连翘叶提取物及其用于提高肠道AKK菌丰度的用途的制作方法

连翘叶提取物及其用于提高肠道akk菌丰度的用途
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，具体提供一种连翘叶提取物及其用于提高肠道 akk菌丰度的用途。


背景技术：

2.随着基因组测序技术的发展，人们逐渐认识到了肠道菌群的重要性。肠道菌群在宿主免疫调节，炎症反应和能量代谢中都起着至关重要的作用。嗜黏蛋白艾克曼氏菌(akkermansiamuciniphila)是一种椭圆形革兰氏阴性的存在于人体肠道的原籍厌氧球菌，于2004年由荷兰环境微生物学家antoonakkermans 等研究者分离纯化得到，并将其定名为akkermansiamuciniphila(简称akk菌)。该菌分布在人类的消化道中，约占人体主要微生物群落总数的3
‑
5％。当肠道中 akk菌的活性含量变低时，影响到黏膜层厚度，从而导致肠道的屏障保护功能下降，引发肠道内的有毒物质、病原体更容易侵入人体进行危害，加大了患病的机率，通过研究也总结出akk菌的丰度会在伴有炎症性肠病、肥胖症等代谢性疾病的患者体内有所下调。肠道微生物群组正在成为一种关键调节剂参与多种系统的代谢，免疫和神经内分泌途径。akk菌的丰度被发现在疾病的发展中起着关键的作用，akk菌对宿主的健康影响引起了人们越来越多的关注，有实力成为潜在靶点以改善肥胖、抵抗糖尿病、抑制肝脏疾病和心脑血管系统紊乱引发的疾病等。
3.连翘(forsythiasuspensa(thumb.)vahl)属于木犀科(oleaceae)连翘属 (forsythia)的开花落叶灌木，广泛分布在我国山东，河南，河北，山西等省份。现代研究发现，连翘中含有药物成分，但是目前关于连翘提取物在改善肠胃功能方面鲜有报道。


