抑制淀粉样β蛋白聚集的小分子化合物和制备方法及其应用与流程

toxicology,2013,28:579
‑
587；toxicology and applied pharmacology,2013,266:76
‑
85)。利用动力学实验进行比较可知，在等质量浓度下，ga的抑制效果高于egcg。因此，推测ga特有的羧基对具有高度结构依赖性的多酚是至关重要的。
5.本发明基于ga进行设计，将ga的羧基与谷氨酰胺的主链氨基结合，得到4
‑
氨基甲酰基
‑2‑
[(3,4,5
‑
三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物(4
‑
carbamoyl
‑2‑
[(3,4,5
‑
trihydroxyphenyl)formamido]butanoic acid,ctfba)，ctfba与aβ之间具有较高的亲和力，能够在低浓度下有效地抑制aβ的聚集。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是克服现有技术的不足，合成一种具有抑制淀粉样β蛋白聚集功能的小分子化合物，并提供该小分子化合物的制备方法及其在抑制β
‑
淀粉样蛋白聚集中的应用。
[0007]
所述的4
‑
氨基甲酰基
‑2‑
[(3,4,5
‑
三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物不仅对aβ聚集具有显著的抑制效果，抑制淀粉样β蛋白聚集的效果一般要好于同类的小分子。4
‑
氨基甲酰基
‑2‑
[(3,4,5
‑
三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物还能够清除ad模型秀丽隐杆线虫cl2006体内的淀粉样斑块并延长线虫寿命，同时，4
‑
氨基甲酰基
‑2‑
[(3,4,5
‑
三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物具有穿透血脑屏障的能力，效果优于多肽类和蛋白类抑制剂。
[0008]
本发明是通过以下技术手段实现的：
[0009]
一种抑制淀粉样β蛋白聚集的小分子化合物，使3,4,5
‑
三羟基苯甲酸的羧基与谷氨酰胺的主链氨基反应，获得4
‑
氨基甲酰基
‑2‑
[(3,4,5
‑
三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物(4
‑
carbamoyl
‑2‑
[(3,4,5
‑
trihydroxyphenyl)formamido]butanoic acid,ctfba)。反应式如下：
[0010][0011]
本发明提供的一种小分子化合物，具有抑制淀粉样β蛋白聚集功能的小分子化合物和制备方法及其在抑制淀粉样β蛋白聚集中的应用，具有如下的优势：
[0012]
第一，小分子化合物4
‑
氨基甲酰基
‑2‑
[(3,4,5
‑
三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物在5
‑
25μm的浓度范围内能够有效抑制aβ
42
的聚集，显著减少aβ
42
聚集过程中β
‑
sheet结构的生成。
[0013]
第二，小分子化合物4
‑
氨基甲酰基
‑2‑
[(3,4,5
‑
三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物能够改变aβ
42
的聚集形态，抑制淀粉样蛋白纤维的生成。
[0014]
第三，小分子化合物4
‑
氨基甲酰基
‑2‑
[(3,4,5
‑
三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物能够抑制ad模型秀丽隐杆线虫cl2006体内淀粉样斑块的形成，清除cl2006的运动障碍。
[0015]
第四，小分子化合物4
‑
氨基甲酰基
‑2‑
[(3,4,5
‑
三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物能够抑制cl2006体内表达的aβ
42
聚集诱导产生的毒性，并将cl2006的寿命延长了三分之一，是aβ
42
聚集的理想抑制剂。
[0016]
第五，小分子化合物4
‑
氨基甲酰基
‑2‑
[(3,4,5
‑
三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物能够使aβ
42
寡聚体抗体a11和aβ
42
纤维抗体oc的免疫反应活性迅速降低，能够显著抑制aβ
42
聚集过程中寡聚体和纤维的生成。
[0017]
第六，小分子化合物4
‑
氨基甲酰基
‑2‑
[(3,4,5
‑
三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物对aβ
42
