这些肿瘤对γ
‑
分泌酶抑制剂的治疗 无响应。
6.因此，仍亟需鉴别和开发其他的特异性的且选择性的notch信号 通路抑制剂，其可用于治疗和/或预防癌症。


技术实现要素：

7.本发明涉及式i的6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)
8.9.或其具有notch信号通路抑制特性的衍生物之一，及其盐、溶剂化物、 互变异构体、同分异构体，用于治疗和/或预防癌症。
10.本发明的另一目的是提供一种药物组合物，包括含有式i的6
‑
(4
‑ꢀ
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)或其具有notch信号通路抑制特性的衍 生物之一，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体、同分异 构体以及药学上可接受的载体的药物组合物。
11.本发明还涉及一种试剂盒，包括一个或多个剂量的6
‑
(4
‑
叔丁基苯 氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)或其具有notch信号通路抑制特性的衍生物之一， 任选地还有试剂和/或使用说明，所述试剂盒在治疗和/或预防癌症的方 法中使用。
12.本发明的另一目的是提供式i的6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3) 或其具有notch信号通路抑制特性的衍生物之一用于在体内或体外抑 制细胞的notch信号通路的用途。
13.本发明的另一目的是提供一种治疗受试者的notch依赖性癌症的 方法。
附图说明
14.图1示出了6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)(cas号 218457
‑
67
‑
1)阻断nicd介导的notch信号激活。a)n1
‑
hela细胞 用pcdna3.notch1表达质粒、pgl4.26
‑
12xcsl荧光素酶和sv40光 素酶(renilla)质粒共转染。dl4
‑
和n1
‑
hela细胞以1:1的比例 (20000:20000细胞/孔)在96孔板中共培养，并用dmso或用2、5、 10μm的i3和dapt处理24h。notch通路激活通过将notch信号驱 动的荧光素酶报告子试验定量化而测量。用6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑ꢀ
胺(i3)和dapt处理dl4:n1共培养试验引起notch信号激活的浓 度依赖性降低。b)hela细胞用nicd转染并用dmso或用2、5、 10、20和40μm的6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理。作为对 照，将共培养的细胞也用5、10、20和40μm的dapt处理。通路激 活用notch驱动的荧光素酶报告子试验测量。用6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基) 吡啶
‑3‑
胺(i3)处理nicd表达细胞引起信号的衰减，而dapt处理 不影响nicd介导的notch信号激活。c)dl4:n1和dl4:n2共培养 试验用i3和dapt(各10μm)处理24h。6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑ꢀ
胺(i3)和dapt对dl4
‑
n1和dl4
‑
n2驱动的通路激活的作用通过 notch驱动的荧光素酶活性测量。i3和dapt处理都阻断notch1和 notch2诱导的通路激活。d)6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)通过 notch1的细胞内结构域(nicd)和notch2的细胞内结构域(n2
‑
icd) 抑制通路激活。
15.图2示出了6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)介导的notch信号 抑制可逆转maml1逐渐升高的浓度。用800ng的nicd 3μg的 pcdna3.1或800ng的nicd 1μg的maml1
‑
flag或800ng的 nicd 3μg的maml1
‑
flag的表达载体共转染hela细胞。为测 量notch通路激活，pgl4.26
‑
12xcsl荧光素酶质粒也被引入至细胞 中。sv40光素酶被用作内参照。将用不同组合和数量的质粒转染的细 胞用dmso或浓度逐渐升高的6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)(1、 2.5、5和10μm)处理24h。12xcsl驱动的荧光素酶活性用双荧光素 酶试验体系测量。在不存在maml1的情况下，6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基) 吡啶
‑3‑
胺(i3)可阻断notch信号激活，但6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑ꢀ
胺(i3)的notch抑制效果被逐渐增加量的maml1削弱。
16.图3示出了6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)在人癌症细胞株中 抑制notch信号并下调其靶基因。a)rpmi 8402细胞用dmso、6
‑
(4
‑ꢀ
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)和dapt(10μm)处理24h，并通过 qrt
‑
pcr分析notch靶基因hes1、cmyc和dtx1的表达。用hprt 作为
管家基因对数据进行标准化。b)将来自6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
ꢀ‑3‑
胺(i3)处理的细胞的全部细胞裂解物通过蛋白质印迹法分析。使 用抵抗nicd(val1744)、hes1和cmyc的抗体，测定nicd和notch 靶基因的蛋白质水平。c和d)将人t
‑
all细胞株hpb all和koptk1用dmso或6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理24h。使用nicd (val1744)和hes1特异性抗体进行蛋白质印迹分析。将微管蛋白作 为内参照。e)将来自dmso、6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处 理的panc1细胞(胰腺癌细胞株)的全部细胞裂解物用蛋白质印迹法 分析。用hes1特异性抗体测定hes1蛋白质水平。用学生双尾t检验 进行统计学分析。*＝p值<0.05。
17.图4示出了6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)诱导人癌细胞的增 殖性阻断。将人t
‑
all细胞株rpmi 8402和koptk1、胰腺癌细胞 株panc1以及nras驱动的黑色素瘤细胞接种到96孔板中并用10μm 浓度的6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)和dapt处理数天。其生 长抑制效果与用等量dmso处理的细胞比较。使用alamar blue试验， 跟踪rpmi 8402和koptk1的生长动力学，持续最高达6天，而 panc1和nras黑色素瘤细胞被监测4天。6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑ꢀ
胺(i3)对rpmi 8402、koptk1、panc1和nras黑色素瘤细胞的 处理引起其生长潜力显著降低。用学生t检验进行统计学分析。*＝p 值<0.05。ns＝不显著。
18.图5示出了6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)阻断人癌细胞的 nicd依赖性生长。a)dnd 41
‑
亲代细胞和dnd 41
‑
nicd细胞用6
‑
(4
‑ꢀ
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)和dapt处理24h。用hes1特异性抗 体对hes1蛋白质进行蛋白质印迹法分析。dapt和6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧 基)吡啶
‑3‑
胺(i3)都引起dnd 41
‑
亲代细胞中hes1的下调。dnd41
‑
nicd细胞仅在用6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理时显示 出hes1的下调。b)将5000个dnd 41
‑
亲代细胞接种至96孔板并用 dmso、6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)和dapt在96孔板中处 理。亲代细胞株的生长动力学用alamar blue读数跟踪5天。用6
‑
(4
‑ꢀ
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)和dapt处理dnd 41
‑
亲代细胞株引起 增殖停滞。c)类似地，将dnd 41
‑
nicd细胞用dmso、6
‑
(4
‑
叔丁基 苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)和dapt处理并且其生长动力学用alamar blue 读数监测5天。用dapt处理的dnd 41
‑
nicd细胞对其增殖没有显 著影响，而6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理诱导增殖停滞。d) 人乳腺癌细胞株hcc 1187包含sec22b
‑
notch2染色体易位，因此导 致nicd的活性形式的组成性表达，其独立于通过γ
‑
分泌酶复合物的 裂解。该突变引起此细胞株对γ
‑
分泌酶抑制剂处理不敏感性。e)在 96孔板中以每孔2000个hcc 1187细胞进行接种。用dmso、γ
‑
分泌 酶抑制剂dapt和i3处理细胞6天。在第0天、第2天、第4天和第 6天记录alamar blue读数。每个处理和时间点重复8次。当与dmso 处理的对应物相比时，用γ
‑
分泌酶抑制剂dapt处理hcc 1187人乳 腺癌细胞株不改变其生长动力学，而i3处理引起统计学上显著的细胞 增殖抑制。p值通过学生t检验计算。*＝p值<0.05。ns＝不显著。
19.图6示出了6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)诱导人t细胞急 性淋巴性白血病细胞株和人乳腺癌细胞株hcc 1187的g0/g1细胞周 期停滞及细胞凋亡。a)用i3(10μm)处理人白血病细胞株(rpmi8402、cutl 1、koptk 1、tall 1及hpb all)。膜联蛋白v阳性 (细胞凋亡)细胞群体的百分比用流式细胞术测量。b)细胞周期分 析：rpmi 8402、koptk1和tall1细胞株用i3(10μm)处理并 用ki67和hoechst染料染色，以测定细胞周期状态。细胞周期分析指 出，i3处理使得停滞在细胞周期的g0/g1阶段的细胞增加20
‑
30％。c) hcc 1187细胞用dmso或10μm i3处理并用膜联蛋白v染料测量细 胞凋亡群体的百分比。d)分析i3处理的
hcc1187细胞的细胞周期 状态。ki67和hoechst染色表明，i3诱导hcc 1187细胞的g0/g1停 滞。
20.图7示出了6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)模拟脾脏中notch2 信号表现型的基因缺失。脾脏中notch信号的缺失导致脾脏中边缘带b细胞(mzb)细胞减少。a)实验方案的示意图。b)小鼠(n＝2) 用油或25mg/kg 6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理连续7天。 在第8天分析脾脏。使用b220特异性抗体识别脾脏中的b细胞。b 细胞区室中的mzb细胞用抵抗cd23和cd21细胞表面标记物的抗体 进行检测。用6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理小鼠引起脾脏中 mzb细胞百分比的显著降低。b)当与载体处理的动物相比时，6
‑
(4
‑ꢀ
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理引起脾脏中mzb细胞的绝对数目 的减少。
21.图8示出了6
‑
(4
‑
(叔丁基)苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理增加了小鼠 中白血病发展的潜伏期。a)向nod/scidγc
‑
/
‑
小鼠注射1x106个hpball(荧光素酶表达)细胞。在第15天，白血病细胞在骨髓中建立。 每天用油或6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理小鼠。在第27天 用caliper ivis(xenogen)活体成像系统对小鼠成像。红和蓝颜色表 明荧光素酶信号的强度，并与白血病细胞数目相关。b)6
‑
(4
‑
叔丁基 苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理阻断了异种移植试验中rpmi 8402白血 病细胞生长。向nod/scidγc
‑
/
‑
小鼠移植5x105个rpmi 8402(荧光 素酶表达)细胞。白血病发展用caliper ivis(xenogen)活体成像系 统进行跟踪。在第13天，开始每天用油(n＝3)或6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基) 吡啶
‑3‑
胺(i3)(n＝4)处理。动物被处理27天(实验的终点)。
22.图9示出了6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理阻断了 mmtv
‑
erbb 2小鼠乳腺肿瘤。a)用抗hes 1抗体对比mmtv
‑
erbb2乳腺肿瘤和与正常年龄匹配的乳腺(m.g)中hes 1蛋白质表达水平。 蛋白质印迹分析显示mmtv
‑
erbb 2乳腺肿瘤中非常高的hes 1蛋白 质表达。微管蛋白被用作内参照。b)制备mmtv
‑
erbb 2乳腺肿瘤的 单细胞悬浮液并将1x106个细胞注射至受体fvb小鼠的清除的脂肪 垫中。定期监测肿瘤形成。一旦肿瘤发展至100
‑
300mm3的体积，即 用油(n＝2)或25mg/kg的6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理小 鼠(n＝2)。每6
‑
7天测量肿瘤体积。与用油处理的小鼠相比，用6
‑
(4
‑ꢀ
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理的小鼠表现出缓慢的肿瘤进展。
23.图10示出了6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)的化学衍生物的 notch抑制活性。6
‑
(4
‑
(叔丁基)苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)的不同化学衍 生物在dl4
‑
n1共培养试验中测试，且notch活性水平用notch驱动 的荧光素酶报告基因进行测量。衍生物i3
‑
a、i3
‑
b、i3
‑
c、i3
‑
e、i3
‑
g、 i3
‑
h、i3
‑
m及i3
‑
n表现出与6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)相当 的抗notch活性，而衍生物i3
‑
f和i3
‑
i似乎具有增强的活性。
具体实施方式
24.尽管与此处描述的相似或等价的方法和材料可在本发明的实施和 测试中使用，合适的方法和材料如下所述。此处提及的所有公开文本、 专利申请、专利及其他参考文献通过引证的方式全文纳入本说明书。 此处所讨论的公开文本和申请仅在本技术的申请日前提供其公开内 容。本文中没有任何内容应理解为承认本发明无权由于现有发明而早 于该公开内容。另外，所述材料、方法和实施例仅为说明性的，并非 意在限制。
25.在矛盾的情况下，将由本说明书——包括定义——约束。除非另 有定义，本文中
factor)、cfb1、 无毛阻抑物(supressor of hairless)、lag
‑
1(csl)结合而调节基因表 达。该结合将转录激活物募集到csl复合物并将其从转录阻抑物转化 为转录激活物，该激活物开启数个下游效应物。notch信号的生理学 功能是多层面的，包括干细胞的保持、细胞命运的规范、调节发育中 的分化过程及肿瘤形成。
32.在癌症中，notch受体位点处分子基因改变，例如染色体易位、 点突变和染色体扩增，是notch通路的组成型激活的已知机理。尽管 机理不同，但它们都导致细胞内notch
‑
ic水平增加。notch致癌潜力 首次在人t细胞急性淋巴性白血病(t
‑
all)中被发现。虽然notch1 信号对t细胞前体的正常发育很重要，由于分子基因改变引起的notch1信号的组成型激活与t
‑
all有关。例如，由于(7；9)染色体易位引 起的人notch 1的胞外部分的中间缺失与～1％的t
‑
all病例相关， 且notch 1的激活点突变在约50％的t
‑
all病例中出现。在notch
‑
icd 转基因小鼠模型中观察到t细胞白血病/淋巴瘤的形成，这说明notch 激活在t
‑
all发展中的因果作用。在非小细胞肺癌中，染色体易位 (15；19)已在肿瘤的子集中识别出，且该易位被认为提高在肿瘤中的 notch3转录。在卵巢癌中，在约19％的肿瘤中发现notch 3基因扩增， 并在超过一半的卵巢浆液性癌中发现notch 3的过度表达。类似地， notch信号激活已在乳腺癌的发育中显示出。在动物模型中，组成型 活化的notch 4表达引起小鼠的乳腺肿瘤，且notch 1
‑
激活突变有助于 t
‑
all的发育。近期研究进一步表明，激活的notch 1和notch 3在 转基因小鼠中的过度表达阻断了乳腺发育并诱发小鼠乳腺肿瘤。notch 信号激活也牵涉到乳腺癌细胞的肺和骨转移。notch 3的过度表达足以 在小鼠模型中诱发脉络丛肿瘤形成，表明了notch 3在某些类型的脑 肿瘤的发育中的作用。
33.针对进行高通量筛选以识别新的notch信号的调节剂(抑制剂) 的目的，申请人已建立共培养试验，以诱导配体
‑
受体介导的通路的激 活。所述共培养试验使用notch配体dl4和notch1受体进行建立， 具体是因为dl4
‑
n1配体
‑
受体介导的通路激活在病理条件下如肿瘤血 管生成起重要作用，且notch 1受体在诱发t细胞白血病中的作用。 由于该试验取决于dl4配体和notch 1受体的表达及二者之间的相互 作用，其提供了询问以受控的方式的配体
‑
受体相互作用诱发的notch 信号的机会。将该试验小型化到96孔板和384孔板格式帮助申请人使 该试验适于进行hts。使用该共培养试验筛选sirna或小分子库可导 致识别能在通路的不同步骤中调节notch信号的蛋白质或化学化合 物。例如，使用sirna或小分子库的hts可获得通路的调节剂，该 调节剂能够在信号输出或信号接收细胞中起作用。在配体和受体向细 胞质膜的循环和运输中的小分子或蛋白质介导的的改变可潜在地阻断 notch通路，并可用该试验进行研究。另外，该试验也可帮助识别能 够阻断配体
‑
受体相互作用、adam 10/17介导的s2裂解或γ
‑
分泌酶 催化的notch受体的s3裂解、notch的活性形式的核易位的蛋白质或 化学实体，或帮助识别能够阻断转录激活复合物的实体。
34.申请人也能够筛选出三个不同化学化合物库(microsourcenimds、prestwick和maybridge hit finder)，其使得若干化学物质能 被识别，所述化学物质能够在通路的不同水平上阻断notch信号。
35.使用notch非依赖性光素酶体系作为内参照使申请人可以排除具 有细胞毒性的化学化合物，从而限制假阳性命中率。另外，该基于细 胞的试验也有助于避开与化学化合物的细胞渗透性相关的问题，用于 进一步命中有效性。
36.dl 4:n 1共培养试验体系的开发为hts的进行打下基础。该试验 提供了稳健的和
灵敏的读数体系以识别新的notch通路的调节剂(抑 制剂)。
37.申请人鉴定了若干化学化合物的阻断notch通路激活的能力。其 中，申请人鉴定了化合物6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)(cas号 218457
‑
67
‑
1)的阻断notch通路激活的能力。
38.因此，本发明涉及式i的6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)，
[0039][0040][0041]
用于治疗和/或预防癌症。
[0042]
本发明也包括6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)(cas号 218457
‑
67
‑
1)的化学改性物，以延长其循环寿命。用于将药物(包括 基于多肽的药物)短暂地或可逆地聚乙二醇化的方法的非限制性实例 记载于第4,935,465号(1990年6月19日发布)和第6,342,244号(2002 年1月29日发布)美国专利；和第us2006/0074024号美国公开申请中。 本领域技术人员通常会在例如wo2005047366和us2005171328公开 申请中以及nektar peg reagent2005
‑
2006(nektartherapeutics,san carlos,calif.)列出的那些试剂中找到有关基于peg 的试剂的详细描述。
[0043]
本发明还包括具有notch信号通路抑制特性的所述i3的化学衍生 物。申请人已示出，6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)及其衍生物以 细胞核中转录激活复合物的notch信号为靶标，由于上述突变而对γ
‑ꢀ
分泌酶抑制剂呈抗性的人肿瘤预期对6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺 (i3)治疗做出响应。另外，6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)似乎 选择性地靶向notch信号，从而限制其脱靶毒性作用。
[0044]
这些衍生物均具有以下共同结构：
[0045][0046]
优选地，在所述衍生物中，x为o，且3位(或对位)为nh2。 更优选地，具有notch信号通路抑制特性的衍生物选自包含以下的非 限制性组：
[0047][0048]
其中m为选自1至4的整数；
[0049]
w选自h和卤素；所述卤素选自f
‑
、cl
‑
、br
‑
或i
‑
；
[0050]
r1、r2、r3、r4各自独立地选自h、苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、 2
‑
或3
‑
萘基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基、苄基、异 丙基、叔丁基、(ch2)
n
ch3烯基、炔基；下标n为独立地选自1至15 的整数；
[0051]
x为o、s、cr5r6、nr7、nhcor8或nhso2r9；其中r5、r6、 r7、r8、r9各自独立地选自h、苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、2
‑ꢀ
或3
‑
萘基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基、苄基、
异丙 基、叔丁基或(ch2)
n
ch3；下标n为独立地选自1至15的整数；
[0052]
y为n或ch；
[0053]
z为h、no2、oh；nr10r11，其中r10和r11各自独立地选自h 和(ch2)
n
ch3；nhcor12，其中r12选自(ch2)
n
ch3、芳族基团和杂 芳族基团如苯基、萘基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基； coor13，其中r13选自h、(ch2)
n
ch3、芳族基团和杂芳族基团如 苯基、萘基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基；nhso2r14， 其中r14选自苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、萘基，杂芳族基团如吡 咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基，苄基、(ch2)
n
ch3；下标n 为独立地选自1至15的整数；
[0054][0055]
其中m为选自1至4的整数；
[0056]
w选自h和卤素；卤素选自f
‑
、cl
‑
、br
‑
或i
‑
；
[0057]
r4和r15各自独立地选自h、苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、2
‑
或 3
‑
萘基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基、苄基、异丙基、 叔丁基、(ch2)
n
ch3烯基、炔基；下标n为独立地选自1至15的整数； x为o、s、cr5r6、nr7、nhcor8或nhso2r9；r5、r6和r7 各自独立地选自h、苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、2
‑
或3
‑
萘基、吡咯 基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基、苄基、异丙基、叔丁基、(ch2)
n
ch3； r8和r9各自独立地选自苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、2
‑
或3
‑
萘基、 或选自吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的杂芳族基团，苄 基、(ch2)
n
ch3；下标n为独立地选自1至15的整数；
[0058]
y为n或ch；
[0059]
z为h、no2、oh；nr10r11，其中r
10
和r
11
各自独立地选自h、 (ch2)
n
ch3；nhcor
12
，其中r12为(ch2)
n
ch3、选自苯基、萘基、 吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的芳族基团和杂芳族基团； coor13，其中r13为h、(ch2)
n
ch3，选自苯基、萘基、吡咯基、 呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的芳族基团和杂芳族基团； nhso2r14，其中r14为苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、萘基，选自 吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的杂芳族基团，苄基、 (ch2)
n
ch3,；下标n为独立地选自1至15的整数；
[0060][0061]
其中m为选自1至4的整数；
[0062]
w选自h和卤素；所述卤素选自f
‑
、cl
‑
、br
‑
或i
‑
；
[0063]
r4为h、苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、2
‑
或3
‑
萘基、吡咯基、呋喃 基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基、苄基、异丙基、叔丁基、(ch2)
n
ch3烯 基、炔基；下标n为独立地选自1至15的整数；
[0064]
x为o、s、cr5r6、nr7、nhcor8或nhso2r9；r5、r6和r7 各自独立地选自h、苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、2
‑
或3
‑
萘基、吡咯 基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基、苄基、异丙基、叔丁基、(ch2)
n
ch3； r8和r9各自独立地选自苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、2
‑
或3
‑
萘基， 或选
自吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的杂芳族基团，苄 基、(ch2)
n
ch3；下标n为独立地选自1至15的整数；
[0065]
y为n或ch；
[0066]
z为h、no2、oh、nr10r11其中r
10
和r
11
各自独立地选自h、 (ch2)
n
ch3；nhcor
12
，其中r12为(ch2)
n
ch3、选自苯基、萘基、 吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的芳族基团和杂芳族基团； coor13，其中r13为h、(ch2)
n
ch3、选自苯基、萘基、吡咯基、 呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的芳族基团和杂芳族基团； nhso2r14，其中r14为苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、萘基，选自 吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的杂芳族基团，苄基、 (ch2)
n
ch3；下标n为独立地选自1至15的整数；
[0067][0068]
其中m为选自1至4的整数；
[0069]
w选自h和卤素；所述卤素选自f
‑
、cl
‑
、br
‑
或i
‑
；
[0070]
r1、r2、r3、r4各自独立地选自h、苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、 2
‑
或3
‑
萘基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基、苄基、异 丙基、叔丁基、(ch2)
n
ch3烯基、炔基；下标n为独立地选自1至15 的整数；
[0071]
x为o、s、cr5r6、nr7、nhcor8或nhso2r9；r5、r6和r7 各自独立地选自h、苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、2
‑
或3
‑
萘基、吡咯 基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基、苄基、异丙基、叔丁基、(ch2)
n
ch3； r8和r9各自独立地选自苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、2
‑
或3
‑
萘基， 或选自吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的杂芳族基团，苄 基、(ch2)
n
ch3；下标n为独立地选自1至15的整数；
[0072]
z为h、no2、oh；nr10r11，其中r10和r11各自独立地选自h、 (ch2)
n
ch3；nhcor12，其中r12为(ch2)
n
ch3、选自苯基、萘基、 吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的芳族基团和杂芳族基团； coor13，其中r13为h、(ch2)
n
ch3、选自苯基、萘基、吡咯基、 呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的芳族基团和杂芳族基团； nhso2r14，其中r14为苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、萘基、选自 吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的杂芳族基团，苄基、 (ch2)
n
ch3；下标n为独立地选自1至15的整数；
[0073][0074]
其中m为选自1至4的整数；
[0075]
w选自h和卤素；所述卤素选自f
‑
、cl
‑
、br
‑
或i
‑
；
[0076]
r4、r15各自独立地选自h、苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、2
‑
或3
‑ꢀ
萘基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基、苄基、异丙基、 叔丁基、(ch2)
n
ch3烯基、炔基；下标n为独立地选自0至15的整数；x为o、s、cr5r6、nr7、nhcor8或nhso2r9；r5、r6和r7 各自独立地选自h、苯
基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、2
‑
或3
‑
萘基、吡咯 基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基、苄基、异丙基、叔丁基、(ch2)
n
ch3； r8和r9各自独立地选自苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、2
‑
或3
‑
萘基， 或选自吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的杂芳族基团，苄 基、(ch2)
n
ch3；下标n为独立地选自0
‑
15的整数；
[0077]
z为h、no2、oh；nr10r11，其中r10和r11各自独立地选自h、 (ch2)
n
ch3；nhcor12，其中r12为(ch2)
n
ch3、选自苯基、萘基、 吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的芳族基团和杂芳族基团； coor13，其中r13为h、(ch2)
n
ch3、选自苯基、萘基、吡咯基、 呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的芳族基团和杂芳族基团； nhso2r14，其中r14为苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、萘基，选自 吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的杂芳族基团，苄基、 (ch2)
n
ch3；下标n为独立地选自0至15的整数；
[0078][0079]
其中m为选自1至3的整数；
[0080]
w选自h和卤素；所述卤素选自f
‑
、cl
‑
、br
‑
或i
‑
；
[0081]
r4为h、苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、2
‑
或3
‑
萘基、吡咯基、呋喃 基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基、苄基、异丙基、叔丁基、(ch2)
n
ch3烯 基、炔基；下标n为独立地选自0至15的整数；
[0082]
x为o、s、cr5r6、nr7、nhcor8或nhso2r9；r5,r6和r7各 自独立地选自h、苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、2
‑
或3
‑
萘基、吡咯基、 呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基、苄基、异丙基、叔丁基、(ch2)
n
ch3； r8和r9各自独立地选自苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、2
‑
或3
‑
萘基， 或选自吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的杂芳族基团，苄 基、(ch2)
n
ch3；下标n为独立地选自0至15的整数；
[0083]
z为h、no2、oh；nr10r11，其中r10和r11各自独立地选自h、 (ch2)
n
ch3；nhcor12，其中r12为(ch2)
n
ch3、选自苯基、萘基、 吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的芳族基团和杂芳族基团；coor13，其中r13为h、(ch2)
n
ch3、选自苯基、萘基、吡咯基、 呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的芳族基团和杂芳族基团； nhso2r14，其中r14为苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、萘基，选自 吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的杂芳族基团，苄基、 (ch2)
n
ch3；下标n为独立地选自0至15的整数；
[0084][0085]
其中杂芳族基团为氨基吡咯、氨基呋喃、氨基噻吩，或嘧啶；
[0086]
r1、r2、r3、r4各自独立地选自h、苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、 2
‑
或3
‑
萘基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基、苄基、异 丙基、叔丁基、(ch2)
n
ch3烯基、炔基；下标n为独立地选自0至15 的整数；
[0087]
x为o、s、cr5r6、nr7、nhcor8或nhso2r9；其中r5、r6、 r7、r8、r9各自独立地选自h、
苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、2
‑ꢀ
或3
‑
萘基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基、苄基、异丙 基、叔丁基或(ch2)
n
ch3，下标n为独立地选自0至15的整数；
[0088]
z为h、no2、oh；nr10r11，其中r10和r11各自独立地选自h、 (ch2)
n
ch3；nhcor12，其中r12为(ch2)
n
ch3、选自苯基、萘基、 吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的芳族基团和杂芳族基团； coor13，其中r13为h、(ch2)
n
ch3、选自苯基、萘基、吡咯基、 呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的芳族基团和杂芳族基团； nhso2r14，其中r14为苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、萘基，选自 吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的杂芳族基团，苄基、 (ch2)
n
ch3；下标n为独立地选自0至15的整数；
[0089][0090]
下标n为独立地选自1至15的整数；
[0091]
其中杂芳族基团为氨基吡咯、氨基呋喃、氨基噻吩，或嘧啶；
[0092]
r4、r15各自独立地选自h、苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、2
‑
或3
‑ꢀ
萘基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基、苄基、异丙基、 叔丁基、(ch2)
n
ch3烯基、炔基；下标n为独立地选自0至15的整数； x为o、s、cr5r6、nr7、nhcor8或nhso2r9；r5、r6和r7 各自独立地选自h、苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、2
‑
或3
‑
萘基、吡咯 基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基、苄基、异丙基、叔丁基、(ch2)
n
ch3； r8和r9各自独立地选自苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、2
‑
或3
‑
萘基， 或选自吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的杂芳族基团，苄 基、(ch2)
n
ch3；下标n为独立地选自0至15的整数；
[0093]
z为h、no2、oh；nr10r11，其中r10和r11各自独立地选自h、 (ch2)
n
