一种检测西罗莫司原料药中残留溶剂的方法与流程

1.本发明涉及一种检测西罗莫司原料药中残留溶剂的方法，属于药物分析检测技术领域。


背景技术：

2.西罗莫司(sirolimus)，分子式：c
51
h
79
no
13
，相对分子质量：914.2，是从吸水性链霉菌fc904(streptomyces hygroscopicus fc904)发酵液中提取的一种大环内酯类化合物，具亲脂性，微溶于水，几乎不溶于乙醚，但溶于乙醇，临床上常作为强效免疫抑制剂用于器官移植的抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗。
3.西罗莫司主要通过微生物发酵工艺或半合成方法生产，产品杂质较复杂，生产工艺中常用有机溶剂对西罗莫司粗品进行结晶提纯，如果工艺参数控制不严格，易造成成品中残留有机溶剂高，当药品中残留溶剂水平高于安全值时，会对人体或环境产生危害，
4.西罗莫司原料药生产工艺中用到的有机溶剂包括乙醇、乙醚、异丙醚、乙酸乙酯，其中乙醇、乙醚和乙酸乙酯为三类溶剂，异丙醚为四类溶剂，按照人用药品技术要求国际协调理事会ich指导原则及中国药典对药品中残留溶剂的控制要求，有必要对西罗莫司中可能残留的上述4种溶剂进行控制，但现行的质量标准中并没有残留溶剂检查项，同时，由于乙醇和乙醚极性相近，参照目前中国药典通则中收录的方法无法实现乙醇和乙醚有效分离，因此不能在同一色谱系统中完成西罗莫司原料药中的乙醇、乙醚、异丙醚和乙酸乙酯的检测，无法快捷、全面控制产品质量。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种检测西罗莫司原料药中残留溶剂的方法，利用气相色谱法同时检测西罗莫司原料药中的乙醇、乙醚、异丙醚和乙酸乙酯，简便灵敏，专属性强，检测结果准确可靠。
6.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
7.一种检测西罗莫司原料药中残留溶剂的方法，采用气相色谱外标法同时检测西罗莫司原料药中的乙醇、乙醚、异丙醚和乙酸乙酯，检测步骤包括：
8.(1)配制乙醇、乙醚、异丙醚和乙酸乙酯的质量浓度均为5mg/ml的混合对照溶液；
9.(2)配制供试品溶液：精密称取供试品西罗莫司原料药，并将其溶于二甲基亚砜配制成质量浓度为0.1g/ml的供试品溶液；
10.(3)测定：以顶空进样方式将空白溶液、混合对照溶液和供试品溶液分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算西罗莫司原料药中的乙醇、乙醚、异丙醚和乙酸乙酯的含量。
11.本发明技术方案的进一步改进在于：所述气相色谱法的色谱条件为：色谱柱为agilent db
‑
624；柱温：起始柱温为30℃，保持6min，以每分钟5℃的速率升温至100℃，维持5分钟，再以每分钟20℃的速率升温至200℃，维持5分钟；进样口温度：200～240℃；检测器
温度：230～270℃；载气：n2，流速3.0～5.0ml/min；分流比：10:1；进样方式：顶空进样法，平衡温度70℃，平衡时间30min；
12.本发明技术方案的进一步改进在于：所述色谱柱的规格为60m
×
0.53mm，3.0μm。
13.本发明技术方案的进一步改进在于：所述进样口温度为220℃。
14.本发明技术方案的进一步改进在于：所述检测器温度为250℃。
15.本发明技术方案的进一步改进在于：所述载气的流速为4.0ml/min。
16.本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤(1)中混合对照溶液的配制步骤为：将乙醇、乙醚、乙酸乙酯和异丙醚中分别加入二甲基亚砜，均配制成质量浓度为50mg/ml的单一对照品贮备液；再精密量取各贮备液混合后用二甲基亚砜稀释配制成乙醇、乙醚、乙酸乙酯和异丙醚的质量浓度均为5mg/ml的混合对照溶液。
17.由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术效果有：
18.本发明利用气相色谱
‑
顶空进样同时检测西罗莫司原料药中残留的乙醇、乙醚、异丙醚和乙酸乙酯，简便灵敏，专属性强，检测结果准确可靠，符合残留溶剂检测要求，适用于西罗莫司原料药中残留溶剂的常规检测，同时为质量标准中残留溶剂检查项的制订提供参考和依据。
19.本发明的检测方法检测时间短，所得峰形对称，峰宽符合要求，各残留溶剂分离度好，检测结果准确可靠，符合残留溶剂检测要求。
20.本发明能够对西罗莫司中可能存在的有机溶剂残留进行检测，进而全面控制产品质量使其符合用药安全要求，有效提高原料药质量，降低临床用药风险。
附图说明
21.图1是本发明空白溶液气相色谱图；
22.图2是本发明混合对照溶液气相色谱图；
23.图3是本发明供试品溶液气相色谱图；
24.其中，1、乙醇，2、乙醚，3、乙酸乙酯，4、异丙醚，0、二甲基亚砜。