聚集的抑制效果既强于同类的小分子类抑制剂egcg，又优于异类的多肽类抑制剂lk7和蛋白类抑制剂bsa
‑
b。
[0018]
第七，小分子化合物4
‑
氨基甲酰基
‑2‑
[(3,4,5
‑
三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物既强于不具有血脑屏障穿透能力的多肽类抑制剂lk7和蛋白类抑制剂bsa
‑
b，又优于同样具有血脑屏障穿透能力的小分子类抑制剂egcg，由此表明ctfba具有良好的血脑屏障渗透性。
附图说明
[0019]
图1：实施例1中不同浓度ctfba与aβ
42
共培养48h后培养物的tht荧光图。
[0020]
图2：实施例2中等摩尔浓度比的ctfba与aβ
42
共培养48h后培养物的形貌图。
[0021]
图3：实施例3中ctfba清除秀丽隐杆线虫cl2006体内淀粉样斑块的荧光显微镜图。
[0022]
图4：实施例4中ctfba与秀丽隐杆线虫cl2006共培养后cl2006的存活率。
[0023]
图5：实施例5中ctfba对aβ
42
寡聚体抗体a11和纤维抗体oc的免疫活性的抑制。
[0024]
图6：ctfba与同类和异类aβ聚集抑制剂tht荧光强度的比较图。
[0025]
图7：ctfba与同类和异类aβ聚集抑制剂对血脑屏障的渗透性的比较图。
具体实施方式
[0026]
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0027]
本发明在3,4,5
‑
三羟基苯甲酸的羧基上偶联谷氨酰胺，制备得到4
‑
氨基甲酰基
‑2‑
[(3,4,5
‑
三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物(ctfba)。多种实验手段证明，4
‑
氨基甲酰基
‑2‑
[(3,4,5
‑
三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物可以高于5μm的浓度下显著抑制aβ
42
的聚集，清除ad模型秀丽隐杆线虫cl2006体内的淀粉样沉积，且能够延长cl2006的存活期。此外，4
‑
氨基甲酰基
‑2‑
[(3,4,5
‑
三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物具有良好的血脑屏障渗透性。4
‑
氨基甲酰基
‑2‑
[(3,4,5
‑
三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物抑制aβ
42
聚集的能力是通过tht荧光和原子力显微镜等方法测定的，其清除cl2006体内的淀粉样沉积和延长cl2006存活期的能力是通过荧光显微镜实验和生存周期实验测定的，4
‑
氨基甲酰基
‑2‑
[(3,4,5
‑
三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物的血脑屏障渗透性是通过平行人工膜渗透法测定的。
[0028]
实施例1：不同浓度ctfba与aβ
42
共培养48h后培养物的tht荧光强度。
[0029]
将纯度为95％的aβ
42
以1.0mg/ml的浓度溶于六氟异丙醇(hexafiuro
‑2‑
isopropanol，hfip)中，冰浴超声30min破坏已形成的聚集体，于4℃条件下静置2h使其充分溶解，然后在4℃、16000g转速下离心20min，取75％上清液置于
‑
70℃冰箱中过夜冻实。最后放入到冷冻干燥机中，将aβ
42
冻干成棉絮状后置于
‑
20℃冰箱保存。
[0030]
将已冻干的aβ
42
溶于20mm的naoh溶液中，冰浴超声10min使之充分溶解，得到浓度为275μm的aβ
42
母液。用含27.5μm tht的hepes缓冲液(20mm,，ph 7.4，含100mm nacl)稀释，
得到终浓度为25μm的aβ
42
溶液，作为对照实验。
[0031]
称取ctfba分别溶于20mm地hepes缓冲液(ph 7.4，含100mm nacl)中，获得浓度为2.75,2.75,5.5,13.75和27.5μm的抑制剂溶液。取浓度为275μm的aβ
42
母液，分别用不同浓度的抑制剂溶液稀释，获得终浓度分别为1.25,2.5,5,12.5和25μm的抑制剂和25μm的aβ
42
溶液。将这些不同浓度的溶液连同对照溶液在37℃，150rpm条件下进行培养48h。
[0032]
称取0.80mg的tht溶于100ml的hepes缓冲液(20mm,，ph 7.4，含100mm nacl)中，配制终浓度为25μm的tht溶液。取200μl培养时间48h的样品与2ml 25μm的tht溶液混合，在440nm激发波长和480nm发射波长下检测荧光强度，每组做三次平行，激发和发射缝宽均为5nm，扫描速度为100nm/min。将不同浓度抑制剂在480nm处的荧光强度作图，如图1所示。