ch3；nhcor12，其中r12为(ch2)
n
ch3、选自苯基、萘基、 吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的芳族基团和杂芳族基团； coor13，其中r13为h、(ch2)
n
ch3、选自苯基、萘基、吡咯基、 呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的芳族基团和杂芳族基团； nhso2r14，其中r14为苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、萘基，选自 吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的杂芳族基团，苄基、 (ch2)
n
ch3；下标n为独立地选自0至15的整数；
[0094][0095]
其中杂芳族基团为氨基吡咯、氨基呋喃、氨基噻吩，或嘧啶；
[0096]
r4为h、苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、2
‑
或3
‑
萘基、吡咯基、呋喃 基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基、苄基、异丙基、叔丁基、(ch2)
n
ch3烯 基、炔基；下标n为独立地选自0至15的整数；
[0097]
x为o、s、cr5r6、nr7、nhcor8或nhso2r9；r5、r6和r7 各自独立地选自h、苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、2
‑
或3
‑
萘基、吡咯 基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基、苄基、异丙基、叔丁基、(ch2)
n
ch3； r8和r9各自独立地选自苯基、2
‑
、3
‑
或4
‑
取代的苯基、2
‑
或3
‑
萘基， 或选自吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的杂芳族基团，苄 基、(ch2)
n
ch3；下标n为独立地选自0至15的整数；
[0098]
z为h、no2、oh；nr10r11，其中r10和r11各自独立地选自h、 (ch2)
n
ch3；nhcor12，其中r12为(ch2)
n
ch3、选自苯基、萘基、 吡咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的芳族基团和杂芳族基团； coor13，其中r13为h、(ch2)
n
ch3、选自苯基、萘基、吡咯基、 呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的芳族基团和杂芳族基团； nhso2r14，其中r14为苯基、2
‑
、3
‑
或4取代的苯基、萘基，选自吡 咯基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基的杂芳族基团，苄基、(ch2)
n
ch3； 下标n为独立地选自0至15的整数；
[0099]
甚至更优选地，具有notch信号通路抑制特性的衍生物选自：
[0100][0101]4‑
(4
‑
(叔戊基)苯氧基)苯胺、
[0102][0103]4‑
(4
‑
环己基苯氧基)苯胺、
[0104][0105]6‑
(4
‑
((3r,5r,7r)
‑
金刚烷
‑1‑
基)苯氧基)吡啶
‑3‑
胺、
[0106][0107]6‑
(3
‑
(叔丁基)苯氧基)吡啶
‑3‑
胺、
[0108][0109]4‑
(4
‑
(叔丁基)苯氧基)
‑3‑
氟苯胺、
[0110][0111]6‑
(4
‑
(叔戊基)苯氧基)吡啶
‑3‑
胺、
[0112][0113]6‑
(4
‑
丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺、
[0114][0115]4‑
(4
‑
环己基苯氧基)
‑3‑
氟苯胺、
[0116][0117]3‑
氟
‑4‑
(4
‑
(叔戊基)苯氧基)苯胺、
[0118][0119]6‑
(4
‑
(2
‑
甲基戊烷
‑2‑
基)苯氧基)吡啶
‑3‑
胺、
[0120][0121]4‑
(4
‑
((3r,5r,7r)
‑
金刚烷
‑1‑
基)苯氧基)苯胺、
[0122][0123]4‑
(4
‑
((3r,5r,7r)
‑
金刚烷
‑1‑
基)苯氧基)
‑3‑
氟苯胺、
[0124][0125]6‑
(4
‑
环己基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺、
[0126][0127]4‑
(4
‑
(叔丁基)苯氧基)苯胺、
[0128][0129]4‑
(4
‑
异丙基苯氧基)苯胺，和
[0130][0131]6‑
(4
‑
(2,4,4
‑
三甲基戊烷
‑2‑
基)苯氧基)吡啶
‑3‑
胺。
[0132]
本发明也涉及本发明的化合物i3、化学改性的i3化合物和所述i3 化合物的衍生物的盐或溶剂化物。优选地，这些盐和/或溶剂化物是药 学上可接受的。根据本发明，药学上可接受的盐由酸性的无机化合物 或有机化合物、或碱性的无机化合物或有机化合物制备。本文中使用 的短语“药学上可接受的盐”指保持具体指明的化合物的游离酸和碱的 生物学有效性且非生物学上或原本不需要的盐。
(数据未示出)。不囿于理论，6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)的 可能的作用机制之一可以是破坏转录共激活剂募集到核 csl/rbp
‑
jk
‑
nicd
‑
maml 1复合物。因此，仍需确定在功能性转录激 活复合物的形成中所涉及的其他共激活剂的状态。在生理条件下，在 csl/rbp
‑
jk
‑
nicd
‑
maml 1复合物形成后，cbp/p300组蛋白乙酰转 移酶(hat)被募集至复合物，导致其自动乙酰化和组蛋白3和4的 乙酰化。
[0139]
在体内环境下进一步研究6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)及其 衍生物，以确定其在小鼠中的notch抑制作用及毒副作用。notch信 号对小肠的正常稳态的维持很重要。小肠中notch1和notch2信号的 基因切除或药物抑制导致小肠中杯状细胞化生。由于已观察到6
‑
(4
‑
叔 丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)阻断notch1和notch2介导的信号，用6
‑
(4
‑ꢀ
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理的小鼠预期发生杯状细胞化生。令 人惊奇的是，用25mg/kg 6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理小 鼠7天(在异种移植的情况下大于一个月)，不扰乱小肠稳态，也未观 测到杯状细胞积累(数据未示出)。该出乎意料的结果可被归结于两个 原因。一种可能的解释可为，所用的6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3) 的浓度(25mg/kg)不足以阻断小肠中notch通路激活。但是，另一 个更有说服力的解释可为，notch1和notch2信号的下游的转录激活 复合物的组成不同。由于这些可能的差异，notch1和notch2介导的 信号可能对6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理具有不同的灵敏度。
[0140]
notch信号在造血系统的调节中起到重要的作用。例如，dl4
‑
notch1信号对在胸腺中的t细胞发育很重要。notch 2和maml 1 介导的通路激活对脾脏中的边缘区b(mzb)细胞发育有很关键。为 解决6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)是否可损害脾脏中notch依赖 性mzb细胞发育，c57b16小鼠用25mg/kg的6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡 啶
‑3‑
胺(i3)处理7天，并在第8天进行分析。使用抵抗b220、cd21 和cd23的抗体进行流式细胞术分析，揭示了6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
ꢀ‑3‑
胺(i3)处理引起脾脏中mzb细胞的百分比和绝对数目的减少(图 7)。
[0141]6‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)的抗癌活性在人类疾病如t细 胞白血病和乳腺癌的移植模型中进行研究。在这些研究中，6
‑
(4
‑
叔丁 基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)证明了显著的降低极具侵袭性形式的白血病 细胞株的演进和转移的能力(图8)。另外，在使用乳腺癌作为实体瘤 模型的初步研究中，6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理导致阻断 小鼠中的肿瘤演进(图9)。
[0142]
化学化合物6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)示出阻断nicd介 导的信号的能力。因此，该化合物可用于癌症——其中notch驱动的 肿瘤对γ
‑
分泌酶抑制剂处理具有抗性。
[0143]
本发明还提供了一种药学组合物，其包括式i的6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧 基)吡啶
‑3‑
胺(i3)，或其具有如本文所记载的notch信号通路抑制特 性的衍生物之一，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体、 同分异构体，及药学上可接受的载体。关于适当的载体，可以参考记 载这些载体的标准文献，例如comprehensive medicinal chemistry, pergamon press 1990,第五卷，25.2章；及“lexikon der hilfsstoffe f
ü
rpharmazie,kosmetik und angrenzende gebiete”,h.p.fiedler,editiocantor,2002。术语“药学上可接受的载体”指可用于制备药物组合物的 载体或辅料，其通常是安全的并具有可接受的毒性。可接受的载体包 括兽用或人制药用途可接受的载体。说明书和权利要求书中使用的“药 学上
可接受的载体”包括一种或多于一种的所述载体。任选地，本发明 的药物组合物进一步包含一种或多种其他活性剂，其选自包含用于治 疗癌症的化疗剂的非限制性组。该化疗剂可选自，例如，六甲蜜胺、 博来霉素、白消安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、瘤可宁、顺铂、克 拉屈滨、crisantaspase、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、道诺霉素、 阿霉素、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、伊 达比星、异环磷酰胺、伊立替康、环己亚硝脲、美法仑、巯嘌呤、甲 氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、喷司他丁、甲基苄肼、链 脲菌素、taco、替莫唑胺、巯鸟嘌呤、塞替派、拓扑替康、曲奥舒凡、 长春花碱、长春新碱、长春地辛及长春瑞滨。
[0144]
本发明的化合物，即6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)及其衍生 物——用于治疗和/或预防癌症——可纳入多种治疗给药的制剂和药 剂中。更具体而言，本文提供的一种或多种化合物可通过与适当的、 药学上可接受的载体一起配制成药物组合物，也可配制成固体、半固 体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、 糖衣丸、凝胶、浆液、软膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂和气 雾剂。如此，所述化合物的给药可以多种方式实现，包括口服给药、 颊给药、直肠给药、肠胃外给药、腹膜内给药、皮内给药、透皮给药、 颅内给药和/或气管内给药。而且，所述化合物可以储库或缓释制剂局 部给药而非全身性的方式给药。所述化合物可与常见辅料、稀释剂或 载体一起配制，并压制成片剂，或配制成酏剂或溶液，用于方便的口 服给药，或通过肌肉内的或静脉内的途径给药。所述化合物可透皮给 药，并可配制成缓释剂型等。所述化合物可以单独给药、彼此结合给 药，或可与其他已知化合物结合使用。本发明使用的合适的剂型可见 于remington's pharmaceutical sciences(mack publishing company (1985)philadelphia,pa,第17版)，其以参引的方式纳入本文。而且， 用于药物递送的方法的概述参见langer,science(1990) 249:1527
‑
1533，其以参引的方式纳入本文。
[0145]
本文提供的可与载体材料结合以制备单一剂量形式的化合物的量 取决于所治疗的疾病、需要其的受试者及特定的给药方式。然而，作 为一般性指导，本发明的化合物的适合的单位剂量可例如优选地包含 在0.1mg至约1000mg之间、1mg至约500mg之间及1mg至约300 mg之间的活性化合物。在另一实施例中，所述单位剂量在1mg至约 100mg之间。该单位剂量可每天给药超过一次，如每天2、3、4、5 或6次，但优选每天1或2次，以使70kg成年人的总剂量在每次给 药0.001至约15mg/kg受试者体重的范围内。优选的剂量为每次给药 0.01至约1.5mg/kg受试者体重，且这样的疗法可持续数周或数月，在 一些情况下，数年。然而，应理解，对于任何具体患者的具体剂量水 平取决于多种因素，包括所用的具体化合物的活性；正接受治疗的个 体的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；给药时间和途径；排 泄速率；之前给予的其他药物；和正接受治疗的具体疾病的严重程度， 如本领域技术人员能非常好地理解的。常用的剂量可为1mg至约100 mg或1mg至约300mg的每日一次服用或每日多次服用的片剂，或每 日服用一次的一次性释放的胶囊或片剂，其中包括更高比例含量的活 性成分。时间
‑
释放效应可通过在不同ph值下溶解的胶囊材料、通过 在渗透压下缓慢释放的胶囊或通过任何其他已知的受控释放方法而获 得。在一些情况下，可需要使用上述范围以外的剂量，这对本领域技 术人员是显而易见的。
[0146]
本发明还提供了用于治疗和/或预防癌症的本发明的化合物。
[0147]
本文使用的癌症优选地为notch依赖性癌症，并选自包含以下的 非限制性组：t细
胞急性淋巴性白血病(t
‑
all)、慢性粒细胞性白血 病(cml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、套细胞淋巴瘤、乳腺癌、 胰腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、脑肿瘤、肿瘤血管生成和结直肠癌。
[0148]
优选地，本发明的化合物(6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)， 其衍生物)还可用于治疗癌症——其中notch依赖性癌症对γ
‑
分泌酶 抑制剂处理呈抗性。对γ
‑
分泌酶抑制剂处理呈抗性的notch信号依赖 性人肿瘤可通过nicd的水平、notch靶基因及notch受体和notch 途径的其他组分的突变状态而确定。
[0149]
本发明还提供了用于治疗和/或预防癌症的方法，所述方法包括向 有需要的受试者给予本发明的6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)，其 衍生物或药物组合物。
[0150]
在另一实施方案中，本发明提供了治疗与上调的notch信号通路 活性相关的疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予本发明 的6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)，其衍生物或药物组合物。
[0151]
本发明化合物的每日剂量必须根据被治疗的主体、特定的给药途 径及被治疗的疾病的严重性和种类而变化。因此，最佳剂量可由治疗 任何特定患者的实施者确定。另外，需要注意的是，根据个体患者响 应，临床医生或治疗医生应知道如何及何时开始、介入、调整或终止 治疗。
[0152]
对于在本发明的方法中使用的任一化合物，治疗有效剂量最初可 由细胞培养试验、动物模型或人受试者的微小剂量而估算。
[0153]
本文使用的“治疗”指治疗处理和防范措施或预防措施。需要治 疗的受试者包括已患有病症如癌症的受试者，及病症如癌症待被预防 的受试者。因此，本文中待治疗的哺乳动物，优选地人类，可以已经 被诊断为患有病症如癌症，或易于患有病症如癌症或易受病症如癌症 的影响。
[0154]
术语“治疗有效量”指有效地治疗哺乳动物的疾病或病症的药物 量。在癌症的情况中，药物的治疗有效量可减少肿瘤细胞或癌细胞的 数量、减小肿瘤尺寸；抑制(即减慢至一定程度并优选停止)癌细胞 向周围器官的浸润；抑制(即减慢至一定程度并优选停止)肿瘤转移； 抑制肿瘤生长至一定程度；和/或减轻一个或多个与癌症相关的症状至 一定程度。从本发明的化合物可阻止生长和/或杀死现有的癌细胞来 看，其为抑制细胞生长的和/或具有细胞毒性。本文使用的短语“治疗 有效量”意指足以防止靶细胞团、癌细胞组的生长或演进或有丝分裂 活性或其他病理学特征在临床上的显著变化或优选地使所述变化降低 至少30％、优选地至少50％、优选地至少70％、优选地至少80％、 优选地至少90％。
[0155]
任选地，本发明的化合物可与常规治疗如标准放射疗法和/或标准 化学疗法组合(例如，同时，或几乎同时，或相继使用)用于抵抗细 胞增殖疾病。标准放射疗法和化学疗法疗法也可为同步的化学
‑
放射疗 法。
[0156]
因此，任选地，标准放射疗法和/或化学疗法可在给予治疗有效量 的本发明的化合物或包含其的药物组合物之前、同时或之后进行。
[0157]
术语“同步的化学
‑
放射疗法”在当上述两种治疗(化学疗法和放 射疗法)同时或几乎同时给予时使用，例如一个接一个地，或在同一 天，等。
[0158]
术语“标准放射疗法”指使用电离辐射作为癌症治疗的一部分以 控制恶性细胞。优选地，所述电离辐射为γ
‑
照射。将放射疗法与手术、 化学疗法、激素疗法或其组合结合也是常见的。大多数常见癌症类型 通常可用放射疗法治疗。精确的治疗目的(治愈的、辅助
的、新辅助 的或缓和的)应取决于肿瘤类型、位置和阶段，及有需要的受试者的 总体健康状况。
[0159]
术语“标准化学疗法”通常指用具体化学治疗试剂/化学试剂治疗 癌症的方法。化学治疗试剂指通常用于治疗癌症的药学试剂。所述用 于治疗癌症的化学治疗试剂包括，例如，六甲蜜胺、博来霉素、白消 安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、瘤可宁、顺铂、克拉屈滨、crisantaspase、 环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、道诺霉素、阿霉素、表柔比星、依 托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、伊达比星、异环磷酰胺、 伊立替康、环己亚硝脲、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米 托蒽醌、奥沙利铂、喷司他丁、甲基苄肼、链脲菌素、taco、替莫唑 胺、巯鸟嘌呤、塞替派、拓扑替康、曲奥舒凡、长春花碱、长春新碱、 长春地辛及长春瑞滨。
[0160]
当化学治疗试剂与本发明的化合物结合使用时，其可以含有上述 两种试剂的组合的药剂形式使用，用于同时给药，或两种试剂可以分 离的剂量形式使用，每一剂量形式包含所述试剂之一，在后一种情况 中，单独的剂量形式可依次使用，即一个本发明化合物的剂量形式， 紧接着是含有化学治疗试剂的剂量形式(反之亦然)。两种独立的剂量 形式的该实施方案可以试剂盒的形式设计和提供。
[0161]
同样任选地，本发明的化合物可与常规的肿瘤块移除的方法例如 分段切除(活组织检查或总体切除)结合使用，用于抵抗细胞增殖疾 病，如癌症。
[0162]
术语“肿瘤块移除”指从受试者移除、消融或切除肿瘤块的任何 方法。所述移除可为化学移除、辐射移除或手术移除。优选地，所述 移除为手术移除，如消融或切除。切除可为“分段切除”(或分段切除 术)，一种从受试者移除器官或腺体的一部分的手术操作。其还可用于 移除肿瘤和其周围的正常组织。还可使用减积剂(debulking agent) 来移除肿瘤块。术语“减积剂”包括允许杀死肿瘤块的癌细胞(如上 述fl10和fl1
‑
细胞)的任何分子(例如，化学分子、生物分子)或 任何外用/环境试剂(如γ
‑
照射)或传统手术。
[0163]
本发明的另一目的是一种用在治疗和/或预防癌症的方法中的试 剂盒，其包括一个或多个剂量的本发明的6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑ꢀ
胺(i3)，或其具有notch信号通路抑制特性的衍生物之一，或药物组 合物。所述试剂盒可进一步包括一个或多个剂量的化学治疗试剂。任 选地，所述试剂盒还包括试剂和/或使用说明。
[0164]
通常，所述试剂盒包括容器和在所述容器上或伴随所述容器的标 签或包装说明书。合适的容器包括，例如，瓶子，小瓶、注射器等。 所述容器可由多种材料如玻璃或塑料制成。所述容器容纳了有效用于 治疗病症的药物组合物并可具有无菌接入端口(例如所述容器可为静 脉注射溶液包或具有可被皮下注射针头穿透的瓶塞的小瓶)。所述标签 或包装说明书指所述组合物用于治疗选择的病症，如癌症。
[0165]
本发明还涉及本发明的化合物用于在体外或体内抑制细胞中的 notch信号通路的用途。通常，所述细胞为癌细胞。
[0166]
还涉及一种治疗受试者的notch依赖性癌症的方法，包括
[0167]
i)确定在从所述受试者的生物样品获得的癌细胞中，癌症是否为 notch信号通路依赖性的；ii)基于癌症是否为notch依赖性癌症，通 过给予治疗有效量的本发明的式i的6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3) 或其具有notch信号通路抑制特性的衍生物之一或药物组合物治疗所 述受试者。
[0168]
通常，癌细胞中notch信号通路依赖性通过本领域已知的任何方 法确定。例如，该方法可包括本文描述的体外γ
‑
分泌酶复合物活性试 验。
[0169]
该治疗方法可进一步包括给予至少一种常规癌症治疗方法。所述 常规癌症治疗方法在给予治疗有效量的本发明的式i的6
‑
(4
‑
叔丁基苯 氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)或其具有notch信号通路抑制特性的衍生物之一 或药物组合物之前、同时或之后给予。
[0170]
通常，常规癌症治疗方法包括放射疗法和/或化学疗法。
[0171]
本发明还涉及本发明的化合物在体内或体外通过诱导g0/g1细胞 周期停滞而引发细胞凋亡的方法中的用途。
[0172]
本领域技术人员应理解，本文中描述的发明可允许除本文具体描 述的方案以外的变型方案和变化方案。应理解，本发明包括所有此类 变型方案和变化方案，不背离本发明的精神或必要特点。本发明还包 括本说明书中单独或共同地提及或说明的所有步骤、特征、组合物和 化合物，以及所述步骤或特征的任意或全部组合或任意两个或多个。 因此，就各方面而言，本公开内容应被认为是说明性的且非限制性的， 本发明的范围由随附的权利要求书指明，在等同含义和范围内的所有 变化均旨在包括在内。
[0173]
说明书中引用了多个参考文献，每一参考文献均以参引的方式全 文纳入本说明书。
[0174]
参考以下实施例可更充分理解上述说明。然而，此类实施例为实 施本发明的方法的示例，并非意在限制本发明的范围。
[0175]
实施例
[0176]
实施例1
[0177]
构建及基因报告试验
[0178]
将小鼠dl4
‑
ires dsred cdna克隆到pentr1载体 并采用gateway克隆策略(invitrogen)最终插入目 标慢病毒载体。磷酸甘油酸激酶(pkg)启动子驱动dl4蛋白质的表 达。dl 4
‑
慢病毒颗粒通过dl 4
‑
慢病毒载体、gag/pol表达质粒和编码 病毒包膜蛋白质的质粒共转染在293t细胞中制备。为过度表达notch1 蛋白质，小鼠全长notch 1cdna被克隆到pcdna3.1
‑
ires
‑
嘌呤霉素 载体。notch1 cdna被克隆到hindiii和xbai限制位点之间的ires
‑ꢀ
嘌呤霉素的上游。cmv启动子控制notch1蛋白质的表达。
[0179]
为测量notch信号激活，csl/rbp
‑
jk共有的dna结合序列以从 头到尾的构象被克隆到pgl4荧光素酶载体(promega)，从而被命名 为12xcsl/rbp
‑
jjk荧光素酶载体。为了在化学化合物筛选试验中测 定notch通路激活，12x csl/rbp
‑
jk共有的dna结合序列被克隆到pgl4.26.荧光素酶载体(promega)。作为转染率的内参照，使用 sv40renilla载体(promega)。
[0180]
nicd
‑
gfp过度表达研究用pegfp
‑
c1
‑
nicd表达质粒进行。表 达maml1
‑
flag的flag
‑
cmv2质粒为波士顿哈弗医学院 (harvard medical school,boston)的lizi wu博士所赠。
[0181]
dl4和n1稳定的hela细胞的产生：
[0182]
为了产生dl4和n1稳定的细胞株，从atcc购得hela细胞(商 品编号ccl
‑
2)。为了产生dl4稳定的细胞株，将细胞用dl4
‑
慢病毒 颗粒转导。用嘌呤霉素选择dl4稳定克隆。高dl4表达克隆使用抵 抗dl4的抗体用荧光激活细胞分选术(facs)进行分选。为了产生 n1稳定
的细胞株，用含有在cmv启动子控制下的小鼠全长notch1 的pcdna3.1 (invitrogen)质粒转染细胞。为了选择notch1表达克隆， 将ires
‑
嘌呤霉素盒克隆到notch1 cdna的下游。表达高水平notch1 的hela细胞通过使用抗notch1抗体的facs富集。dl4
‑
和n1
‑
hela 细胞在dmem(gibco,invitrogen)、10％的fcs及10μg/ml的嘌呤 霉素(sigma)中培养。
[0183]
高通量筛选及数据分析：
[0184]
对于化合物库筛选，共培养试验进行如下。n1
‑
hela细胞在10cm 组织培养皿中用16μg的pgl4.26.12xcsl荧光素酶载体/平板、4μg 的notch1表达质粒/平板及200ng的sv40光素酶载体/平板进行共转 染。dl4
‑
和n1
‑
hela细胞通过使用0.5mm的edta(1
×
pbs)从平 板上分离。对两个细胞群进行计数，并以1:1的比例(在384孔板上 5000:5000细胞/孔)混合并用multidrop combi平板分配器在384孔 板(白色，透明底，corning)中分配。试验平板预分配有(使用自动 化biomek 3000液体处理器)化学化合物库(microsource nimds, maybridge hitfinder and prestwick)，以得到最终浓度为10μm。最终 试验体积为22μl。24h后，将生长培养基吸走并将细胞用1x被动裂 解缓冲液在室温下裂解10分钟。荧光素酶活性用荧光素酶试验试剂ii 测量，且光素酶值通过使用停止和发光试剂(双荧光素酶试验体系， 商品编号e1980，promega)测定。荧光素酶和光素酶读数用 f500(tecan)多平板读数仪读取。所有液体操作步骤(培养液的吸出， 被动裂解缓冲液、荧光素酶试验试剂ii和停止和发光试剂的分配)用 elf406液体操作器进行。
[0185]
数据分析通过使用ecole polytechnique federale de lausanne (epfl)的生物分子筛选设备(bsf)的内部创建的分析软件进行。
[0186]
rna的提取：
[0187]
总rna通过提取试剂盒(invitrogen)从细胞中提取， 简而言之，1x106个细胞用冰冷的1xpbs洗涤，并在室温下于1ml的 溶液中裂解5分钟，以使核蛋白复合物分解。随后经裂解的 细胞用200μl的氯仿处理，并剧烈摇动15至30秒，并在室温下孵育 2至3分钟。样品用eppendorf台式离心机在4℃下以14000rpm离心 10分钟。离心后，将上层水相转移到新的微量离心管中。为了沉淀总 rna，向分离的水相中加入500μl的异戊醇并在室温下孵育10分钟。 将样品在4℃离心10分钟得到rna粒状物。所获得的rna粒状物用 1ml冰冷的75％的乙醇冲洗并在4℃下以14000rpm离心沉淀。将 rna粒状物干燥以除去过量的乙醇并用40μl的depc水重新悬浮。
[0188]
cdna合成：
[0189]
从细胞提取的总rna用于通过逆转录反应合成cdna。逆转录采 用superscript
tm rt(invitrogen)进行。用nd
‑
1000分光光度 计(witec ag)测量rna浓度，并将500ng的总rna与10mm的dntp 混合物和100ng的随机引物的混合物进行混合。将反应混合物在65℃下 孵育5分钟并迅速在冰上孵育1分钟。在冰上孵育后，加入5x第一链 缓冲液和0.1m的dtt，并将混合物在25℃下孵育2分钟。为起始逆 转录反应，向反应混合物中加入200u的superscript
tm ii rt，并在42 ℃下孵育50分钟。通过将反应混合物在75℃下孵育15分钟以终止反 应。
[0190]
蛋白质印记分析：
[0191]
将细胞在ripa缓冲液(50mm的三羟甲基氨基甲烷氯，ph 7.5， 150mm的nacl，1％诺
乃清洁剂p
‑
40，0.5％的脱氧胆酸钠及0.1％ 的sds)中于4℃裂解30分钟。裂解的细胞在4℃下以14000rpm离 心，以除去碎片。将上清液转移至新的微量离心管中。用分光光度计(ultrospec 3000pro)通过bradford试验测定蛋白质浓度。40μg的 蛋白质在1x sds凝胶加载缓冲液(100mm的三羟甲基氨基甲烷氯 (tris.cl)，ph 6.8，200mm的dtt，4％的sds，0.2％的溴苯酚，20％ 的甘油)中通过在99℃下加热5分钟变性。将变性的蛋白质样品保存 在冰上直至将其加载至丙烯酰胺凝胶。样品在8％或10％的丙烯酰胺 凝胶上在三羟甲基氨基甲烷(tris)
‑
甘氨酸电泳缓冲液(25mm的三羟 甲基氨基甲烷，250mm的甘氨酸,0.1％的sds)中运行。在丙烯酰胺 凝胶上分离后，使用转移缓冲液(39mm的甘氨酸,48mm的三羟甲 基氨基甲烷碱，0.037％的sds及20％的甲醇)将蛋白质样品转移到 pvdf膜(peq lab,商品号39
‑
3010)上。
[0192]
对于免疫印迹，将膜用5％的乳封闭，并用一级抗体在4℃下孵育 过夜。将膜用1x tbst(1x tbs 0.5％吐温20)洗涤5分钟(3次) 并用hrp
‑
结合的二级抗体在室温下孵育1小时。用super signal west 化学发光底物(thermo scientific,商品号34077)检测。
[0193]
免疫荧光染色：
[0194]
为了进行免疫荧光染色，hela细胞或c2c12细胞在载玻片上生 长。细胞用冰冷的1x pbs洗涤，用4％的pfa在室温下固定5分钟， 并用0.3％的triton x
‑
100渗透。随后，已渗透的细胞用1％的bsa在 室温下封闭20分钟。细胞用合适的一级抗体在室温下孵育1小时。 alexa fluor
‑
488结合的二级抗体用于检测一级抗体。细胞用dapi复 染并在荧光固定介质中固定。用bioimaging的zeiss axioplan显微镜 和epfl的光学核心设备观察和捕获荧光图像。
[0195]
表1：抗体及工作稀释度的列表
[0196]
[0197][0198]
c2c12成肌细胞分化试验
[0199]
在生长培养基(10％血清)存在的情况下，将c2c12细胞在胶原 蛋白涂布的盖玻片上培养。为了诱导成肌细胞分化，在分化培养基(2％ 马血清)存在的情况下或在生长培养基 notch抑制剂存在的情况下， 使细胞生长至100％融合持续3天。3天后，将细胞用冰冷的1x pbs 洗涤并用4％的pfa固定。用2.2.6节(免疫荧光染色)中所述的抗
‑
mhc 抗体进行免疫荧光染色。
[0200]
流式细胞术分析：
[0201]
荧光激活细胞分选术(facs)分析在epfl的流式细胞术核心设 备中的用于流式细胞术的cyan
tm
adp设备平台上进行。dl4和 notch1在dl4
‑
和n1
‑
hela细胞中的表达分别用抗
‑
dl4和抗
‑
n1
‑
hela 抗体进行测定。胸腺中t细胞发育用抵抗cd4、cd8和tcrβ的抗体 进行研究。mzb细胞发育用抵抗b220、cd21和cd23的抗体监测。 简而言之，由胸腺和脾脏制备单细胞悬浮液。将1x106个细胞悬浮在 50μl的染色介质(补充有2％的ncs和25mm的hepes的hbss) 中并通过在冰上孵育30分钟用合适的抗体结合物进行染色。
[0202]
为量化凋亡细胞的百分比，进行膜联蛋白v和7aad染色。胸腺 细胞悬浮在300μl的
1x膜联蛋白v结合缓冲液(bd biosciences，sandiego，usa)中，并用10μl的膜联蛋白v
‑
cy5抗体及10μl的7aad (bd biosciences，san diego，usa)孵育。将样品在室温下孵育15分 钟。在抗体染色的1h内进行facs。
[0203]
流式细胞术分析通过在前向散射(fsc)和侧向散射(ssc)上分 选而在活细胞上进行。用flowjo软件(tree star，ashland，or)分析 数据。
[0204]
alamar blue增殖试验：
[0205]
进行alamar增殖试验以测定用notch抑制剂处理的细胞的 生长动力学。alamar由细胞可渗透的底物刃天青(resazurin) 组成。在新陈代谢活跃的和增殖性细胞中，由于活细胞具有内在的还 原能力，刃天青被转化为试卤灵(resorufin)并产生红色荧光。因此， 试卤灵的产生作为细胞群生存能力的指示剂。
[0206]
增殖试验通过将5000细胞/孔接种至96孔板上进行。细胞用 dmso或notch抑制剂处理不同的时间间隔。每一时间间隔的每次处 理重复8次。为了确定生长动力学，向每个孔中加入10μl的alamar(invitrogen)并孵育4小时。alamar blue读数用tecan f500 (tecan)多平板读数仪读取。
[0207]
苏木精&曙红染色
[0208]
收集器官，并在4％的多聚甲醛(pfa)于4℃下固定过夜，并包 埋于石蜡中。将组织切片脱蜡，并用浓度逐渐降低的乙醇(100％
‑
70％) 并最终在蒸馏水中水合。将切片用苏木精染色5分钟，用酸性乙醇漂 洗约20秒并随后用流水漂洗10分钟。随后将切片用伊红染色5分钟， 用水洗涤，并用浓度逐渐升高的乙醇(70％
‑
100％)脱水，并在二甲 苯溶液中净化。切片用固定液固定。观察经苏木精和伊红染色的切片 并用leica dmi4000显微镜捕获图像。
[0209]
alcian blue染色：
[0210]
将肠组织用冰冷的1xpbs冲洗并在4％pfa中固定。将组织包埋 在石蜡中并切成4微米的厚度。肠切片在60℃下脱蜡并用浓度逐渐降 低的醇溶液(100％
‑
70％)水合，最后在蒸馏水中洗涤。alcian blue 染色在室温下进行30分钟并用流水洗涤，最后在核固红(nuclear fastred)中复染5分钟。随后将组织切片在流水中洗涤，并在100％醇中 脱水，并在二甲苯溶液中净化。随后观察固定的切片并用leicadmi400显微镜捕获图像。
[0211]
实验小鼠：
[0212]
小鼠在epfl,lausanne的动物设施中饲养和繁殖。c57b16小鼠 用于评估化学化合物的肠道毒性。mmtv
‑
erbb2/neu
‑
ires cre(fvb 背景)小鼠从dr.william j muller,mcgill university,montreal处获 得，用mmtv
‑
erbb2/neu特异性引物进行基因分型(ursini
‑
siegel等 人，2008)。nod/scidγc
‑
/
‑
小鼠从jackson laboratory(usa)购得， 并在epfl,lausanne的动物设施中饲养和繁殖。
[0213]
肠道毒性及对边缘区b细胞发育的影响：
[0214]
c57b16小鼠通过腹腔内注射油或25mg/kg的i3或10mg/kg的 cpa，每天一次，持续5
‑
7天。用磅秤在第0天、第3天和第5天对 小鼠称重。在第8天，收集肠道组织、脾脏和胸腺用于分析。
[0215]
肿瘤移植试验：
[0216]
将含有由cmv启动子下游组成性表达的荧光素酶基因的慢病毒 传导至人白血病
细胞株rpmi 8402和hpb all。将人白血病细胞株 rpmi 8204(0.5
‑
1x106个细胞)和hpb all(1x106个细胞)悬浮在 100μl冰冷的1xpbs中并保存在冰上直至移植。将nod/scidγc
‑
/
‑
小 鼠用人白血病细胞株通过静脉注射移植。使用caliper ivis(xenogen) 活体成像系统监测小鼠的肿瘤发展。简而言之，将荧光素酶底物荧光 素(biosynth,l
‑
8820)溶解在1xpbs中并以150mg/kg体重的浓度注 射(腹腔内)至小鼠。荧光素注射5分钟后，使用caliper ivis活体 成像系统对小鼠成像。
[0217]
在第13
‑
15天，每天用油或25mg/kg的i3处理小鼠。在实验结束 时捕获图像。
[0218]
从小鼠收集原发性mmtv
‑
erbb2/neu乳腺肿瘤并制备单细胞悬 浮液。将1x106个原发性肿瘤细胞悬浮在50μl的1xpbs中并保存在冰 上。将三周大的受体fvb小鼠清除其内源性上皮，并将肿瘤细胞注射 至空脂肪垫(empty fat pad)。监测受体小鼠中的肿瘤发展并用电子卡 尺测量肿瘤体积。用下列公式计算肿瘤体积：2x长x(宽)2。一旦肿瘤 体积达到约100mm3，即将受体小鼠用油或25mg/kg的i3每隔一天 处理。
[0219]
测定发展
[0220]
为了识别新的notch通路调节剂，申请人建立了共培养测定，其 中表达dl4配体的hela细胞与n1 hela细胞一起培养，从而激活 notch通路。使用dl4和n1hela细胞共培养系统模拟了表达配体和 受体的细胞之间的细胞
‑
细胞通讯的生理条件。受控的受体
‑
配体测定 系统的体外形成使申请人能够通过γ
‑
分泌酶抑制剂改变和监测notch 信号强度。
[0221]
dl4:n1 hela细胞共培养激活notch信号
[0222]
为了建立共培养测定，申请人建立了表达dl4和n1的稳定hela 细胞株。简而言之，将含有pgk启动子下游的dl4 cdna的慢病毒 转导至hela细胞。表达d4的细胞群通过荧光激活细胞分选术富集。 类似地，n1稳定的hela细胞株用含有小鼠n1 cdna的质粒且随后 通过ires嘌呤霉素选择盒而建立。该系统使申请人可以选择当用嘌 呤霉素选择时只表达notch1的克隆。dl4和n1蛋白质在各细胞株中 的表达水平使用抗
‑
dl4和抗
‑
n1抗体检测。用流式细胞术定量检测蛋 白质水平显示，与亲代hela细胞相比具有dl4和n1的高水平表达 (数据未示出)。
[0223]
为了评估稳定细胞株的notch通路激活潜力，在6孔板上以1:1 的比例共培养dl4和n1稳定的hela细胞(分别为dl4
‑
hela和 n1
‑
hela)并生长至融合。共培养的细胞用dmso或dapt(10μm) 处理24小时。作为对比，亲代hela细胞也与dl4
‑
hela细胞共培养， 并在存在或不存在dapt的情况下生长24小时。用val1744抗体对 notch1活性形式(nicd)进行蛋白质印记分析，且当亲代hela细胞 与dl4
‑
hela细胞共培养时仅显示适度水平的nicd(数据未示出)， 解释了hela细胞中内源性notch1的低水平。另一方面，在不存在配 体(dl4
‑
hela细胞)的情况下或在存在gsi(dapt)的情况下， 未检测nicd水平，说明notch信号的缺失(数据未示出)。然而， dl4
‑
和n1
‑
hela细胞的共培养显示了明显更高的nicd水平，其可被 dapt处理阻断(数据未示出)。全长notch1 cdna向n1
‑
hela细胞 的短暂引入进一步提高了共培养测定的稳健性，如nicd蛋白质增加 的水平所示(数据未示出)。用dapt抑制n1裂解可取消notch1信 号活性的增强(数据未给出)。这些结果证实，高水平的notch通路激 活可在对gsi抑制响应的dl4:n1共培养测定中实现。
[0224]
在6孔板格式上建立dl4:n1共培养测定使申请人能够评估受体
‑ꢀ