技术实现要素：

4.针对以上问题，本发明公开了一种连翘叶提取物的制备方法。
5.具体地，本发明实施例提供的连翘叶提取物的制备方法包括：：
6.s1:取连翘叶片，粉碎，加入溶剂90℃以上处理10～40min，过滤后加萃取剂，萃取6小时以上，得到第一产物；
7.s2:将所述第一产物过滤，取上清液，吸附，洗脱，并将洗脱液进行减压浓缩，获得第二产物；
8.s3:将所述第二产物溶解，层析，然后洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，获得连翘叶提取物。
9.进一步地，步骤s1中所述溶剂为水，所述萃取剂为醇类，优选为乙醇。
10.进一步地，步骤s2中所述吸附方式为大孔吸附树脂柱。
11.进一步地，步骤s2中所述洗脱过程为：先用水洗脱，再用30％
‑
60％乙醇洗脱，合并乙醇洗脱液。
12.进一步地，步骤s3中所述第二产物和水的体积比为1
‑
10:5
‑
50。
13.进一步地，步骤s3中所述层析优选为反相硅胶柱层析。具体为ods
‑
c
‑
18 反相硅胶
柱层析(watersprep150 lc，waters beh c18 vanguard pre
‑
column, 5μm,19
×
250mm，流速5ml/min)。
14.本发明实施例还提供通过上述方法制备的连翘叶提取物。
15.本发明实施例还提供上述制备方法制得的连翘叶提取物用于制备提升动物肠道内菌种akkermansia muciniphila或者菌属akkermansia的药物的用途。
16.进一步地，所述药物还包含辅料。
17.进一步地，所述akk菌丰度为肠道内的丰度。进一步地，所述动物是指哺乳动物。
18.本发明实施例提供的连翘叶提取物(afk
‑
6801)，经过动物实验证明，对肠道内akk菌具有明显的促进增殖作用，在用药剂量大于或者等于75mg/kg 时akk菌的含量有显著提升。
具体实施方式
19.为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
20.本发明实施例提供了一种连翘叶提取物的制备方法，包括：
21.s1:取连翘叶片，干燥粉碎，加入溶剂90℃以上处理10～40min，过滤后加萃取剂，萃取6小时以上，得到第一产物；
22.s2:将所述第一产物过滤，取上清液，吸附，洗脱，并将洗脱液进行减压浓缩，获得第二产物；
23.s3:将所述第二产物溶解，层析，然后洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，获得连翘叶提取物。
24.优选地，步骤s1中干燥粉碎包括风干或者冻干的处理，优选为自然风干。
25.优选地，步骤s1中所述溶剂为水，所述萃取剂为醇类，包括甲醇，乙醇和丙醇等，优选为乙醇，进一步优选为75％食用乙醇。
26.具体地，溶剂水的用量为5
‑
20倍粉碎后固体的体积，溶剂水处理后还包括过滤的步骤。
27.萃取剂萃取时间为5小时以上，常温或者4℃。
28.优选地，步骤s2中所述吸附方式为大孔吸附树脂柱，优选为hp
‑
20大孔吸附树脂。
29.优选地，步骤s2中所述洗脱过程为：先用水洗脱，再用30％
‑
60％乙醇洗脱，合并乙醇洗脱液。
30.进一步优选地，该步骤还包括减压浓缩的操作。
31.优选地，步骤s3中第二产物和水的体积比为1
‑
10:5
‑
50。
32.优选地，步骤s3中所述层析优选为反相硅胶柱层析。具体为ods
‑
c
‑
18反相硅胶柱层析(watersprep150 lc，waters beh c18 vanguard pre
‑
column,5μm, 19
×
250mm，流速5ml/min)。
33.本发明实施例还提供上述制备方法制得的连翘叶提取物用于制备提升动物体内akk菌丰度的药物的用途。
34.进一步地，所述药物为口服药物，可以为膏剂，液体，糖浆，片剂，胶囊或者其他合
适的剂型，进一步优选地，该药物还包含辅料。
35.进一步地，所述akk菌丰度为肠道内的丰度。进一步优选地，所述动物是指哺乳动物。
36.本发明实施例提供的连翘叶提取物(afk
‑
6801)，经过动物实验证明，对肠道内akk菌具有明显的促进增殖作用。
37.以下通过具体实施例对本发明进行进一步描述。
38.实施例1：连翘叶提取物的制备方法
39.连翘叶提取物制备方法包括以下步骤：
40.(1)取连翘(forsythia suspensa)叶片，自然风干，粉碎，加入10倍量体积的水煮30min，纱布过滤，加95％食用乙醇，调乙醇浓度为75％，置4℃冰箱过夜，得到第一产物；
41.(2)将第一产物过滤，取上清液，加入hp
‑
20大孔吸附树脂柱层析，上样量为柱体积的30％。静置4h，先用水洗脱3个柱体积，再用40％乙醇洗脱3 个柱体积，合并40％乙醇洗脱液，将洗脱液在旋转蒸发仪上进行减压浓缩得到浸膏，减压浓缩的压力为10kpa，温度为65℃。冷冻干燥，获得第二产物(粗提取物)；
42.(3)将第二产物按1：5体积加水溶解，采用ods
‑
c
‑
18反相硅胶柱层析 (watersprep150 lc，waters beh c18 vanguard pre
‑
column,5um,19
×
250mm，流速5ml/min)，上样量为1ml柱。依次采用20％，40％甲醇水洗脱，收集40％甲醇水洗脱液，减压浓缩，并冻干成粉末状，得最终提取物，(得率0.2％，纯度98.8％)；
43.(4)所得产物命名为afk
‑
6801，其核磁数据为：棕色固体粉末,甲醇可溶，在254nm处显荧光，i2显黄色斑点，5％h2so4‑
etoh加热显黄色至黑色。分子式为c
25
h
38
o
16
，esi
‑
ms:m/z 594.2[m
‑
h]
‑
。
[0044]
所述提取物经核磁共振谱可知所述afk
‑
6801化合物在254nm处显荧光， i2显黄色斑点，5％h2so4‑
etoh加热显黄色至黑色，esi
‑
ms:m/z 594.2[m
‑
h]
‑
。其中c和h的归属数据如表1所示：
[0045]
表1afk
‑
6801化合物的核磁共振氢谱和碳谱归属数据
[0046]
positionδ
h
(mult,j in hz)δ
c