[0033]
从图1可以看出，ctfba能够有效抑制aβ
42
的聚集，且呈浓度依赖性，最佳浓度范围为5
‑
25μm。
[0034]
实施例2：ctfba对aβ
42
聚集形态的影响。
[0035]
按实施例1方法配置aβ
42
母液，用hepes缓冲液(20mm,，ph 7.4，含100mm nacl)稀释，得到终浓度为25μm的aβ
42
溶液。再配制含有25μm ctfba的aβ
42
溶液，溶液中aβ
42
的终浓度为25μm。将上述溶液于37℃，150rpm条件下进行培养。培养48h后，取20μl滴在云母片上，静置10min，使样品与云母表面充分结合。随后用去离子水缓慢洗涤7次，去除缓冲液中的盐离子，静置晾干。用原子力显微镜(cspm5500，本原)的轻敲模式进行观测。如图2示。
[0036]
从图2a可以看出，aβ
42
单独培养48h后形成密集的纤维状聚集体，图2b中ctfba与aβ
42
共同培养后，纤维几乎完全消失，形成少量不定形的聚集体，表明ctfba能够显著减少aβ
42
纤维的生成量，并改变aβ
42
的聚集形态。
[0037]
实施例3：ctfba对秀丽隐杆线虫cl2006体内淀粉样斑块的清除作用。
[0038]
首先配制nmg培养基，称取17g琼脂粉、2.5g蛋白胨和3g氯化钠加入锥形瓶，加入去离子水至1l，在120℃条件下高温灭菌20分钟，待冷却至70℃，向锥形瓶中依次加入25ml的1m的磷酸二氢钾、1ml的1m的硫酸镁、1ml的5mg/ml的胆固醇和1ml的1m的氯化钙，摇匀后导入平板中，晾干后备用。
[0039]
配制lb液体培养基，称取2g蛋白胨、1g酵母粉和2g氯化钠加入锥形瓶，加入去离子水至200ml，挑取大肠杆菌op50至lb液体培养基中，在37℃和220rpm的条件下放于摇床中培养12h。将培养好的op50菌液涂至ngm培养基中，每个平板滴入200μl，待菌液晾干后倒置放入4℃冰箱中备用。
[0040]
将200μl的25μm的ctfba加入带有op50的ngm培养基中，待液体干燥后，挑取10条l4阶段的ad模型秀丽隐杆线虫突变型cl2006于培养皿中，并设置相应的无ctfba的空白对照组。培养3天后，利用4％组织细胞固定液将培养皿中的线虫冲洗下来，在4℃条件下固定24h，再利用10μm的tht溶液染色4h。将染色后的线虫置于载玻片上，利用倒置荧光显微镜(te2000
‑
u,nikon,japan)进行观察。如图3所示。
[0041]
从图3a可以看出，突变型cl2006中出现明显的荧光斑点，表明大量淀粉样斑块的生成。图3b中加入25μm的ctfba时，cl2006中的大量淀粉样斑块消失，表明ctfba能够抑制cl2006体内淀粉样斑块的形成。
[0042]
实施例4：ctfba对秀丽隐杆线虫cl2006存活率的影响。
[0043]
按照实施例3的方法准备带有op50的ngm培养基，向培养基中接入200μl的25μm的
ctfba，并设置相应的无ctfba的空白对照组。向培养基中分别加入300μl的150μm的5
‑
氟
‑2′‑
脱氧尿苷抑制线虫产卵。待液体干燥后，分别挑取60条l4阶段的cl2006线虫至培养皿中，每天记录培养皿中存活的线虫数量，直至所有线虫死亡。为保证充足的食物供给，每3天进行一次转板。如图4所示。
[0044]
从图4可以看出，突变型cl2006单独培养的生存周期约为12天，加入25μm ctfba时，从培养初始阶段起，cl2006的死亡率即出现明显的降低，直至第16天线虫才全部死亡，表明ctfba能够降低cl2006的瘫痪率，清除cl2006的运动障碍，抑制cl2006体内表达的aβ
42
聚集诱导的细胞毒性，从而将cl2006的寿命延长了三分之一。
[0045]
实施例5：ctfba对aβ
42
寡聚体抗体a11和纤维抗体oc的免疫活性的抑制
[0046]
按实施例1方法配置aβ
42
溶液，将aβ
42
(25μm)单独培养或与不同浓度的ctfba(1.25μm、5μm、25μm)共同培养0h和48h，分别取10μl滴在硝酸纤维素膜(0.2μm)上，放置室温下干燥。用10％的脱脂奶粉震荡1h，用于封闭硝酸纤维素膜上的非特异性蛋白结合。随后用tbst缓冲液(20mm tris
‑
hcl,150mm nacl,0.05％tween 20,ph＝7.4)对膜进行清洗(5min
×
3)，分别加入一抗6e10(针对所有种类的aβ,1:5000)、a11(针对aβ寡聚体,1:2000)和oc(针对aβ纤维,1:3000)室温震荡1h，用tbst对膜进行清洗(5min
×
3)。其中，由于商品化的一抗a11敏感度较低，因此加大硝酸纤维膜上的样品量，取100μl样品，分10次滴于膜上，每次滴10μl。随后用辣根过氧化物酶标记的二抗羊抗兔igg(1:5000)和羊抗鼠igg(1:1000)室温震荡1h，用tbst对膜进行清洗(5min