配体相互作用介导的notch信号激活。共培养系统的gsi(dapt)处 理可阻断受体
‑
配体相互作用驱动的
notch信号。
[0225]
高通量筛选(hts)相容性测定的建立
[0226]
首先，dl4:n1共培养测定在6孔板上进行。为了建立高通量筛选 (hts)，测定系统进一步优化至在384孔板格式下稳健地工作。
[0227]
将测定规模压缩到384孔板格式，用于筛选化学化合物库。为了 达到这一目的，用报告子质粒和n1表达载体转染n1
‑
hela细胞。12 小时后，化学化合物被分配至384孔板，并以dmso和dapt作为阴 性和阳性对照。dl4
‑
和n1
‑
hela细胞以1:1的比例(5000:5000细胞/ 孔)混合并用multidrop combi平板分液器加至384孔板。荧光素酶 读数用双重荧光素酶测定系统测量。为优化并确定测定的可重复性， 用dmso处理半个平板(192孔)，且另外半个平板用10μm dapt 处理(192孔)。dapt处理引起notch信号激活的10倍的下调。该测 定的z’值高于0.5。z’值>0.5证明测定hts活动的可靠性和可重复性。
[0228]
实施例2
[0229]6‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)作为新型notch信号抑制剂
[0230]
i3抑制nicd介导的notch信号激活：
[0231]
为证实notch抑制活性并测定i3化合物的ic50值，使用了 dl4:n1共培养测定系统。共培养测定中的细胞用浓度逐渐升高的i3 (2
‑
10μm)处理24小时。用notch驱动的荧光素酶报告子测定法测 量notch通路的激活。如图1a所示，i3以浓度依赖的方式阻断notch 信号，其ic50值在较低μm范围。
[0232]
为了确定nicd的过度表达是否可逆转i3介导的notch信号抑制， 将hela细胞用表达nicd的质粒和12xcsl荧光素酶构造共转染。 转染的细胞用浓度逐渐升高的i3和dapt处理。令人惊奇地，用i3 处理的表达nicd的细胞可以剂量依赖的方式阻断通路激活，而dapt 没有信号激活的作用(图1b)。该数据表明，i3介导的notch通路抑 制作用归因于s3裂解事件的下游活性。
[0233]
随后，申请人研究了i3是否可通过其他notch受体阻断通路激活， 或i3是否对notch1信号为特异性的。为解决这个问题，采用共培养 测定，其中notch信号由dl4:n1配体受体对激活或由dl4:n2配体 受体对激活。用i3处理在上述两种共培养测定中的细胞，引起经 dl4:n1和dl4:n2配体
‑
受体对的notch信号抑制(图1c)。类似地， i3也可阻断由notch1胞内结构域(nicd)和notch2
‑
胞内结构域 (n2
‑
icd)引起的通路激活，说明i3对nicd介导的激活不是特异 性的(图1d)。
[0234]6‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺不阻断nicd的核定位：
[0235]
由nicd转染的hela细胞的体外数据表明，6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基) 吡啶
‑3‑
胺(i3)通过作用s3裂解事件下游而阻断notch信号。这提出 多个关于6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)作用机理的可能性。例如， 6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理可损害nicd核定位。另一可 能的抑制机理可能是以细胞核中转录激活复合体的一个或多个独立成 分为靶标。为了测试6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)是否对nicd 的核转运有影响，将hela细胞用nicd
‑
gfp融合构造转染，并用 dmso或6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理。这使得申请人能 够跟踪细胞内融合蛋白的转运。平行地，6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑ꢀ
胺(i3)介导的通路抑制通过notch驱动的荧光素酶测量而测定(数 据未示出)。微观研究表明，在dmso处理的细胞中，nicd
‑
gfp融 合蛋白易位至细胞核，该过程未被6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧
基)吡啶
‑3‑
胺(i3) 处理干扰(数据未示出)。该数据排除了nicd的细胞核排斥作为6
‑
(4
‑ꢀ
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)的作用机理。
[0236]
maml1高于特定阈值的过度表达可逆转6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡 啶
‑3‑
胺(i3)引发的notch信号抑制：
[0237]
由于6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)介导的notch信号阻断不 涉及nicd的细胞核排斥，申请人解决了6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑ꢀ
胺(i3)是否阻断nicd、maml1和csl
‑
rbp
‑
jk(核心转录激活复 合物的所有部分)之间的相互作用和亚核定位。为解决这一问题，hela 细胞用800ng的nicd
‑
gfp质粒和1μg的maml1
‑
flag表达载体 共转染，并将其在盖玻片上生长。被转染的hela细胞用dmso或6
‑
(4
‑ꢀ
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)(10μm)处理24小时。在该浓度的nicd 和maml1下，6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)阻断notch激活的 能力通过notch驱动的荧光素酶测量而证实(数据未示出)。处理之后， 将细胞用4％的pfa固定，用1％的bsa封闭，并用抵抗flag标记 的maml 1和csl
‑
rbp
‑
jk的抗体染色。nicd
‑
gpf融合蛋白通过跟 踪gfp蛋白质而观察。当单独表达时，nicd
‑
gfp蛋白在细胞核中以 扩散形式定位，且6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理不改变其细 胞核定位。然而，nicd
‑
gfp和maml1的过度表达导致两种蛋白质 共定位至亚核区室(可能为细胞核体)。用6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑ꢀ
胺(i3)处理细胞不干扰nicd
‑
gfp和maml1向亚核区室的易位和 共定位(数据未示出)。
[0238]
类似地，csl/rbp
‑
jk的位置使用抵抗该蛋白的特异性抗体进行研 究。maml1
‑
flag和csl/rbp
‑
jk共定位于亚核区室且6
‑
(4
‑
叔丁基 苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理不干扰其在细胞核中的分布(数据未示出)。 该数据表明6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理不干扰notch转录 激活复合物的组分在细胞核中的共定位。然而，仍需研究其是否阻断 复合物的不同组分之间的相互作用。
[0239]
为了进一步研究6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)的作用机理， 申请人推断6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)可能将转录激活复合物 的成分之一作为靶标。该靶蛋白的过度表达可滴定测量出6
‑
(4
‑
叔丁基 苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)化合物并因而逆转6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑ꢀ
胺(i3)诱导的通路抑制。为解决这一问题，将hela细胞用800ngnicd
‑
gfp质粒和含量逐渐增加(0、1和3μg)的maml1
‑
flag表 达载体共转染。notch通路激活通过引入12xcsl荧光素酶质粒测量。 如图2所示，在仅用nicd转染的hela细胞或用nicd 1μg的 maml1转染的hela细胞中，6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处 理可以浓度依赖的方式阻断notch信号。然而，当maml1质粒的用 量增加到3μg时，6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理不再能够抑 制notch信号激活(图2)。因此，maml 1高于某一阈值的过度表达 可逆转6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)介导的notch通路的抑制。 该数据说明，maml1自身可能是6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3) 化合物的靶标。提高maml1的浓度可能能够滴定测量出抑制剂，从 而使其不能阻断信号级联。
[0240]6‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理降低人癌症细胞株中notch 信号：
[0241]
notch信号的异常激活在肿瘤发生和/或人类癌症的维持中有重要 作用。为确定6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理是否可阻断人癌 症细胞中的notch信号，用6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理多 个癌细胞株(t
‑
all细胞株rpmi 8402、hpball、koptk1及胰腺 癌细胞株panc1)24小时。对notch信号的效应通过测量notch靶基 因的表达
水平而测定。用6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理人类 癌细胞株(rpmi 8402、hpball、koptk1和panc1)24小时并 随后通过qrt
‑
pcr对notch靶基因的分析或蛋白质印迹分析表明， 6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)诱导notch靶基因如hes1、cmyc 和dtx1在mrna水平和蛋白质水平上的统计学上的显著下调(图3)。 notch靶基因的下调与nicd的水平下降相一致(图3b、c和d)。
[0242]
由于用6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理人t
‑
all细胞株 和panc1胰腺癌细胞株引起notch信号的下调，申请人质疑该通路的 抑制是否转化为癌细胞的生长停滞。为此，在存在或不存在6
‑
(4
‑
叔丁 基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)的情况下，使rpmi 8402、koptk1、panc1 和nras驱动的黑色素瘤细胞株生长数天，并使用alamar blue测定法 测量其增殖指数。另外，不具有已知的notch突变的b
‑
淋巴细胞raji 细胞株用作对照(数据未示出)。如图4所示，6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡 啶
‑3‑
胺(i3)和dapt处理在t
‑
all细胞株rpmi 8402、koptk1和 胰腺癌细胞株panc1中诱发明显的增殖阻断。类似地，6
‑
(4
‑
叔丁基苯 氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)显著地抑制nras驱动的黑色素瘤细胞株的生长 (图4)。然而，dapt和6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)都对notch 非依赖性的raji细胞的增殖没有任何影响(数据未示出)。
[0243]
在nicd过度表达的人t
‑
all和乳腺癌细胞株中，6
‑
(4
‑
叔丁基苯 氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)——而非dapt——阻断notch信号。
[0244]6‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)可阻断nicd介导的notch通 路的激活(图1)。为了确定6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)是否 还可在过度表达nicd的细胞中诱发增殖阻断，将人t
‑
all细胞株 dnd41(dnd41亲代)用表达nicd的慢病毒转导，以产生 dnd41
‑
nicd细胞株。上述两个细胞株用dmso、6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基) 吡啶
‑3‑
胺(i3)和dapt处理。与用dmso处理的细胞相比，用dapt 和6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理dnd41
‑
亲代细胞株引起 hes 1的下调。然而，当用dmso、6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3) 和dapt处理dnd41
‑
nicd细胞时，仅6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑ꢀ
胺(i3)——而非dapt——处理引起hes 1的下调(图5a)。另外， 还监测上述两个细胞株若干天，以获得6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺 (i3)和dapt的抗增殖效果。观察到，虽然6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
ꢀ‑3‑
胺(i3)和dapt处理在dnd41
‑
nicd细胞株中引起显著的增殖阻 断(图5b)，但只有6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)能够引起 dnd41
‑
nicd细胞的生长停滞(图5c)。该数据进一步增强了如下观 点：6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)化合物可阻断nicd介导的 通路激活和人类癌细胞的增殖。
[0245]
为了进一步加强6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)化合物可阻断 nicd介导的通路激活和人类癌细胞的增殖的观点，将hcc 1187人乳 腺癌细胞株用该化合物处理。hcc1187细胞株包含secc22b
‑
notch2 染色体易位，因此产生n2
‑
icd的组成型活性形式。由于此突变， hcc1187细胞株对γ
‑
分泌酶抑制剂如dapt不响应。如图5e所示， 虽然dapt处理不抑制hcc 1187细胞株的增殖，但6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧 基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理显著地诱发在这些细胞株中的增殖阻断。
[0246]6‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)诱导人t细胞急性淋巴性白血 病细胞株的g0/g1细胞周期停滞和细胞凋亡：
[0247]
如图4和图5所示，6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理人白 血病细胞株和人
乳腺癌细胞株消极地调节增殖。该6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基) 吡啶
‑3‑
胺(i3)介导的增殖停滞可归因于在细胞周期的不同阶段中诱 导细胞凋亡或细胞周期停滞。另外，用γ
‑
分泌酶抑制剂引起的notch 信号抑制已被证明诱导人tall细胞株的g0/g1细胞周期停滞。因此， 为了进一步阐明6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)介导的增殖停滞的 机理，进行细胞周期和细胞凋亡分析。用6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑ꢀ
胺(i3)或dmso处理人tall细胞株(rpmi 8402、koptk1、tall1、 cutl1和hpb all)和人乳腺癌细胞株hcc1187持续2天或7天。 为了研究细胞死亡，在处理7天后进行膜联蛋白v染色并通过流式细 胞术分析测定凋亡的(膜联蛋白v阳性)细胞群的比例。如图6a所 示，6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理在rpmi8402、koptk1、 tall1、cutl1和hpball中诱导显著的细胞凋亡。类似地，6
‑
(4
‑ꢀ
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)在人乳腺癌细胞株hcc 1187中诱导细 胞凋亡(图6c)。
[0248]
除诱导细胞凋亡以外，在6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理 的人白血病细胞株和乳腺癌细胞株中观察到的增殖停滞似乎也可归因 于细胞周期的g0/g1阶段的细胞周期停滞。用6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡 啶
‑3‑
胺(i3)处理白血病细胞株(rpmi8402、koptk1和tall1) 和乳腺癌细胞株持续48小时，并用ki67和hoechst染色确定细胞周 期状态。如图6b和6d所示，6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)诱 导细胞周期的g0/g1阶段的停滞，通常观察到的表现型归因于notch 信号抑制。
[0249]6‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)介导的notch信号抑制诱发 c2c12成肌细胞分化：
[0250]
为了进一步证实不同系统中6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)的 notch抑制潜力，c2c12成肌细胞分化用作功能测定。c2c12成肌细 胞中notch通路激活使其保持在未分化状态，而notch信号的取消诱 导其分化。c2c12成肌细胞用dmso、6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺 (i3)和dapt处理，并生长至100％融合持续3天。3天之后，将细 胞固定并用抵抗肌球蛋白重链(mhc)的抗体染色。细胞核用dapi 复染。在10％血清(生长培养基)的存在下生长的c2c12成肌细胞保 持其未分化的状态，而用dapt和6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3) 处理的细胞开始分化进入多核的mhc阳性肌管(数据未示出)。
[0251]6‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)不阻碍wnt和hedgehog信号 级联
[0252]
关于化学化合物6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)活性的关注之 一是其对notch信号通路的特异性。为了测试6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
ꢀ‑3‑
胺(i3)是否也可阻断其它发育通路，申请人已测试了其阻断wnt 和hedgehog信号通路的能力。总之，为测量wnt信号，用含有由 tcf/lef结合位点组成的启动子的质粒传染hela细胞，从而驱动荧 光素酶基因(top
‑
荧光素酶)的表达。为激活wnt通路，用编码β
‑ꢀ
连环蛋白的质粒共转染至hela细胞。将共转染的细胞在存在或不存 在6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)化学化合物的情况下孵育。如通 过β
‑
连环蛋白
‑
tcf/lef驱动的荧光素酶活性测量的，β
‑
连环蛋白的短 暂引入引起wnt信号的上调。重要的是，6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑ꢀ
胺(i3)对具有激活的wnt信号的细胞的处理不阻断wnt通路激活(数 据未示出)。
[0253]
使用类似的策略，通过引入gli1转录因子在hela细胞中激活 hedgehog信号，且通路激活用含有gli1结合位点驱动的荧光素酶表 达的启动子序列监测。用6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理这些 细胞不抑制hedgehog信号级联(数据未示出)。这些数据一起表明， 6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)化学化合物可损害其他发育通路， 且对notch
信号抑制可能是特异性的。然而，仍需确定wnt和hedgehot 信号对6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)的抗性是细胞类型特异性的， 或其是否是普遍现象。
[0254]6‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)在c57bl6小鼠中的体内效果：
[0255]
notch信号调节发育过程中多个器官的稳态。例如，notch1介导 的通路激活对在胸腺中的t细胞发育很重要(radtke等，1999)。然而， 由于maml1缺失不影响小鼠中的t细胞发育，因此notch1驱动的t 细胞发育似乎不依赖于maml1。这可能归因于maml2和maml3 家族成员对maml1缺失的补偿机制。在脾脏中，mzb细胞发育需要 仅通过maml1的notch2驱动信号。notch2和maml1的基因消除 缺失引起mzb细胞发育的阻断(wu等，2007，saito等，2003)。另外， 通过notch1和notch2的notch信号对编码区室的保持很重要。小肠 中notch1和notch2的复合基因消融引起杯状细胞化生。因此，申请 人研究了6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)是否可损害上述notch
‑ꢀ
依赖性的发育过程。
[0256]
在体外培养测定中，化学化合物6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3) 能够阻断notch1和notch2介导的通路激活。因此，申请人假设，用 6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理小鼠可导致小肠的杯状细胞化 生。为验证这一假设，小鼠腹腔内注射25mg/kg的6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基) 吡啶
‑3‑
胺(i3)持续连续7天。在第8天，处死动物，将小肠组织固 定，并用石蜡包埋。用alcian blue对杯状细胞染色以进行组织学分析。 令人惊讶的是，由于其在体外培养物中阻断notch1和notch2介导的 通路激活，用6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理的小鼠的小肠组 织完全正常，具有完好的结构且未见杯状细胞化生的指示(数据未示 出)。类似地，还监测了6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)对体重变 化的效果。对小鼠注射25mg/kg的6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3) 持续连续5天并记录体重的变化。用6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3) 处理小鼠不引起体重降低。
[0257]6‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理诱发mzb细胞发育的阻 断：
[0258]
申请人假设6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)介导的notch2信 号抑制应导致脾脏中mzb细胞发育的阻断。mzb细胞发育通过用针 对b220、cd21和cd23的抗体对脾细胞染色通过流式细胞术评估。 如图7b所示，用6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理小鼠引起脾 脏中mzb细胞群百分比的降低。另外，脾脏中mzb细胞群的减少也 反映了mzb细胞的绝对数目(图7c)。
[0259]
因此，6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)介导的在mzb细胞发 育中的阻断模拟notch2和maml1表现型的缺失。然而，仍需看出 6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)是否仅通过maml1发挥其notch 抑制效果，或其是否可通过其他maml家族成员阻断notch信号。
[0260]6‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理在异种移植模型中减缓人 t细胞白血病的肿瘤生长：
[0261]
由于激活通路的不同组分的突变而引起的notch信号激活已知会 引起超过50％的人t细胞急性淋巴性白血病。因此，申请人决定研究 化学化合物6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)在notch驱动的人t 细胞白血病的体内抗癌活性。为达到这一目的，用nod/scidγc
‑
/
‑
小 鼠建立人白血病的异种移植模型。人t
‑
all细胞株hpb all和 rpmi8402用于此目的。hpb all细胞株包含在异源二聚化结构域中 的l1575p突变，和在notch1受体的pest结构域中的插入序列，从 而组成性地激活nocth1信号。类似地，由于在异源二聚化结构域中的 1584氨基酸残基的插入和e3连接酶fbw7中的失活性突变(r465 h)，rpmi8402细
胞表现出受体非依赖性的notch信号激活。就notch 靶基因的增殖和/或下调而言，上述两个细胞株都被发现在体外培养测 定中对6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理有响应。为了确定这些 细胞株在异种移植环境中是否形成白血病，将来自每个细胞株的1百 万个细胞通过静脉注射到nod/scidγc
‑
/
‑
小鼠体内。动物发生具有 100％外显率的白血病并在移植后四周内死亡。
[0262]
一旦rpmi8402和hpb all细胞株在异种移植测定中发生白血 病，就将其用组成性表达荧光素酶基因的慢病毒转导。这使得申请人 可使用caliper ivis(xenogen)活体成像检测系统可见并监测白血病在 小鼠中的演进。为了确定6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)在已确立 的肿瘤中的抗癌效力，进行了一项维护实验。将1百万个hpb all 细胞静脉注射至nod/scidγc
‑
/
‑
小鼠中。通过检测表达荧光素酶的白 血病细胞监测小鼠的白血病的发展。一旦疾病在15天左右确立，就将 小鼠分为两组。一组用油处理，作为对照；另一组每天用25mg/kg的6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理。如图8a所示，用油处理的 小鼠发生具有100％外显率的白血病，而用6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑ꢀ
胺(i3)处理的小鼠中的白血病没有以与用油处理的组相同的速度演 进(图8a)。
[0263]
类似地，在初步实验中，向nod/scidγc
‑
/
‑
小鼠移植5
×
105个rpmi 8402细胞并用油或6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理，然后确 立疾病。如图8b所示，用油处理的动物发生白血病，而用6
‑
(4
‑
叔丁 基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理的小鼠未患白血病。而且，组织学分析 揭示，在用油处理的小鼠中，白血病细胞演进至浸润肝脏，但6
‑
(4
‑
叔 丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理的小鼠在肝脏中未发生任何转移病灶 (数据未示出)。由于这些动物用化学化合物6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
ꢀ‑3‑
胺(i3)处理27天，分析小肠组织以检测肠道中的任何毒性。小肠 组织的alcian blue染色没有显示杯状细胞数目或小肠结构的任何异常 (数据未示出)。
[0264]
申请人从人白血病异种移植模型所得的数据一起表明，6
‑
(4
‑
叔丁 基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)具有减缓已确立的白血病的疾病演进的能力。 由于其影响肿瘤演进的能力，i3可为用于进一步开发抗癌试剂的合适 候选物。
[0265]
mmtv
‑
erbb2小鼠乳腺肿瘤表现notch信号激活及6
‑
(4
‑
叔丁基 苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)对乳腺肿瘤演进的效果
[0266]
在人乳腺癌中，高水平的notch1和jagged1蛋白与乳腺癌患者的 低存活率相关。另外，人乳腺癌中notch信号的激活也促进骨和肺的 转移。因此，为了确定化学化合物6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3) 在乳腺癌中的抗癌潜力，对乳腺癌的小鼠模型进行研究。已知小鼠乳 腺肿瘤病毒(mmtv)驱动的erbb2过度表达引起小鼠乳腺肿瘤。 mmtv
‑
erbb2转基因小鼠发生具有约5
‑
6个月的潜伏期的乳腺肿瘤， 并伴随肺转移的发生。mmtv
‑
erbb2小鼠乳腺肿瘤的特征之一为绝 大多数管腔上皮细胞类型的存在。已知notch信号驱使管腔细胞从小 鼠乳腺干细胞的分化。因此，申请人假设，mmtv
‑
erbb2乳腺肿瘤 中notch通路的激活可部分地通过有助于管腔上皮细胞分化促进肿瘤 发生。为此，申请人通过由蛋白质印迹法测量hes1的水平研究mmtv
‑ꢀ
erbb2
‑
ires
‑
cre乳腺肿瘤中notch信号激活的水平。如图9a所示， 与年龄匹配的正常乳腺相比，mmtv
‑
erbb2驱动的乳腺肿瘤表达非常 高水平的hes1蛋白。为了研究6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)对 乳腺癌发生的效果，从携带有mmtv
‑
erbb2转基因的fvb小鼠收集 mmtv
‑
erbb2乳腺肿瘤。制备单细胞悬浮液，并向受体fvb
小鼠的 空脂肪垫注射5
×
105个肿瘤细胞。一旦发成可触的肿瘤，即用油或25 mg/kg的6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)每隔一天处理受体小鼠， 直至实验结束。在固定时间间隔测量并记录肿瘤体积。初步结果显示， 与仅用油处理的小鼠相比，用6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理 的荷瘤受体小鼠导致显著的肿瘤生长阻滞(图9b)。该数据表明，6
‑
(4
‑ꢀ
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)具有减缓已确立的乳腺癌的生长的能力。
[0267]6‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)在原发性人t细胞急性淋巴性 白血病中阻断notch信号：
[0268]
为了进一步研究6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)在相关病理条 件下对notch的抑制效果，描绘原发性人tall样品的notch信号激 活。活性形式的notch(nicd)的累积被用作通路激活的生物标记物。 若干个原发性人tall表现出致癌的nicd的累积，且用6
‑
(4
‑
叔丁基 苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理这些肿瘤引起该蛋白质的下调。此外，在 这些原发性人tall样品中nicd的下调与增殖停滞相关(数据未示 出)。相反，不显示可检测的nicd水平的原发性人tall样品对6
‑
(4
‑ꢀ
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)处理不响应(数据未示出)。
[0269]
以上数据表明，nicd的累积可用作notch通路激活的生物标记 物，并预测使用notch抑制剂6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)的处 理结果。
[0270]6‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3)的不同衍生物在dl4
‑
n1共培 养测定中表现出阻断notch信号激活的能力：
[0271]
为提高notch抑制活性和亲代的6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺 (i3)化合物的效力，在dl4
‑
n1共培养测定中测试i3的不同的化学 衍生物。通过对超过40个不同的6
‑
(4
‑
叔丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(i3) 的化学衍生物进行筛选，得到在共培养测定中具有阻断notch通路激 活的能力的下列化合物：
[0272]
i3
‑
a)6
‑
(4
‑
环己基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺
[0273]
i3
‑
b)6
‑
(4
‑
(叔戊基)苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(cas号1036533
‑
91
‑
1)
[0274]
i3
‑
c)4
‑
(4
‑
(叔丁基)苯氧基)苯胺(cas号56705
‑
89
‑
6)
[0275]
i3
‑
d)6
‑
(4
‑
丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺
[0276]
i3
‑
e)4
‑
(4
‑
(叔戊基)苯氧基)苯胺(cas号328032
‑
81
‑
1)
[0277]
i3
‑
f)4
‑
(4
‑
环己基苯氧基)苯胺(cas号70682
‑
64
‑
3)
[0278]
i3
‑
g)6
‑
(4
‑
((3r,5r,7r)
‑
金刚烷
‑1‑
基)苯氧基)吡啶
‑3‑
胺
[0279]
i3
‑
h)6
‑
(3
‑
(叔丁基)苯氧基)吡啶
‑3‑
胺(cas号1098366
‑
43
‑
8)
[0280]
i3
‑
i)4
‑
(4
‑
(叔丁基)苯氧基)
‑3‑
氟苯胺(cas号946785
‑
77
‑
9)
[0281]
i3
‑
j)4
‑
(4
‑
异丙基苯氧基)苯胺
[0282]
i3
‑
k)6
‑
(4
‑
(2,4,4
‑
三甲基戊烷
‑2‑
基)苯氧基)吡啶
‑3‑
胺
[0283]
i3
‑
l)4
‑
(4
‑
环己基苯氧基)
‑3‑
氟苯胺
[0284]
i3
‑
m)3
‑
氟
‑4‑
(4
‑
(叔戊基)苯氧基)苯胺
[0285]
i3
‑
n)6
‑
(4
‑
(2
‑
甲基戊烷
‑2‑
基)苯氧基)吡啶
‑3‑
胺
[0286]
i3
‑
o)4
‑
(4
‑
((3r,5r,7r)
‑
金刚烷
‑1‑
基)苯氧基)苯胺
[0287]
i3
‑
p)4
‑
(4
‑
((3r,5r,7r)
‑
金刚烷
‑1‑
基)苯氧基)
‑3‑
氟苯胺
[0288]
如图10所示，这些衍生物中的一些(i3
‑
a、i3
‑
b、i3
‑
c、i3
‑
e、 i3
‑
g、i3
‑
h、i3
‑
m和i3
‑
n)阻断notch信号至与母体化合物i3相当 的水平，而衍生物i3
‑
f和i3
‑
i似乎具有增强
的活性。
[0289]
实施例3
[0290]
衍生物及其前体的化学合成
[0291]4‑
(2
‑
甲基戊烷
‑2‑
基)苯酚
[0292][0293]
将4
‑
丁酰苯酚(1000mg，6.09mmol，1.00当量)悬浮于甲苯(25ml) 和二氯甲烷(5ml)中，并冷却至0℃。将2m的me3al的甲苯溶液(7 ml，14.01mmol，2.30当量)逐滴加入，借此溶解起始原料。在室温 下搅拌15h后，再次将反应混合物冷却至0℃，并逐滴加入 tmsoso2cf3(1.1ml，6.09mmol，1.00当量)。在室温下搅拌3天后， 将混合物倒入冰水中以淬灭反应。用40％h3po4酸化后，用乙酸乙酯(3x)萃取产物，并用h3po4酸化的饱和nacl溶液洗涤有机层。在30 ℃下减压除去溶剂。用快速柱色谱法纯化所得粗产物(sio2；二氯甲烷 /石油醚1:1至2:1)以获得无色油状的题述化合物(188mg，约90％的 纯度(nmr)，0.95mmol，15％收率)。r
f
＝0.60(二氯甲烷/甲醇4％)。 hrms(esi)计算值c
12
h
17
o
‑
[m
‑
h]
‑
177.1279，实测值：177.1284。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.24
–
7.18(m,2h,芳香氢),6.82
–
6.76(m,2h, 芳香氢),5.12(s,1h,oh),1.60
–
1.52(m,2h,c(ch3)2ch2ch2ch3), 1.27(s,6h,c(ch3)2ch2ch2ch3),1.16
–
1.01(m,2h, c(ch3)2ch2ch2ch3),0.83(t,j＝7.3hz,3h,c(ch3)2ch2ch2ch3)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ153.03,142.29,127.11,114.85,47.35,37.25, 29.23,18.09,14.90。
[0294]
一般操作a：
[0295]
将相应的硝基吡啶或硝基苯和具体的苯酚溶解于dmf或dmso。 加入无水k2co3，并在室温下(除非另外说明)搅拌反应混合物至完 全转化。随后，通过加入h2o以淬灭反应，产物用乙酸乙酯或乙醚萃 取。有机层用1m naoh水溶液(1x)洗涤，随后用饱和nacl水溶液(1x) 洗涤。在30℃下减压除去溶剂至赣州。将残余物重新溶解于二氯甲烷 中，并用棉花过滤，以除去无机盐。用快速柱色谱法纯化粗产物，以 得到相应的题述化合物(i3
‑
n、i3
‑
na至i3
‑
np)。
[0296]2‑
(4
‑
(叔丁基)苯氧基)
‑5‑
硝基吡啶，i3
‑
n
[0297][0298]
依照操作a，将2
‑
氯
‑5‑
硝基吡啶(501mg，3.16mmol，1.00当量) 和4
‑
叔丁基苯酚(611mg，4.07mmol，1.29当量)溶于dmf(6.0ml)。 加入无水k2co3(654mg，4.73mmol，1.50当量)并在室温下搅拌反应 混合物14h。用乙醚萃取后，粗产物通过快速柱色谱法(sio2；乙酸乙 酯/石油醚1:100至1:50)纯化，以得到无色固体状的题述化合物(820 mg，3.01mmol，95％收率)。r
f
＝0.40(乙酸乙酯/石油醚1:20)。hrms(esi) 计算值c
15
h
17
n2o
3
[m h]

