一种含寡肽和井冈霉素的抑制松材线虫的组合物的制作方法

1.本发明涉及生物病虫害防治领域，具体是一种含寡肽和井冈霉素的抑制松材线虫的组合物。


背景技术：

2.世界上的松树种类有八十余种，主要分为马尾松、油松、白皮松、黄山松、黑松、云南松、金钱松、樟子松、雪松等。上述种类多数是我国荒山造林的主要树种。但是，1982年，在我国境内发现了松材线虫病自境外传入，此后病情扩散蔓延迅速，目前全国已有18个省588个县级行政区发现该病，发生面积达974万亩。松材线虫病已然成为了头号森林病虫害，危害十分严重，因松材线虫病损失的松树累计达数十亿株，对我国的松林资源、自然景观和生态环境造成严重破坏，已经造成的直接经济损失和生态服务价值损失上千亿元。如果不能有效遏制松材线虫病，让其继续蔓延，一些风景名胜区例如我国著名景区黄山的主要景观黄山松等如果遭遇松材线虫入境，那么黄山景区将有可能不复存在，届时经济和生态损失将是毁灭性的无法估量;松材线虫病，又称松树萎蔫病，是由松材线虫(bursaphelenchus xylophilus)引起的森林病害，在自然条件下松材线虫病可危害松属植物45种。松树一旦感染该病，最快的40天左右即可死亡，如不进行人工干预，3－5年便可摧毁成片松林。如果松材线虫病疫情得不到有效控制，那么不但以松树为主的景观比如黄山松将不复存在，同时也将会对我国生态环境造成严重的破坏。然而目前防治药物却相当有限。例如，在防治方面，目前存在的主要问题有：（1）树干注入阿维菌素及埃玛菌素，药效持续时间短，仅为两年，注入时期也有限；（2）其它在开发的新药如日本的绿色卫士因价格高而无法广泛应用；（3）大面积的林木需要用喷洒等比树干注射更为便捷的方法，但是现有的这些药剂因为安全性和成本的多种原因，难以做到。近年来，国家相关部门对全国松材线虫病的防治越来越重视，要求坚决遏制松材线虫病快速扩散蔓延势头，切实维护生态安全、生物安全，因此，迫切需要补充筛选更多的适合绿色防治的药剂，以备更为大规模地进行防控。