具体实施方式
25.下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但并不因此将本发明限制在所述实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件。
26.实施例
27.1、仪器与试药
28.仪器：安捷伦7890b气相色谱仪；7697a顶空进样器；氢火焰离子化检测器(fid)；agilent open lbacds chem station edition工作站；纯水氢气发生器；sgk
‑
2lb低噪空气泵。
29.试药：乙醇、乙醚、乙酸乙酯、异丙醚均为分析纯；二甲基亚砜(dmso)为色谱纯。
30.供试品：西罗莫司原料药，批号：s190401、s200901、s200902。
31.2、色谱条件
32.色谱柱：agilent db
‑
624，60m
×
0.53mm，3.0μm；
33.柱温：起始柱温为30℃，保持6min，以每分钟5℃的速率升温至100℃，维持5分钟，
再以每分钟20℃的速率升温至200℃，维持5分钟；
34.进样口温度：220℃；
35.检测器温度：250℃；
36.载气：n2，流速4.0ml/min；
37.分流比：10:1；
38.进样方式：顶空进样法，平衡温度70℃，平衡时间30min。
39.3、溶液配制
40.空白溶液：dmso，精密量取5ml置顶空进样瓶中，密封；
41.乙醇对照贮备液：精密称取乙醇2.5108g，置50ml量瓶中，用dmso稀释至刻度，摇匀；
42.乙醚对照贮备液：精密称取乙醚2.5089g，置50ml量瓶中，用dmso稀释至刻度，摇匀；
43.异丙醚对照贮备液：精密称取异丙醚2.5078g，置50ml量瓶中，用dmso稀释至刻度，摇匀；
44.乙酸乙酯对照贮备液：精密称取乙酸乙酯2.5119g，置50ml量瓶中，用dmso稀释至刻度，摇匀；
45.混合对照贮备液：精密量取上述贮备液5ml置50ml量瓶中，用dmso稀释至刻度，摇匀，即得含乙醇、乙醚、乙酸乙酯和异丙醚分别为5mg/ml的混合对照贮备；
46.混合对照溶液：精密量取混合对照贮备液5ml，置50ml量瓶中，加dmso稀释至刻度，摇匀，即得对照溶液，精密量取5ml置顶空进样瓶中，密封；
47.供试品溶液：精密称取供试品(西罗莫司原料药)0.5g，置顶空瓶中，精密加入dmso 5ml溶解，密封，即得。
48.4、样品测定
49.取空白溶液、混合对照溶液和供试品溶液分别注入气相色谱仪，记录色谱图。结果见附图1
‑
3，在该色谱条件下，出峰顺序依次为：乙醇、乙醚、乙酸乙酯和异丙醚，各成分峰均能达到基线分离，分离度大于1.5；溶剂对样品测定无干扰，其他杂质峰和主峰分离良好。
50.5、结果计算
51.按外标法，以峰面积计算，公式为：
[0052][0053]
式中：a
x
—供试品溶液中相应溶剂峰的峰面积；a
r
—混合对照品溶液中相应溶剂峰的峰面积；c
r
—混合对照品溶液相应溶剂的浓度(mg/ml)；c
x
—供试品溶液的浓度(mg/ml)。
[0054]
西罗莫司原料药中含乙醇不得大于0.5％、乙醚不得大于0.5％、异丙醚不得大于0.5％、乙酸乙酯不得大于0.5％。
[0055]
三批供试品样品的检测结果见下表：
[0056]
样品测定结果(％)
[0057]
批号s190401s200901s200902标准规定合格率乙醇0.050.080.09≤0.5100.0乙醚0.020.030.02≤0.5100.0
异丙醚0.010.020.02//乙酸乙酯0.100.210.35≤0.5100.0
[0058]
6、方法学验证
[0059]
(1)检出限及定量限
[0060]
取各对照贮备液，逐级稀释，注入气相色谱仪，记录色谱图，直至信噪比s/n约10，即为对应的对照溶液定量限，见下表1。
[0061]
取各对照贮备液，逐级稀释，注入气相色谱仪，记录色谱图，直至信噪比s/n约3，即为对应的对照溶液检出限，见下表1。
[0062]
表1 4种残留溶剂定量限及检测限
[0063]
项目乙醇乙醚异丙醚乙酸乙酯定量限15.065μg/ml1.505μg/ml1.505μg/ml5.027μg/ml检出限5.022μg/ml0.502μg/ml0.502μg/ml1.624μg/ml
[0064]
(2)线性及范围
[0065]
乙醇线性溶液的配制：精密吸取乙醇对照贮备液0.1，1，5，10，20，50ml，分别置于100ml量瓶中，加dmso稀释至刻度，摇匀，制成系列乙醇对照溶液。
[0066]
按上述色谱条件进样测定，记录峰面积。
[0067]
乙醚线性溶液的配制：精密吸取乙醚对照贮备液0.01，1，5，10，20，50ml，分别置于100ml量瓶中，加dmso稀释至刻度，摇匀，制成系列乙醚对照溶液。
[0068]
按上述色谱条件进样测定，记录峰面积。