273.1234，实测值：273.1229。1h nmr(400 mhz,cdcl3)δ9.06(d,j＝2.8hz,1h,芳香氢),8.46(dd,j＝9.1,2.8hz, 1h,芳香氢),7.53
–
7.42(m,2h,芳香氢),7.17
–
7.05(m,2h,芳香氢), 7.01(d,j＝9.1hz,1h,芳香氢),1.35(s,9h,c(ch3)3).
13
c nmr(101 mhz,cdcl3)δ167.20,150.49,148.98,145.26,140.29,134.95,126.99, 120.84,111.38,34.72,31.57。
[0299]2‑
(4
‑
环己基苯氧基)
‑5‑
硝基吡啶，i3
‑
na
[0300][0301]
依照操作a，将2
‑
氯
‑5‑
硝基吡啶(300mg，1.89mmol，1.00当量) 和4
‑
环己基苯酚(417mg，2.37mmol，1.25当量)溶解于dmso(6ml) 中。加入无水k2co3(397mg，2.87mmol，1.52当量)并在室温下搅拌 反应混合物27h。用乙醚萃取后，粗产品通过快速柱色谱法(sio2；乙 酸乙酯/石油醚1:100至1:75)纯化，以得到无色固体状的题述化合物 (600mg，2.01mmol，定量收率)。r
f
＝0.35(乙酸乙酯/石油醚1:20)。hrms (esi)计算值c
17
h
19
n2o
3
[m h]