技术实现要素：

3.针对现有技术存在的问题，本发明在原有发明“一种炭角菌科真菌及其应用”（专利号2017107959840）和“一种炭角菌科真菌sj18及其在松材线虫防治上的应用”（专利号2021100363359）的基础上，通过分离纯化sj18粗提物的主要成分，并进行成分分析，开发出一种杀灭松材线虫的组合物。
4.所述的一种炭角菌科真菌（xylaria radix）sj18，其保藏号为cgmcc no.12780，保藏证明已经在申请发明专利“一种炭角菌科真菌及其应用”（专利号2017107959840）时提交。
5.本发明所述的寡肽通过两种途径获得，一是真菌sj18粗提物经大孔树脂吸附、活性炭纯化、再过g
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15和g
‑
10葡聚糖凝胶纯化获得,其主要成分含量按峰面积为50%左右，经
液质分析，测定其为包含7个氨基酸的寡肽，序列为eqcscpq；二是根据该寡肽的氨基酸序列，经人工合成后纯度为98%。
6.所述的井岗霉素是包含井岗霉素的常用杀真菌剂，如井岗霉素或井岗霉素和戊唑醇合剂。
7.所述的组合物中寡肽使用浓度为250ppm、井岗霉素浓度为250ppm时，可以24h内杀灭50%以上松材线虫，并抑制松材线虫虫卵的孵化。
8.所述的组合物中寡肽浓度250ppm、井岗霉素浓度250ppm、戊唑醇浓度250ppm时，可以24h内杀死90%以上松材线虫。
9.所述的寡肽单独用于杀灭线虫时需2500ppm以上，实用性较低；单独的井岗霉素无杀线虫作用；两者混合后具有较好的杀灭线虫效果。
10.所述的组合物杀灭松材线虫的机理主要是以调节线虫的伴生菌群来杀灭线虫。通过无菌线虫进行测试表明，该组合物没有直接杀灭线虫的作用。
11.本发明涉及的寡肽具有安全高效的特点，井岗霉素是广泛使用的低毒农用抗生素，因此，本发明的组合物的使用具有较高的安全性，且大大拓宽了井岗霉素这类农用抗生素的使用范围。
附图说明
12.图1：液相色谱图；图2：t
r
=3.88min处ms 正离子流图谱图（一级质谱图）；图3：t
r
=3.88min处ms2图谱@794 .（二级质谱图）；图4：肽谱的分析图；图5：寡肽的合成图；图6：各合成寡肽的24h的杀虫效果测试图；图中：ck
‑
eb1：以甲维盐（eb）为阳性对照；ck
‑
h2o：只加水的阴性对照；p1
‑
6为各种测试的寡肽，其氨基酸序列分别为：p1：qcscq；p2：qcscpq；p3：qecscpq；p4：eqcscpq；p5：eqcscqp；p6：eecscpe；图7：sj18a寡肽与井岗霉素和戊唑醇的组合杀松材线虫效果图；图中：ck
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eb1表示甲维盐阳性对照，sj18a
‑
1表示2500ppm的sj18a浓度，sj18a
‑
2表示250ppm的sj18a浓度，val表示井岗霉素250ppm,teb表示戊唑醇250ppm；图8：sj18a与抗生素联合使用的实验结果图图中：ck
‑
eb1表示甲维盐阳性对照，ck
‑
h2o表示加水的阴性对照，sj18a表示0.25%的sj18a浓度，ant表示添加了1%硫酸链霉素和硫酸庆大霉素；图9：提取物sj18a处理松材线虫的伴生菌群分析；图中：ck是水处理，提取物指1%sj18a处理；图10：提取物sj18a和抗生素联合处理松材线虫的伴生菌群分析图；图中：ck是水处理，抗生素指1%硫酸链霉素和硫酸庆大霉素处理，提取物指1%sj18a处理；图11：抗生素处理松材线虫的伴生菌群分析图；
图中：ck是水处理，抗生素指1%硫酸链霉素和硫酸庆大霉素处理；图12：提取物sj18a和沙雷氏菌（ser）对无菌线虫的杀灭效果图；图中：ck
‑
eb1表示甲维盐阳性对照，ser表示0.01od浓度的沙雷氏菌，sj18a表示250ppm的sj18a，sj18a ser表示两者合用，ck
‑
h2o表示加水的阴性对照；图13：提取物sj18a和井岗霉素（val）和戊唑醇（teb）合用对松材线虫繁殖的影响图；图中：ck为水处理的对照，sj18a val表示250ppm的sj18a和100ppm的val，sj18a val teb为250ppm的sj18a、50ppm的val和50ppm的teb。
具体实施方式
13.下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步的详细说明。以下实施例对本发明并不作限定作用。
14.实施例一：sj18提取物中寡肽的分离和鉴定真菌sj18的发酵产物经过滤后，收集菌丝，70℃水浴水提。水提物经大孔树脂吸附，活性炭纯化，再过g
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15和g
‑
10葡聚糖凝胶纯化，利用紫外色谱检测器在214nm处收集各个峰，并分别进行功能鉴定，确定主要成分所在的峰，进行大量收集。功能检测时的方法见已授权专利“一种高通量筛选松材线虫抑制剂的方法”（专利权号2020112915539）。