×
3)以去除未结合的二抗。最后用ecl化学发光试剂盒进行显色。
[0047]
从图5a可以看出，在0h时，aβ
42
寡聚体抗体a11的免疫反应活性呈现轻微阳性，培养48h后，单独aβ
42
的免疫反应活性迅速增强，表明aβ
42
聚集过程中产生了较多的寡聚体。当加入不同浓度的ctfba共同培养时，ctfba可使a11的免疫反应活性迅速降低，表明ctfba能够显著抑制aβ
42
聚集过程中寡聚体的生成。从图5b可以看出，ctfba能够使aβ
42
纤维抗体oc的免疫反应活性迅速减弱，随着ctfba浓度的升高，斑点印记逐渐变浅至几近消失，表明ctfba能够显著抑制aβ
42
纤维的生成。
[0048]
实施例6：ctfba与同类和异类aβ聚集抑制剂tht荧光强度的比较
[0049]
按实施例1方法配置aβ
42
母液，用hepes缓冲液(20mm,，ph 7.4，含100mm nacl)稀释，得到终浓度为25μm的aβ
42
溶液。称取小分子ctfba、同类的小分子抑制剂egcg、多肽类抑制剂lvffark(lk7)和蛋白类抑制剂碱化的牛血清白蛋白(bsa
‑
b)分别溶于20mm地hepes缓冲液(ph 7.4，含100mm nacl)中，获得浓度为27.5μm的抑制剂溶液。取浓度为275μm的aβ
42
母液，用27.5μm的抑制剂溶液稀释，获得终浓度为25μm的抑制剂和25μm的aβ
42
溶液。将这些不同浓度的溶液连同对照溶液在37℃，150rpm条件下进行培养48h。
[0050]
称取0.80mg的tht溶于100ml的hepes缓冲液(20mm,，ph 7.4，含100mm nacl)中，配制终浓度为25μm的tht溶液。取200μl培养时间48h的样品与2ml 25μm的tht溶液混合，在440nm激发波长和480nm发射波长下检测荧光强度，每组做三次平行，激发和发射缝宽均为5nm，扫描速度为100nm/min。将不同浓度抑制剂在480nm处的荧光强度作图，如图6所示。
[0051]
从图6可以看出，25μm的ctfba能够有效抑制aβ
42
的聚集，ctfba的抑制效果既强于同类的小分子类抑制剂egcg，又优于异类的多肽类抑制剂lk7和蛋白类抑制剂bsa
‑
b，由此可见ctfba是一种非常有潜力的小分子ad药物。
[0052]
实施例7：ctfba与同类和异类aβ聚集抑制剂对血脑屏障的渗透性的比较。
[0053]
通过平行人工膜渗透法(pampa
‑
bbb)测定抑制剂ctfba与同类和异类aβ聚集抑制剂的血脑屏障渗透性。将小分子ctfba、同类的小分子抑制剂egcg、多肽类抑制剂lvffark(lk7)和蛋白类抑制剂碱化的牛血清白蛋白(bsa
‑
b)分别溶解于pbs/etoh(v/v,7/3)缓冲液中，终浓度为25μm。向下层96孔接收板中加入300μl pbs/etoh缓冲液，中间滤膜中加入4μl猪脑脂质，其中，猪脑脂质以20mg/ml溶于十二烷中，上层96孔供体板中加入200μl样品。将供体96孔板置于受体96孔板上，形成“三明治”结构，于25℃静置10h。利用酶标仪(infinite m200 pro,tecan,salzburg,austria)测定样品在受体板中的吸光度。利用以下公式计算ctfba、egcg、lk7和bsa
‑
b的渗透率：
[0054][0055]
为了验证检测结果，引入了12种已知血脑屏障渗透性的商品化药物进行线性相关分析，得到能够穿透血脑屏障的标准渗透率极限。实验测量值与文献中的理论值进行对比，通过线性拟合得到方程：p(exp)＝1.04p(lit)
‑
0.03,(r2＝0.96)。根据文献中给出的血脑屏障渗透极限(p(lit)＝4.0
×
10
‑6cm/s)，通过计算得到在本实验条件下，若渗透率高于4.1
×
10
‑6cm/s的化合物能够透过血脑屏障，渗透率低于2.1
×
10
‑6cm/s的化合物不能透过血脑屏障。
[0056]
如图7所示，ctfba的p值为11.96
×
10
‑6cm/s，既强于不具有血脑屏障穿透能力的多肽类抑制剂lk7和蛋白类抑制剂bsa
‑
b，又优于同样具有血脑屏障穿透能力的小分子类抑制剂egcg，由此表明ctfba具有良好的血脑屏障渗透性，在ad治疗中具有广阔的应用前景。
[0057]
本发明提出了在3,4,5
‑
三羟基苯甲酸表面偶联谷氨酰胺得到小分子抑制剂，提出了4
‑
氨基甲酰基
‑2‑
[(3,4,5
‑
三羟基苯基)甲酰氨基]丁酸化合物在制备抑制淀粉样β蛋白聚集的药物等方面的用途，并将其应用于aβ
42
的聚集、清除、毒性抑制和血脑屏障穿透实验。通过现场较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替代和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。