299.1390，实测值：299.1392。1h nmr (400mhz,cdcl3)δ9.06(d,j＝2.9hz,1h,芳香氢),8.46(dd,j＝9.1, 2.9hz,1h,芳香氢),7.31
–
7.22(m,2h,芳香氢),7.07(dd,j＝8.7,2.3hz, 2h,芳香氢),7.00(d,j＝9.1hz,1h,芳香氢),2.58
–
2.51(m,1h,环己基 氢),2.01
–
1.64(m,5h,环己基氢),1.56
–
1.10(m,5h,环己基氢)。
13
cnmr(101mhz,cdcl3)δ167.18,150.71,145.88,145.17,140.22, 134.89,128.30,121.12,111.30,44.08,34.59,26.95,26.19。
[0302]5‑
硝基
‑2‑
(4
‑
(叔戊基)苯氧基)吡啶，i3
‑
nb
[0303][0304]
依照操作a，将2
‑
氯
‑5‑
硝基吡啶(303mg，1.91mmol，1.00当量) 和4
‑
叔戊基苯酚(397mg，2.42mmol，1.27当量)溶解于dmso(6ml) 中。加入无水k2co3(403mg，2.92mmol，1.53当量)并在室温下搅拌 反应混合物7h。用乙醚萃取后，粗产物用快速柱色谱法(sio2；乙酸 乙酯/石油醚1:100)纯化，以得到无色固体状的题述化合物(530mg，1.85mmol，97％收率)。r
f
＝0.31(乙酸乙酯/石油醚1:20)。hrms(esi) 计算值c
16
h
19
n2o
3
[m h]