15.收集到的峰进一步进行糖柱的检测和收集，检测和收集的位置为糖柱的主峰，其保留时间在3.88min（图1.液相色谱图），纯化后组分被记为sj18a。sj18a经双缩脲反应推测有多个肽键，经茚三酮检测包含氨基。经一级质谱（图2）、二级质谱（图3）、及肽谱（图4）分析，推测为包含eqcscpq这7个氨基酸的寡肽。
16.1.分析仪器型号：watersuplc
‑
synaptg2联用质谱条件：esi离子源，正离子灵敏度模式检测。毛细管电压3.0kv；样品锥孔电压：30v；样品萃取电压：5.0v；离子源温度：120℃；脱溶剂气体温度：350℃。喷雾气：高纯氮气(n2)，碰撞气体：高纯氩气(ar)，反吹气体流速80l/h，脱溶剂气体流速800l/h。质谱扫描范围：50
‑
1200da；扫描次数为：0.3s。校正曲线标准物质：甲酸钠。实时校正标准物质m/z=557.2771 (亮氨酸脑啡肽)。
17.色谱柱：糖柱(4.6
×
250mm，5
µ
m)液相条件：乙腈/水系统梯度洗脱。进样量：10
µ
l。流速1ml/min。
18.2、主要的色谱和质谱图液相色谱图、一级质谱图、二级质谱图、及肽谱的分析图分别见图1、图2、图3、图4。
19.根据质谱数据获得的[m h] 数据：masscalc.massmdappmdbei
‑
fitnormconf(%)formula794.2852794.28133.94.910.5114.58.7950.02c
29
h
48
n9o
13
s
2 实施例二：多肽合成及毒性测试寡肽的合成，以eqcscpq为例，见图5对合成的寡肽进行毒性测试，效果如图6所示。结果表明寡肽eqcscpq对杀线虫有一定的效果，考虑到合成肽的空间结构与天然肽可能存在一定的差异，其活性不完全一致也是正常的。
[0020]
实施例三：sj18a的杀线虫效果与配伍作用取0.1g井岗霉素可溶性粉剂（20%有效含量）溶于20ml水中，取40μl戊唑醇悬浮剂加入20ml水溶解，然后按照“一种高通量筛选松材线虫抑制剂的方法”（专利权号2020112915539）中的方法，分别取井岗霉素水溶液和戊唑醇悬浮液25μl各加入50μl线虫液中。测试结果如图7所示，虽然单独使用sj18a能杀灭线虫（图7中sj18a
‑
1），但使用浓度较高（0.25%），而在较低浓度下很难杀死线虫（图7中sj18a
‑
2）；但是井岗霉素和戊唑醇的加入大大提高了其敏感性，特别是井岗霉素加入使得低浓度sj18a的药效提高了3倍以上，两者合用，效果较好。上述测试，不仅采用了培养皿中培养的线虫，也采用了从野外不同地方（千岛湖、临安、浦江等浙江省不同疫区）采集的线虫，同样有效，说明其混合制剂的效果具有普遍性。
[0021]
实施例四：通过菌群多样性分析揭示sj18a的杀线虫机理为了证实sj18a杀线虫机理与线虫的伴生菌有关，特地设计了sj18a与抗生素联合使用的实验，按照“一种高通量筛选松材线虫抑制剂的方法”（专利权号2020112915539），利用硫酸庆大霉素和硫酸链霉素杀死线虫伴生菌，实验结果表明（图8），抗生素可以抵消sj18a的作用，这意味着sj18a是通过伴生菌发挥作用的。为了证实这一推测，进一步对线虫样品进行dna提取和16s rrna深度测序，测序结果表明，与ck相比，sj18a处理杀线虫时，线虫死亡，而沙雷氏菌（serratia）和假单胞菌（pseudomanos）增长，沙雷氏菌增长比例较多，其次是假单胞菌（图9）；而抗生素与sj18a共同处理时，这两个菌生长没有明显变化（图10），这一情况与抗生素单独处理时的情况一样（图11），说明抗生素处理下sj18a无法起到促进沙雷氏菌和假单胞菌的作用；由此，推测sj18a很可能是通过沙雷氏菌和假单胞菌发挥作用的。
[0022]
实施例五：无菌线虫的杀灭试验为了进一步证实sj18a杀线虫的机理与线虫的沙雷氏菌有关，按照“一种高通量筛选松材线虫抑制剂的方法”（专利权号2020112915539），在分离到线虫伴生沙雷氏菌的基础上，利用无菌线虫进行药物毒性测试；无菌线虫的获得方法：线虫平板加入适量无菌水静置10分钟，取出虫液2ml放入玻璃培养皿，显微镜下观察线虫死亡状态。将培养皿放入25℃黑暗放置10分钟，等待雌性线虫产卵。产卵后，拿出培养皿加入15%浓度双氧水2ml，使得工作液中双氧水浓度为7.5%，处理松材线虫卵60min。小心地除去水和虫子，不要干扰卵，立即向培养皿中添加2ml无菌水，以清洗并防止卵变干。重复清洗3次去除所有线虫。培养皿中加入1ml无菌水，置于25℃黑暗中孵化24小时，显微镜下观察有少量线虫孵出，4000g/5分钟离心弃上清留300μl，取200μl接种于灰葡萄孢平板，取100μl涂平板：线虫液涂板pda培养基25℃培养3天，若平板中无杂菌长出，则无菌线虫培养成功，该线虫用于杀虫试验；实验结果表明（图12），sj18a对无菌线虫不起作用，而单独的沙雷氏菌对线虫也没有明显杀灭作用，但是沙雷氏菌和sj18a共同作用下，就产生了明显的杀线虫功能，由此表明sj18a可以通过沙雷氏菌杀灭线虫。
[0023]
实施例六：对松材线虫生殖的影响将sj18a val处理过的活线虫随机选取100条，加入到灰葡萄孢平板中，25℃培养5天后观察其在灰葡萄孢上的繁殖情况，其繁殖的速度用线虫在灰葡萄孢平板表面产生的虫
斑直径表示，结果见图13。实验结果表明，与对照相比，sj18a val可以缩减虫斑直径47.1%，而sj18a val teb可以缩减虫斑直径58.1%。