[0069]
异丙醚线性溶液的配制：精密吸取异丙醚对照贮备液0.01ml，1ml，5ml，10ml，20ml，50ml，分别置于100ml量瓶中，加dmso稀释至刻度，摇匀，制成系列异丙醚对照溶液。按上述色谱条件进样测定，记录峰面积。
[0070]
乙酸乙酯线性溶液的配制：精密吸取乙酸乙酯对照贮备液0.1，1，5，10，20，50ml，分别置于100ml量瓶中，加dmso稀释至刻度，摇匀，制成系列乙酸乙酯对照溶液。按上述色谱条件进样测定，记录峰面积。
[0071]
以峰面积为纵坐标，以溶液浓度为横坐标，进行线性回归，测定结果见表2。
[0072]
表2线性试验测定结果
[0073][0074][0075]
(3)准确度试验
[0076]
标准加入溶液：精密量取混合对照贮备液2.5ml、5.0ml、7.5ml置于50ml量瓶中，加
dmso稀释至刻度，摇匀，即得标准加入液(1)、标准加入液(2)、标准加入液(3)；
[0077]
供试品溶液：精密称取本品0.5g，共9份，分3组，置顶空瓶中，第1组分别加入上述标准加入液(1)5.0ml，溶解、摇匀后密封；第2组分别加入上述标准加入液(2)5.0ml，溶解、摇匀后密封；第3组分别加入上述标准加入液(3)5.0ml，溶解、摇匀后密封。分别取上述溶液注入气相色谱仪，记录色谱图。
[0078]
测得量与加入量的比值即为回收率，结果见下表3：4种残留溶剂的平均回收率介于99.84％～102.88％(n＝9)，均符合药品质量标准分析方法验证指导原则中规定的回收率限度要求。
[0079]
表3回收率试验测定结果
[0080][0081][0082]
(4)精密度试验
[0083]
进样精密度试验：取混合对照溶液注入气相色谱仪，记录色谱图。重复进样6次，计算rsd，考察本发明的仪器精密度。测定结果见表4，rsd均在5％内，进样精密度良好。
[0084]
表4进样精密度试验测定结果
[0085]
组分乙醇乙醚异丙醚乙酸乙酯保留时间rsd0.09％0.19％0.05％0.04％峰面积rsd0.15％0.03％0.08％0.25％
[0086]
重复性试验：配制混合对照品溶液6份和供试品溶液6份，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。考察本法的重复性。测定结果见表5，rsd均在5％内，方法重复性良好。
[0087]
表5重复性试验测定结果
[0088]
组分乙醇乙醚异丙醚乙酸乙酯含量rsd(％)0.00.00.00.0
[0089]
中间精密度试验：不同实验人员按对照品溶液和供试品溶液操作，配制混合对照品溶液6份和供试品溶液6份。分别注入气相色谱仪，记录色谱图。测定结果见表6，rsd均在5％内，方法重现性良好。
[0090]
表6中间精密度试验测定结果
[0091]
组分乙醇乙醚异丙醚乙酸乙酯含量rsd(％)0.00.00.00.0
[0092]
(5)稳定性试验
[0093]
配制混合对照品溶液，于室温放置0、1、2、3、4、5、6小时，取不同放置时间的上述溶液注入气相色谱仪，记录色谱图。测定结果见表7，由试验结果可知：混合对照品溶液室温放置6小时内稳定。
[0094]
表7中间精密度试验测定结果
[0095]
组分乙醇乙醚异丙醚乙酸乙酯rsd(％)0.180.410.180.18
[0096]
(6)方法耐受性
[0097]
1)载气流速
[0098]
取混合对照溶液注入气相色谱仪，考察载气流速3ml/min、4ml/min、5ml/min条件下4种有机溶剂的色谱保留行为，以各组分分离度和理论塔板数为评价指标，测定结果见表8：在考察的载气流速下乙醇、乙醚、异丙醚和乙酸乙酯4种溶剂均可达到基线分离。
[0099]
表8不同载气流速测定结果
[0100][0101]
2)进样口温度
[0102]
取混合对照溶液注入气相色谱仪，考察进样口温度200℃、220℃、240℃条件下4种有机溶剂的色谱保留行为，以各组分分离度和理论塔板数为评价指标，测定结果见表9：在考察的进样口温度下乙醇、乙醚、异丙醚和乙酸乙酯4种溶剂均可达到基线分离。
[0103]
表9不同进样口温度测定结果
[0104][0105][0106]
3)检测器温度
[0107]
取混合对照溶液注入气相色谱仪，考察检测器温度230℃、250℃、270℃条件下五种有机溶剂的色谱保留行为，以各组分分离度和理论塔板数为评价指标，测定结果见表10：在考察的检测器温度下乙醇、乙醚、异丙醚和乙酸乙酯4种溶剂均可达到基线分离。
[0108]
表10不同检测器温度测定结果
[0109][0110]
综上所述，本专利建立了气相色谱
‑
顶空进样同时测定西罗莫司原料药中4种有机溶剂含量的方法，方法简单、准确、灵敏度高，符合残留溶剂检测要求，适用于西罗莫司原料药中残留溶剂的日常检测，同时为本品质量标准中残留溶剂检查项的修订提供参考和依据，有效提高原料药质量，降低临床用药风险。