287.1390，实测值：287.1381。1h nmr(400 mhz,cdcl3)δ9.07
–
9.05(m,1h,芳香氢),8.45(dd,j＝9.4,2.4hz,1h, 芳香氢),7.40(d,j＝8.6hz,2h,芳香氢),7.09(d,j＝8.6hz,2h,芳香 氢),6.99(d,j＝9.2hz,1h,芳香氢),1.67(q,j＝7.4hz,2h, ar
‑
c(ch3)2ch2ch3)，1.31(s,6h,ar
‑
c(ch3)2ch2ch3),0.73(t,j＝7.4hz, 3h,ar
‑
c(ch3)2ch2ch3)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ167.17,150.46, 147.34,145.20,140.27,134.90,127.56,120.72,111.28,37.89,37.06, 28.55,9.26。
[0305]1‑
(叔丁基)
‑4‑
(4
‑
硝基苯氧基)苯，i3
‑
nc
[0306][0307]
依照操作a，将4
‑
氟硝基苯(500mg，3.54mmol，1.00当量)和 4
‑
叔丁基苯酚(671mg，4.46mmol，1.26当量)溶解于dmf(6.0ml)中。 加入无水k2co3(857mg，6.20mmol，1.75当量)，并在室温下搅拌反 应混合物52h。用乙酸乙酯萃取后，粗产物用快速柱色谱法(sio2；乙 酸乙酯/石油醚1:100)纯化，以得到淡黄色固体状的题述化合物(860 mg，3.17mmol，89％收率)。r
f
＝0.72(乙酸乙酯/石油醚1:9)。hrms(esi) 计算值c
16
h
18
no
3
[m h]

272.1281，实测值：272.1272。1h nmr(400 mhz,cdcl3)δ8.24
–
8.16(m,2h,芳香氢),7.49
–
7.39(m,2h,芳香
芳香氢),7.13
–
6.92(m,4h,芳香氢),2.57
–
2.50(m,1h,环己基氢), 2.09
–
1.67(m,5h,环己基氢),1.59
–
1.18(m,5h,环己基氢)。
13
c nmr (101mhz,cdcl3)δ163.89,152.61,145.58,142.57,128.66,126.04, 120.49,116.99,44.14,34.72,26.99,26.23。
[0317]2‑
(4
‑
((3r,5r,7r)
‑
金刚烷
‑1‑
基)苯氧基)
‑5‑
硝基吡啶,i3
‑
ng
[0318][0319]
依照操作a，将2
‑
氯
‑5‑
硝基吡啶(300mg，1.89mmol，1.00当量) 和4
‑
金刚烷基苯酚(546mg，2.39mmol，1.26当量)溶解于dmso(6ml) 中。加入无水k2co3(662mg,4.79mmol,2.53eq)，并在室温下搅拌反 应混合物42h。用乙醚萃取后，粗产物用快速柱色谱法(sio2；乙酸乙 酯/石油醚1:100至1:50)纯化，以得到无色固体状的题述化合物(664 mg，1.89mmol，定量收率)。rf＝0.36(乙酸乙酯/石油醚1:20)。hrms (esi)计算值c
21
h
23
n2o
3
[m h]

351.1703，实测值：351.1701。1h nmr (400mhz,cdcl3)δ9.06(d,j＝2.8hz,1h,芳香氢),8.45(dd,j＝9.1, 2.8hz,1h,芳香氢),7.52
–
7.39(m,2h,芳香氢),7.16
–
7.06(m,2h,芳 香氢),7.00(d,j＝9.1hz,1h,芳香氢),2.13
–
2.10(m,3h,金刚烷基氢), 1.94(d,j＝3.0hz,5h,金刚烷基氢),1.87
–
1.70(m,5h,金刚烷基氢)。 13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ167.19,150.51,149.18,145.20,140.26, 134.89,126.53,120.83,111.32,43.35,36.82,36.18,29.02。
[0320]2‑
(3
‑
(叔丁基)苯氧基)
‑5‑
硝基吡啶,i3
‑
nh
[0321][0322]
依照操作a，将2
‑
氯
‑5‑
硝基吡啶(300mg，1.89mmol，1.00当量) 和3
‑
叔丁基苯酚(358mg，2.38mmol，1.26当量)溶解于dmso(6ml) 中。加入无水k2co3(420mg，3.04mmol，1.60当量)，并在室温下搅 拌反应混合物70h。用乙醚萃取后，粗产物用快速柱色谱法(sio2；乙 酸乙酯/石油醚1:100)纯化，以得到无色固体状的题述化合物(512mg， 1.88mmol，99％收率)。r
f
＝0.37(乙酸乙酯/石油醚1:20)。hrms(esi) 计算值c
15
h
17
n2o
3
[m h]

273.1234，实测值：273.1232。1h nmr(400 mhz,cdcl3)δ9.08
–
9.04(m,2h,芳香氢),8.47(dd,j＝9.1,2.8hz,1h, 芳香氢),7.39(t,j＝7.9hz,1h,芳香氢),7.33(ddd,j＝7.9,1.8,1.2hz, 1h,芳香氢),7.17(t,j＝2.1hz,1h,芳香氢),7.01(dd,j＝9.1,0.5hz, 1h,芳香氢),6.98(ddd,j＝7.9,2.4,1.2hz,1h,芳香氢),1.34(s,9h, c(ch3)3)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ167.21,153.88,152.76,145.26, 140.31,134.93,129.50,123.17,118.62,118.47,111.28,35.02,31.36。
[0323]1‑
(4
‑
(叔丁基)苯氧基)
‑2‑
氟
‑4‑
硝基苯，i3
‑
ni
[0324][0325]
依照操作a，将3,4
‑
二氟硝基苯(401mg，2.52mmol，1.00当量) 和4
‑
叔丁基苯酚(477mg，3.18mmol，1.26当量)溶解于dmso(6ml) 中。加入无水k2co3(522mg，3.78mmol，1.50
当量)，并在室温下搅 拌反应混合物19h。用乙醚萃取后，粗产物用快速柱色谱法(sio2；乙 酸乙酯/石油醚1:50)纯化，以得到无色油状的题述化合物(722mg， 2.52mmol，99％收率)。r
f
＝0.54(乙酸乙酯/石油醚1:20)。hrms(esi) 计算值c
16
h
17
fno
3
[m h]

290.1187，实测值：290.1194。1h nmr(400 mhz,cdcl3)δ8.07(dd,j＝10.3,2.7hz,1h,芳香氢),7.96(ddd,j＝9.1, 2.7,1.5hz,1h,芳香氢),7.49
–
7.38(m,2h,芳香氢),7.09
–
6.99(m,2h, 芳香氢),6.96(dd,j＝9.1,8.0hz,1h,芳香氢),1.35(s,9h,c(ch3)3)。 13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ153.35,152.23,151.93,151.82,150.84, 148.70,142.40,142.33,127.29,120.68,120.64,119.38,117.73,117.71, 113.28,113.05,34.65,31.54。
[0326]1‑
(4
‑
环己基苯氧基)
‑2‑
氟
‑4‑
硝基苯，i3
‑
nj
[0327][0328]
依照操作a，将3,4
‑
二氟硝基苯(509mg，3.20mmol，1.00当量) 和4
‑
环己基苯酚(691mg，3.93mmol，1.23当量)溶解于dmso(6ml) 中。加入无水k2co3(664mg，4.81mmol，1.50当量)，并在室温下搅 拌反应混合物23h。用乙醚萃取后，粗产物用快速柱色谱法(sio2；乙 酸乙酯/石油醚1:50)纯化，以得到淡黄色固体状的题述化合物(1002 mg，3.18mmol，99％收率)。r
f
＝0.51(乙酸乙酯/石油醚1:20)。 hrms(esi)计算值c
18
h
19
fno
3
[m h]

316.1343，实测值：316.1348。 1
h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.09(dd,j＝10.3,2.7hz,1h,芳香氢), 7.97(ddd,j＝9.1,2.7,1.4hz,1h,芳香氢),7.33
–
7.22(m,2h,芳香氢), 7.08
–
6.99(m,2h,芳香氢),6.96(dd,j＝9.1,8.0hz,1h,芳香氢), 2.58
–
251(m,1h,环己基氢),1.98
–
1.73(m,5h,环己基氢),1.52
–
1.20 (m,5h,环己基氢)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ153.35,152.51, 152.01,151.90,150.84,145.68,142.39,142.32,128.67,120.70,120.66, 119.73,117.70,117.68,113.30,113.08,44.09,34.69,26.97,26.21。
[0329]2‑
氟
‑4‑
硝基
‑1‑
(4
‑
(叔戊基)苯氧基)苯，i3
‑
nk
[0330][0331]
依照操作a，将3,4
‑
二氟硝基苯(502mg，3.16mmol，1.00当量) 和4
‑
叔戊基苯酚(693mg，4.22mmol，1.34当量)溶解于dmso(6ml) 中。加入无水k2co3(656mg，4.75mmol，1.50当量)，并在室温下搅 拌反应混合物22h。用乙醚萃取后，粗产物用快速柱色谱法(sio2；乙 酸乙酯/石油醚1:50)纯化，以得到淡黄色油状的题述化合物(943mg， 3.11mmol，99％收率)。r
f
＝0.61(乙酸乙酯/pe 1:20)。hrms(esi)计 算值c
17
h
19
no
3
[m h]

304.1343，实测值：304.1332。1h nmr(400 mhz,cdcl3)δ8.08(dd,j＝10.3,2.7hz,1h,芳香氢),7.96(ddd,j＝9.1, 2.7,1.5hz,1h,芳香氢),7.42
–
7.35(m,2h,芳香氢),7.07
–
6.99(m,2h, 芳香氢),6.95(dd,j＝9.1,8.0hz,1h,芳香氢),1.66(q,j＝7.4hz,2h, ar
‑
c(ch3)2ch2ch3),1.31(s,6h,ar
‑
c(ch3)2ch2ch3),0.71(t,j＝7.4 hz,3h,ar
‑
c(ch3)2ch2ch3)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ153.40, 152.19,151.98,151.87,150.88,147.11,127.97,120.71,120.68,119.34, 117.73,117.71,113.11,37.92,37.08,28.64。
[0332]2‑
(4
‑
(2
‑
甲基戊
‑2‑
基)苯氧基)
‑5‑
硝基吡啶,i3
‑
nl
[0333][0334]
依照操作a，将4
‑
(2
‑
甲基戊
‑2‑
基)苯酚(52mg，0.29mmol，1.00当 量)和2
‑
氯
‑5‑
硝基吡啶(57mg，0.36mmol，1.23当量)溶解于dmso(6 ml)中。加入无水k2co3(66mg，0.48mmol，1.65当量)，并在室温下 搅拌反应混合物27h。用乙醚萃取后，粗产物用快速柱色谱法(sio2； 乙酸乙酯/石油醚1:50)纯化，以得到无色固体状的题述化合物(86mg， 0.29mmol，98％收率)。r
f
＝0.50(乙酸乙酯/石油醚1:10)。hrms(esi) 计算值c
17
h
21
n2o
3
[m h]

301.1547，实测值：301.1545。1h nmr(400 mhz,cdcl3)δ9.07(d,j＝2.7hz,1h,芳香氢),8.46(dd,j＝9.1,2.8hz, 1h,芳香氢),7.45
–
7.35(m,2h,芳香氢),7.14
–
7.05(m,2h,芳香氢), 6.99(dd,j＝9.0,0.6hz,1h,芳香氢),1.65
–
1.54(m,2h, c(ch3)2ch2ch2ch3),1.32(s,6h,c(ch3)2ch2ch2ch3),1.19
–
1.05(m, 2h,c(ch3)2ch2ch2ch3),0.84(t,j＝7.3hz,3h, c(ch3)2ch2ch2ch3)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ167.17,150.43, 147.69,145.21,140.26,134.90,127.44,120.72,111.29,47.27,37.74, 29.07,18.08,14.87。
[0335]
(3r,5r,7r)
‑1‑
(4
‑
(4
‑
硝基苯氧基)苯基)金刚烷，i3
‑
nm
[0336][0337]
依照操作a，将4
‑
氟硝基苯(303mg，2.15mmol，1.00当量)和4
‑ꢀ
金刚烷基苯酚(600mg，2.63mmol，1.22当量)溶解于dmso(6ml) 中。加入无水k2co3(450mg，3.26mmol，1.52当量)，并在室温下搅 拌反应混合物20h。用乙醚萃取后，粗产物用快速柱色谱法(sio2；乙 酸乙酯/石油醚1:100至1:50)纯化，以得到淡黄色固体状的题述化合物 (736mg，2.11mmol，98％收率)。r
f
＝0.73(乙酸乙酯/石油醚1:10)。 hrms(esi)计算值c
22
h
24
no
3
[m h]

350.1751，实测值：350.1760。 2h,芳香氢),7.08
–
6.95(m,4h,芳香氢),2.13
–
2.10(m,3h,金刚烷基 氢),1.93(d,j＝2.9hz,6h,金刚烷基氢),1.88
–
1.70(m,6h,金刚烷基 氢)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ163.85,152.30,148.86,142.53, 126.86,126.85,126.03,120.18,117.00,43.40,36.82,36.17,29.03。
[0338]
(3r,5r,7r)
‑1‑
(4
‑
(2
‑
氟
‑4‑
硝基苯氧基)苯基)金刚烷，i3
‑
nn
[0339][0340]
依照操作a，将3,4
‑
二氟硝基苯(303mg，1.90mmol，1.00当量) 和4
‑
金刚烷基苯酚(533mg，2.34mmol，1.23当量)溶解于dmso(6ml) 中。加入无水k2co3(395mg，2.86mmol，1.50当量)，并在室温下搅 拌反应混合物4h。用乙醚萃取后，粗产物用快速柱色谱法(sio2；乙 酸乙酯/石油醚1:100)纯化，以得到无色固体状的题述化合物(703mg， 1.91mmol，定量收率)。r
f
＝0.69(乙酸乙酯/石油醚1:10)。hrms(appi) 计算值c
22
h
22
fno [m] 367.1584，实测值：367.1581。1h nmr(400 mhz,cdcl3)δ8.08(dd,j＝10.3,2.7hz,1h,芳香氢),7.96(ddd,j＝9.1, 2.7,1.5hz,1h,芳香氢),7.46
–
7.36(m,2h,芳香氢),7.06
–
7.00(m,2h, 芳香氢),
6.95(dd,j＝9.1,8.0hz,1h,芳香氢),2.17
–
2.07(m,3h,金刚 烷基氢),1.92(d,j＝2.9hz,5h,金刚烷基氢),1.87
–
1.71(m,5h,金刚 烷基氢)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ153.36,153.35,152.24,152.21, 151.99,151.88,150.85,150.83,148.98,126.89,120.70,120.66,119.44, 119.42,117.72,117.70,113.30,113.07,43.38,36.81,36.17,29.02。
[0341]2‑
(4
‑
异丙基苯氧基)
‑5‑
硝基吡啶，i3
‑
no
[0342][0343]
依照操作a，将2
‑
氯
‑5‑
硝基吡啶(303mg，1.91mmol，1.00当量) 和4
‑
异丙基苯酚(331mg，2.43mmol，1.27当量)溶解于dmf(6.0ml) 中。加入无水k2co3(398mg，2.88mmol，1.51当量)，并在室温下搅 拌反应混合物24h。用乙醚萃取后，粗产物用快速柱色谱法(sio2；乙 酸乙酯/石油醚1:100)纯化，以得到淡黄色固体状的题述化合物(490 mg，1.90mmol，99％收率)。r
f
＝0.40(乙酸乙酯/石油醚1:20)。hrms (esi)计算值c
14
h
15
n2o3 [m h] 259.1077，实测值：259.1072。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.04(d,j＝3.4hz,1h,芳香氢),8.44(dd,j＝ 9.1,2.8hz,1h,芳香氢),7.37
–
7.28(m,2h,芳香氢),7.12
–
7.06(m,2h, 芳香氢),7.03
–
6.97(m,1h,芳香氢),2.96(七重峰,j＝6.9hz,1h, ch(ch3)2),1.30(d,j＝7.0hz,6h,ch(ch3)2)。
13
c nmr(101mhz, cdcl3)δ167.08,150.67,146.49,145.02,140.18,134.81,127.84,121.11, 111.24,33.62,24.03。
[0344]5‑
硝基
‑2‑
(4
‑
(2,4,4
‑
三甲基戊
‑2‑
基)苯氧基)吡啶，i3
‑
np
[0345][0346]
依照操作a，将2
‑
氯
‑5‑
硝基吡啶(303mg，1.91mmol，1.00当量) 和4
‑
叔辛基苯酚(495mg，2.40mmol，1.25当量)溶解于dmso(5ml) 中。加入无水k2co3(426mg，3.08mmol，1.61当量)，并在40℃下 搅拌反应混合物28h。用乙醚萃取后，粗产物用快速柱色谱法(sio2； 乙酸乙酯/石油醚1:50)纯化，以得到无色固体状的题述化合物(598mg， 1.82mmol，95％收率)。r
f
＝0.65(乙酸乙酯/石油醚1:10)。hrms(esi) 计算值c
19
h
25
n2o
3
[m h]

329.1860，实测值：329.1854。1h nmr(400 mhz,cdcl3)δ9.07(d,j＝2.8hz,1h,芳香氢),8.45(dd,j＝9.1,2.8hz, 1h,芳香氢),7.52
–
7.40(m,2h,芳香氢),7.14
–
7.03(m,2h,芳香氢), 6.97(d,j＝9.1hz,1h,芳香氢),1.76(s,2h,ar
‑
c(ch3)2ch2c(ch3)3), 1.40(s,6h,ar
‑
c(ch3)2ch2c(ch3)3),0.75(s,9h, ar
‑
c(ch3)2ch2c(ch3)3)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ167.24,150.49, 148.12,145.30,140.29,134.92,127.78,120.57,111.15,57.28,38.63, 32.55,31.93,31.62。
[0347]
一般操作b：
[0348]
将相应的硝基衍生物(i3
‑
n、i3
‑
na至i3
‑
np)首先溶于甲醇或甲 苯，或直接加至催化剂量的钯(10％)的活性炭粉末的甲醇悬浮液中。 将烧瓶用h2(6x)吹扫，将反应混合物在室温下搅拌至完全转化。随 后用硅藻土过滤反应混合物。30℃下减压除去溶剂，并用快速柱色谱 法纯化粗产物，以获得相应的题述化合物(i3、i3
‑
a至i3
‑
p)。
[0349]6‑
(4
‑
(叔丁基)苯氧基)吡啶
‑3‑
胺，i3
[0350][0351]
依照操作b，将i3
‑
n(300mg，1.10mmol，1.00当量)加入至钯 (10％)的活性炭粉末(82mg，0.08mmol pd，0.07当量)的甲醇悬 浮液(15ml)中。将烧瓶用h2(6x)吹扫，并将反应混合物在室温 下搅拌2h。粗产物用快速柱色谱法(sio2；二氯甲烷/甲醇1％)纯化， 以获得乳白色固体状的题述化合物(250mg，1.03mmol，94％收率)。 r
f
＝0.40(二氯甲烷/甲醇4％)。hrms(esi)计算值c
15
h
19
n2o

[m h]
243.1492，实测值：243.1487。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.69(d,j＝ 3.0hz,1h,芳香氢),7.39
–
7.31(m,2h,芳香氢),7.03(dd,j＝8.6,3.0 hz,1h,芳香氢),7.00
–
6.93(m,2h,芳香氢),6.72(d,j＝8.6hz,1h, 芳香氢),3.48(s,1h,nh2),1.31(s,9h,c(ch3)3)。
13
c nmr(101mhz, cdcl3)δ156.62,153.28,146.33,138.82,134.06,126.86,126.47,119.24, 112.36,34.33,31.52。
[0352]6‑
(4
‑
环己基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺，i3
‑
a
[0353][0354]
依照操作b，将i3
‑
na(201mg，0.67mmol，1.00当量)加至钯(10％) 的活性炭粉末(47mg，0.04mmol pd，0.07当量)的甲醇悬浮液(15ml) 中。将烧瓶用h2(6x)吹扫，并将反应混合物在室温下搅拌5h。粗产物 用快速柱色谱法(sio2；二氯甲烷/甲醇1％)纯化，以得到乳白色固体 状的题述化合物(190mg，0.71mmol，定量收率)。r
f
＝0.36(二氯甲烷/ 甲醇4％)。hrms(esi)计算值c
17
h
21
n2o

[m h]

269.1648，实测值： 269.1643。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.70(d,j＝2.9hz,1h,芳香 氢),7.22
–
7.13(m,2h,芳香氢),7.04(dd,j＝8.6,3.0hz,1h,芳香氢), 7.01
–
6.92(m,2h,芳香氢),6.73(dd,j＝8.8,0.7hz,1h,芳香氢),3.36 (s,2h,nh2),2.51
–
2.44(m,1h,环己基氢),1.97
–
1.67(m,5h,环己基 氢),1.49
–
1.15(m,5h,环己基氢)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ 156.88,153.61,143.47,138.67,134.21,127.92,126.96,119.68,112.38, 43.99,34.68,27.01,26.25。
[0355]6‑
(4
‑
(叔戊基)苯氧基)吡啶
‑3‑
胺，i3
‑
b
[0356][0357]
依照操作b，将i3
‑
nb(200mg，0.70mmol，1.00当量)加入到钯 (10％)的活性炭粉末(52mg，0.05mmol pd，0.07当量)的甲醇悬浮 液(15ml)中。将烧瓶用h2(6x)吹扫，并将反应混合物在室温下搅拌3h。 粗产物用快速柱色谱法(sio2；二氯甲烷/甲醇0.5％)纯化，以得到乳白 色固体状的题述化合物(107mg，0.42mmol，60％收率)。r
f
＝0.41(二 氯甲烷/甲醇4％)。hrms(esi)计算得到c
16
h
21
n2o

[m h]

257.1648， 实测：257.1648。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.73(d,j＝2.9hz,1h, 芳香氢),7.34
–
7.23(m,2h,芳香氢),7.06(dd,j＝8.6,3.0hz,1h,芳香 氢),7.02
–
6.94(m,2h,芳香氢),6.73(d,j＝8.6hz,1h,芳香氢),3.35 (s,2h,nh2),1.62(q,j＝7.4hz,2h,ar
‑
c(ch3)2ch2ch3),1.27(s,6h, ar
‑
c(ch3)2ch2ch3),0.70
(t,j＝7.4hz,3h,ar
‑
c(ch3)2ch2ch3)。
13
cnmr(101mhz,cdcl3)δ156.80,153.36,144.75,138.72,134.30, 127.19,126.97,119.13,112.51,37.63,37.04,28.64,9.26。
[0358]4‑
(4
‑
(叔丁基)苯氧基)苯胺，i3
‑
c
[0359][0360]
依照操作b，将i3
‑
nc(300mg，1.11mmol，1.00当量)加入到钯 (10％)的活性炭粉末(59mg，0.06mmol pd，0.05当量)的甲醇悬浮 液(15ml)中。将烧瓶用h2(6x)吹扫，并将反应混合物在室温下搅拌3.5 h。粗产物用快速柱色谱法(sio2；乙酸乙酯/石油醚1:100至1:10)纯化， 以得到深黄色油状的题述化合物(244mg，1.01mmol，91％收率)。 r
f
＝0.78(二氯甲烷/甲醇4％)。hrms(esi)计算值c
16
h
20
no

[m h]
242.1539实测值：242.1530。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.33
–
7.27(m, 2h,芳香氢),6.91
–
6.84(m,4h,芳香氢),6.72
–
6.66(m,2h,芳香氢), 3.49(s,2h,nh2),1.31(s,9h,c(ch3)3)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ 156.55,149.24,145.05,142.30,126.45,121.08,116.90,116.49,34.33, 31.66。
[0361]6‑
(4
‑
丁基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺，i3
‑
d
[0362][0363]
依照操作b，将i3
‑
nd(170mg，0.62mmol，1.00当量)加入至钯 (10％)的活性炭粉末(53mg，0.05mmol pd，0.08当量)的甲醇悬浮 液(15ml)中。将烧瓶用h2(6x)吹扫，并将反应混合物在室温下搅拌1.5 h。粗产物用快速柱色谱法(sio2；二氯甲烷/甲醇1％)纯化，以得到棕 色油状的题述化合物(133mg，0.55mmol，88％收率)。r
f
＝0.38(二 氯甲烷/甲醇4％)。hrms(esi)计算值c
15
h
19
n2o

[m h]

243.1492， 实测值：243.1485。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.69(d,j＝3.1hz,1h, 芳香氢),7.20
–
7.09(m,2h,芳香氢),7.03(dd,j＝8.6,3.0hz,1h,芳香 氢),7.00
–
6.91(m,2h,芳香氢),6.72(d,j＝8.6hz,1h,芳香氢),3.36(s, 2h,nh2),2.67
–
2.51(m,2h,ar
‑
ch2ch2ch2ch3),1.66
–
1.52 (m,2h,ar
‑
ch2ch2ch2ch3),1.41
–
1.31(m,2h,ar
‑
ch2ch2ch2ch3), 0.93(t,j＝7.3hz,3h,ar
‑
ch2ch2ch2ch3)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3) δ156.83,153.55,138.75,138.26,134.12,129.48,126.90,119.74,112.28, 35.02,33.74,22.40,14.02。
[0364]4‑
(4
‑
(叔戊基)苯氧基)苯胺,i3
‑
e
[0365][0366]
依照操作b，将i3
‑
ne(313mg，1.10mmol，1.00当量)溶于甲醇 (10ml)中并加入至钯(10％)的活性炭粉末(52mg，0.05mmol pd， 0.04当量)的甲醇悬浮液(5ml)中。将烧瓶用h2(6x)吹扫，并将反应混 合物在室温下搅拌3h。粗产物通过薄层sio2(二氯甲烷/甲醇4％)过滤 以纯化，得到乳白色油状的题述化合物(293mg，1.15mmol，定量收 率)。r
f
＝0.09(乙酸乙酯/石油醚1:20)。hrms(esi)计算值c
17
h
22
n2o
[m h]

256.1696，实测值：256.1692。1h nmr
(400mhz,cdcl3)δ 7.29
–
7.19(m,2h,芳香氢),6.98
‑
6.81(m,4h,芳香氢),6.76
–
6.61(m, 2h,芳香氢),3.47(s,2h,nh2),1.63(q,j＝7.4hz,2h, ar
‑
c(ch3)2ch2ch3),1.28(s,6h,ar
‑
c(ch3)2ch2ch3),0.71(t,j＝7.4 hz,3h,ar
‑
c(ch3)2ch2ch3)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ156.45, 149.08,143.29,142.55,127.08,121.04,116.79,116.33,37.50,37.06, 28.69,9.27。
[0367]4‑
(4
‑
环己基苯氧基)苯胺，i3
‑
f
[0368][0369]
依照操作b，将i3
‑
nf(352mg，1.18mmol，1.00当量)溶于甲苯(5 ml)中，并加入至钯(10％)的活性炭粉末(38mg，0.04mmol pd，0.03 当量)的甲醇悬浮液(10ml)中。将烧瓶用h2(6x)吹扫，并将反应混合 物在室温下搅拌2h。粗产物用快速柱色谱法(sio2；二氯甲烷)纯化， 以得到乳白色固体状的题述化合物(315mg，1.18mmol，定量收率)。 r
f
＝0.86(二氯甲烷/甲醇4％)。hrms(esi)计算值c
18
h
22
no

[m h]
268.1696，实测值：268.1692。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.17
–
7.07 (m,2h,芳香氢),6.94
–
6.82(m,4h,芳香氢),6.72
–
6.62(m,2h,芳香 氢),3.49(s,2h,nh2),2.51
–
2.44(m,1h,环己基氢),1.98
–
1.68(m,5h, 环己基氢),1.46
–
1.21(m,5h,环己基氢)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3) δ156.87,149.13,142.53,142.05,127.81,121.02,117.22,116.33,43.90, 34.79,27.05,26.27。
[0370]6‑
(4
‑
((3r,5r,7r)
‑
金刚烷
‑1‑
基)苯氧基)吡啶
‑3‑
胺，i3
‑
g
[0371][0372]
依照操作b，将i3
‑
ng(278mg，0.79mmol，1.00当量)溶于甲苯 (10ml)中，并加入至钯(10％)的活性炭粉末(56mg，0.05mmol pd， 0.07当量)的甲醇悬浮液(10ml)中。将烧瓶用h2(3x)吹扫，并将反应 混合物在室温下搅拌3h。粗产物用快速柱色谱法(sio2；二氯甲烷/ 甲醇0％
‑
1％)纯化，以得到无色固体状的题述化合物(176mg，0.55 mmol，69％收率)。r
f
＝0.43(二氯甲烷/甲醇4％)。hrms(esi)计算值 c
21
h
25
n2o

[m h]

321.1961；实测值：321.1959。1h nmr(400mhz, cdcl3)δ7.71(d,j＝3.0hz,1h,芳香氢),7.37
–
7.29(m,2h,芳香氢), 7.08
–
6.96(m,3h,芳香氢),6.74(d,j＝8.6hz,1h,芳香氢),3.40(s,2h, nh2),2.12
–
2.09(m,3h,金刚烷基氢),1.93(dd,j＝9.7,3.0hz,5h,金 刚烷基氢),1.86
–
1.70(m,5h,金刚烷基氢)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3) δ156.73,153.37,151.35,146.65,138.76,134.15,128.14,126.86,126.06, 125.54,124.88,119.29,112.40,43.36,43.22,36.87,36.84,35.87,29.02。
[0373]6‑
(3
‑
(叔丁基)苯氧基)吡啶
‑3‑
胺，i3
‑
h
[0374][0375]
依照操作b，将i3
‑
nh(362mg，1.33mmol，1.00当量)溶于甲醇 (10ml)中，并加入至
钯(10％)的活性炭粉末(44mg，0.04mmol pd，0.03当量)的甲醇悬浮液(5ml)中。将烧瓶用h2(5x)吹扫，并将反应混 合物在室温下搅拌2h。粗产物用快速柱色谱法(sio2；二氯甲烷/甲醇 0％
‑
1％)纯化，以得到浅棕色油状的题述化合物(303mg，1.25mmol， 94％收率)。r
f
＝0.44(二氯甲烷/甲醇4％)。hrms(esi)计算值 c
15
h
19
n2o

[m h]

243.1492，实测值：243.1493。1h nmr(400mhz, cdcl3)δ7.92(d,j＝3.0hz,1h,芳香氢),7.48
–
7.40(m,1h,芳香氢), 7.32(ddd,j＝7.8,1.9,1.0hz,1h,芳香氢),7.29
–
7.27(m,1h,芳香氢), 7.24(d,j＝3.0hz,1h,芳香氢),7.01(ddd,j＝8.0,2.4,1.0hz,1h,芳香 氢),6.92(dd,j＝8.6,0.7hz,1h,芳香氢),3.40(s,2h,nh2)1.48(s,9h, c(ch3)3).
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ156.81,155.65,153.31,138.69, 134.40,129.10,126.99,120.85,117.23,116.69,112.54,34.89,31.41。
[0376]4‑
(4
‑
(叔丁基)苯氧基)
‑3‑
氟苯胺，i3
‑
i
[0377][0378]
依照操作b，将i3
‑
ni(501mg，1.73mmol，1.00当量)溶于甲醇(13 ml)中，并加入至钯(10％)的活性炭粉末(56mg，0.05mmol pd，0.03 当量)的甲醇悬浮液(2ml)中。将烧瓶用h2(5x)吹扫，并将反应混合物 在室温下搅拌1.5h。粗产物用快速柱色谱法(sio2；二氯甲烷)纯化， 以得到无色固体状的题述化合物(455mg，1.75mmol，定量收率)。r
f
＝ 0.76(二氯甲烷/甲醇1％)。hrms(esi)计算值c
16
h
19
fno

[m h]
260.1445，实测值：260.1442。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.37
–
7.29(m, 2h,芳香氢),6.94(t,j＝8.8hz,1h,芳香氢),6.91
–
6.85(m,2h,芳香 氢),6.52(dd,j＝12.0,2.7hz,1h,芳香氢),6.42(ddd,j＝8.6,2.7,1.3hz, 1h,芳香氢),3.61(s,2h,nh2),1.33(s,9h,c(ch3)3)。
13
c nmr(101 mhz,cdcl3)δ156.58,156.44,154.12,145.02,144.42,144.33,134.83, 134.71,126.41,123.92,123.90,115.43,110.97,110.93,103.93,103.72, 34.25,31.59。
[0379]4‑
(4
‑
环己基苯氧基)
‑3‑
苯胺，i3
‑
j
[0380][0381]
依照操作b，将i3
‑
nj(550mg，1.74mmol，1.00当量)溶于甲醇 (12ml)中，并加入至钯(10％)的活性炭粉末(46mg，0.04mmol pd， 0.03当量)的甲醇悬浮液(3ml)中。将烧瓶用h2(6x)吹扫，并将反应混 合物在室温下搅拌2h。粗产物用快速柱色谱法(sio2；二氯甲烷/石油 醚1:1至2:1)纯化，以得到浅玫红色固体状的题述化合物(489mg，1.71 mmol，98％收率)。r
f
＝0.81(二氯甲烷/甲醇4％)。hrms(esi)计算值 c
18
h
21
fno

[m h]

286.1602，实测值：286.1613。1h nmr(400mhz, cdcl3)δ7.19
–
7.10(m,2h,芳香氢),6.93(t,j＝8.8hz,1h,芳香氢), 6.90
–
6.83(m,2h,芳香氢),6.51(dd,j＝12.1,2.7hz,1h,芳香氢),6.41 (ddd,j＝8.6,2.7,1.2hz,1h,芳香氢),3.66(s,2h,nh2),2.52
–
2.45(m, 1h,环己基氢),1.96
–
1.72(m,5h,环己基氢),1.53
–
1.18(m,5h,环己 基氢)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ156.74,156.55,154.09,144.39, 144.30,142.04,134.86,134.74,127.79,123.89,115.76,110.93,
110.90, 103.90,103.69,43.80,34.72,26.99,26.22。
[0382]3‑
氟
‑4‑
(4
‑
(叔戊基)苯氧基)苯胺，i3
‑
k
[0383][0384]
依照操作b，将i3
‑
nk(497mg，1.64mmol，1.00当量)溶于甲醇 (13ml)中，并加入至钯(10％)的活性炭粉末(28mg，0.03mmol pd， 0.02当量)的甲醇悬浮液(2ml)中。将烧瓶用h2(6x)吹扫，并将反应混 合物在室温下搅拌1.5h。粗产物用快速柱色谱法(sio2；乙酸乙酯/ 石油醚1:10至1:7.5)纯化，以得到橙色油状的题述化合物(463mg， 1.69mmol，定量收率)。r
f
＝0.28(乙酸乙酯/石油醚1:5)。hrms(esi) 计算值c
17
h
21
fno

[m h]

274.1602，实测值：274.1599。1h nmr(400 mhz,cdcl3)δ7.26
–
7.17(m,2h,芳香氢),6.92(t,j＝8.8hz,1h,芳香 氢),6.89
–
6.80(m,2h,芳香氢),6.51(dd,j＝12.0,2.7hz,1h,芳香氢), 6.42(ddd,j＝8.7,2.7,1.2hz,1h,芳香氢),3.65(s,2h,nh2),1.61(q, j＝7.4hz,2h,ar
‑
c(ch3)2ch2ch3),1.26(s,6h,ar
‑
c(ch3)2ch2ch3), 0.69(t,j＝7.4hz,3h,ar
‑
c(ch3)2ch2ch3)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3) δ156.61,156.37,154.15,144.34,144.25,143.34,134.98,134.86,123.95, 123.92,115.41,110.98,110.95,104.00,103.78,37.07,28.68,9.26。
[0385]6‑
(4
‑
(2
‑
甲基戊
‑2‑
基)苯氧基)吡啶
‑3‑
胺，i3
‑
l
[0386][0387]
依照操作b，将i3
‑
nl(50mg，0.17mmol，1.00当量)溶解于甲醇 (12ml)中，并加入至钯(10％)的活性炭粉末(31mg，0.03mmol pd， 0.17当量)的甲醇悬浮液(3ml)中。将烧瓶用h2(6x)吹扫，并将反应混 合物在室温下搅拌1.5h。粗产物用快速柱色谱法(sio2；二氯甲烷/ 甲醇1％)纯化，以得到淡橙色油状的题述化合物(39mg，0.14mmol， 87％收率)。r
f
＝0.41(二氯甲烷/甲醇4％)。hrms(esi)计算值 c
17
h
23
n2o

[m h]

271.1805，实测值：271.1796。1h nmr(400mhz, cdcl3)δ7.73(d,j＝2.9hz,1h,芳香氢),7.32
–
7.26(m,2h,芳香氢), 7.07(dd,j＝8.6,3.0hz,1h,芳香氢),7.01
–
6.94(m,2h,芳香氢),6.74 (d,j＝8.6hz,1h,芳香氢),3.35(s,2h,nh2),1.61
–
1.51(m,2h, c(ch3)2ch2ch2ch3),1.27(s,6h,c(ch3)2ch2ch2ch3),1.16
–
1.01(m, 2h,c(ch3)2ch2ch2ch3),0.82(t,j＝7.3hz,3h,c(ch3)2ch2ch2ch3)。 13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ156.82,153.32,145.10,138.67,134.32, 128.12,127.09,126.99,119.62,119.13,112.53,47.31,37.49,29.17,18.08, 14.90。
[0388]4‑
(4
‑
((3r,5r,7r)
‑
金刚烷
‑1‑
基)苯氧基)苯胺，i3
‑
m
[0389][0390]
依照操作b，将i3
‑
nm(615mg，1.76mmol，1.00当量)溶于甲苯 (15ml)，并加入至钯(10％)的活性炭粉末(126mg，0.12mmol pd， 0.07当量)的甲醇悬浮液(10ml)中。将烧瓶用h2(6x)吹扫，并将反应 混合物在室温下搅拌19h。粗产物用快速柱色谱法(sio2；二氯甲烷) 纯化，以得到乳白色固体状的题述化合物(538mg，1.68mmol，96％ 收率)。r
f
＝0.39(二氯甲
烷/甲醇1％)。hrms(esi)计算值c
22
h
26
no
[m h]

320.2009，实测值：320.2006。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ 7.32
–
7.25(m,2h,芳香氢),6.93
–
6.86(m,4h,芳香氢),6.72
–
6.65(m, 2h,芳香氢),3.56(s,2h,nh2),2.14
–
2.06(m,3h,金刚烷基氢),1.90(d, j＝2.9hz,5h,金刚烷基氢),1.84
–
1.71(m,5h,金刚烷基氢)。
13
cnmr(101mhz,cdcl3)δ156.59,149.02,145.32,142.51,125.98, 121.10,116.84,116.34,43.45,36.88,35.78,29.07。
[0391]4‑
(4
‑
((3r,5r,7r)
‑
金刚烷
‑1‑
基)苯氧基)
‑3‑
氟苯胺，i3
‑
n
[0392][0393]
依照操作b，将i3
‑
nn(570mg，1.55mmol，1.00当量)溶于甲 苯(10ml)中，加入至钯(10％)的活性炭粉末(143mg，0.13mmolpd，0.09当量)的甲醇悬浮液(10ml)中。将烧瓶用h2(6x)吹扫， 并将反应混合物在室温下搅拌7h。粗产物用快速柱色谱法(sio2；二 氯甲烷)纯化，以获得无色固体状的题述化合物(510mg，1.51mmol， 97％收率)。r
f
＝0.67(二氯甲烷/甲醇1％)。hrms(esi)计算值 c
22
h
25
fno

[m h]

338.1915，实测值：338.1916。1h nmr(400mhz, cdcl3)δ7.32
–
7.23(m,2h,芳香氢),6.92(t,j＝8.8hz,1h,芳香氢), 6.89
–
6.81(m,2h,芳香氢),6.51(dd,j＝12.0,2.7hz,1h,芳香氢), 6.41(ddd,j＝8.7,2.7,1.2hz,1h,芳香氢),3.64(s,2h,nh2),2.11
–ꢀ
2.07(m,3h,金刚烷基h),1.89(d,j＝2.9hz,5h,金刚烷基h),1.83
–ꢀ
1.70(m,5h,金刚烷基h)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ156.60, 156.47,154.15,145.37,144.33,144.24,134.91,134.79,125.98,123.97, 123.95,115.47,110.98,110.95,103.98,103.76,43.43,36.86,35.76, 29.06。
[0394]6‑
(4
‑
异丙基苯氧基)吡啶
‑3‑
胺,i3
‑
o
[0395][0396]
依照操作b，将i3
‑
no(202mg，0.78mmol，1.00当量)加入至钯 (10％)的活性炭粉末(76mg，0.07mmol pd，0.09当量)的甲醇悬 浮液(15ml)中。将烧瓶用h2(6x)吹扫，并将反应混合物在室温 下搅拌1h。粗产物用快速柱色谱法纯化(sio2；二氯甲烷/甲醇1％)， 以获得乳白色固体状的题述化合物(150mg，0.66mmol，84％收率)。 r
f
＝0.42(二氯甲烷/甲醇4％)。hrms(esi)计算值c
14
h
17
n2o

[m h]
229.1335，实测值：229.1326。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.70(d,j＝ 2.9hz,1h,芳香氢),7.24
–
7.14(m,2h,芳香氢),7.05(dd,j＝8.6,3.0 hz,1h,芳香氢),7.01
–
6.93(m,2h,芳香氢),6.73(d,j＝8.6hz,1h, 芳香氢),3.33(s,2h,nh2),2.89(七重峰,j＝6.9hz,1h,ch(ch3)2), 1.24(d,j＝7.0hz,6h,ch(ch3)2)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ 156.88,153.59,144.19,138.68,134.19,127.55,126.97,119.76,112.35, 77.48,77.16,76.84,33.57,24.20。
[0397]6‑
(4
‑
(2,4,4
‑
三甲基戊
‑2‑
基)苯氧基)吡啶
‑3‑
胺，i3
‑
p
[0398]
[0399]
依照操作b，将i3
‑
np(283mg，0.86mmol，1.00当量)溶解于 甲苯(4ml)中，并加入至钯(10％)的活性炭粉末(78mg，0.07mmolpd，0.09当量)的甲醇悬浮液(15ml)中。将烧瓶用h2(5x)吹扫， 并将反应混合物在室温下搅拌2h。粗产物用快速柱色谱法纯化(sio2； 二氯甲烷/甲醇2％)，以获得无色固体状的题述化合物(235mg，0.79 mmol，91％收率)。r
f
＝0.49(二氯甲烷/甲醇4％)。hrms(esi)计 算值c
19
h
27
n2o

[m h]

299.2118，实测值：299.2112.1h nmr(400 mhz,cdcl3)δ7.73(dd,j＝3.0,0.7hz,1h,芳香氢),7.37
–
7.29(m,2h, 芳香氢),7.06(dd,j＝8.6,3.0hz,1h,芳香氢)，6.99
–
6.93(m,2h,芳香 氢)，6.71(dd,j＝8.6,0.7hz,1h,芳香氢)，3.10(s,2h,nh2),1.72(s,2h, ar
‑
c(ch3)2ch2c(ch3)3),1.36(s,6h,ar
‑
c(ch3)2ch2c(ch3)3),0.73(s, 9h,ar
‑
c(ch3)2ch2c(ch3)3)。
13
c nmr(101mhz，cdcl3)δ156.87, 153.39,145.48,138.70,134.39,127.37,126.94,118.96,112.41,57.20, 38.36,32.50,31.93,31.68。