1 131.726.69(d,j＝2.0)116.63 146.14 144.756.67(d,j＝8.0)117.666.55(dd,j＝8.0,2.0)121.5β2.78(m)36.6α4.04(m)72.4glc
‑1′
4.46(d,j＝8.0)103.2glc
‑2′
3.40(dd,j＝8.0,9.0)79.9glc
‑3′
3.55(m)71.6glc
‑4′
3.42(m)78.0glc
‑5′
3.22(m)78.0
glc
‑6′
3.88(dd,j＝12.0,2.2)68.9 3.70(dd,j＝12.0,4.8) rha
‑1″
5.02(d,j＝8.0)102.8rha
‑2″
3.68(m)72.4rha
‑3″
3.32(m)72.4rha
‑4″
3.55(m)73.7rha
‑5″
3.70(m)70.5rha
‑6″
1.12(s)18.6fur
‑1″′
5.52(d,j＝7.6)103.1fur
‑2″′
4.03(m)77.5fur
‑3″′ꢀ
81.6fur
‑4″′
3.71(d,j＝12.0,2.0)74.2 3.92(d,j＝12.0,2.0) fur
‑5″′
3.72(d,j＝12.0,2.4)64.5 2.73(d,j＝12.0,2.4) [0047]
实施例2：连翘叶提取物的制备方法
[0048]
该实施例中，与实施例1不同的地方在于，步骤(1)中的75％乙醇替换为甲醇，其余操作步骤相同，结果表明提取物成分与实施例1接近。
[0049]
实施例3：连翘叶提取物对动物肠道akk菌增殖的促进作用
[0050]
1.实验方法
[0051]
1.1小鼠与给药
[0052]
取6周龄的野生雄型c57bl/6j(wt)小鼠，36只，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司。将小鼠饲养在动物房间中，温度控制在20
‑
22℃，光照/黑暗周期为12h，适应性饲养7d。
[0053]
将实施例1制得的连翘叶提取物用水溶解后配置为10mg/ml的溶液。
[0054]
给c57bl/6小鼠饲喂spf级繁殖饲料，自由饮水直至实验结束。适应性饲养7d后，将c57bl/6小鼠随机分为四组(每组n＝9)，即(1)正常对照组(cw)，(2)高剂量给药组(d
‑
h 100mg/kg)，(3)中剂量给药组(d
‑
l， 75mg/kg)，(4)低剂量给药组(d
‑
l，50mg/kg)。(1)正常对照组按体重灌胃给予纯净水，给药组(2)
‑
(4)按剂量灌胃给药8周。
[0055]
1.2肠道菌16s rrna分析
[0056]
实验给药最后一天，收集各小鼠粪便，保存在2ml离心管，立刻送检。
[0057]
提取粪便样品总dna后，根据保守区设计得到引物，在引物末端加上测序接头，进行pcr扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用illumina hiseq 2500进行测序。高通量测序(如illumina hiseq等测序平台)得到的原始图像数据文件，经碱基识别(base calling)分析转化为原始测序序列(sequenced reads)，采用 qiime1.91标准化流程，运用open_reference算法，按照97％相似度进行otu 聚类，显著增加了菌种注释效率。最终与greengene数据库比对，生成包含样本名称及菌种注释与丰度信息的biom数据。
[0058]
1.3统计学分析
[0059]
实验数据用mean
±
sd表示，采用graphpad prism 7.0软件对数据进行 one
‑
wayanova分析，考察数据间差异，*p<0.05为有显著性差异，**p<0.01 为差异性极显著。
[0060]
1.4肠道菌群分析实验结果
[0061]
下列表格(表2)显示了肠道菌群分析结果。
[0062]
表2连翘叶提取物对肠道菌群门水平的影响
[0063][0064]
从上表可以看出，高剂量给药组(d
‑
h 100mg/kg)和中剂量给药组(d
‑
l，75 mg/kg)对于菌群门级别verrucomicrobia有实质的提升作用，尤其是高剂量组，相对于对照组提升比例为29.1％。
[0065]
进一步地，选择verrucomicrobia级别下面菌群纲进行检测分析，结果如表3所示。
[0066]
表3连翘叶提取物对肠道菌群纲水平的影响
[0067][0068]
从上表可以看出，高剂量给药组(d
‑
h 100mg/kg)和中剂量给药组(d
‑
l，75 mg/kg)对于菌群门级别verrucomicrobia下面的纲级别verrucomicrobieae有实质的提升作用，尤其是高剂量组，相对于对照组提升比例为29.1％。
[0069]
进一步的试验中，选择verrucomicrobiae下面的菌群目级别进行检测分析，结果如表4所示。
[0070]
表4连翘叶提取物对肠道菌群目水平的影响
[0071][0072]
从上表可以看出，高剂量给药组(d
‑
h 100mg/kg)和中剂量给药组(d
‑
l，75 mg/kg)对于菌群verrucomicrobieae下面的目级别菌群中verrucomicrobiales 有实质的提升作用，尤其是高剂量组，相对于对照组提升比例为29.1％。对于该目级别菌群包括的菌种继续进行分析，结果如表5所示。
[0073]
表5连翘叶提取物对肠道菌群科水平的影响
[0074][0075]
从上表可以看出，高剂量给药组(d
‑
h 100mg/kg)和中剂量给药组(d
‑
l，75 mg/kg)对于菌群科级别菌群中verrucomicrobiaceae有实质的提升作用，尤其是高剂量组，相对于对照组提升比例为29.1％。
[0076]
进一步对该科级菌群中各属级菌种进行检测分析。
[0077]
表6连翘叶提取物对肠道菌群属水平的影响
[0078][0079]
从上表可以看出，高剂量给药组(d
‑
h 100mg/kg)和中剂量给药组(d
‑
l，75 mg/kg)对于菌属akkermansia的数量有实质的提升作用，尤其是高剂量组，相对于对照组提升比例
为29.1％。
[0080]
进一步实验中，对于菌属akkermansia包括的菌种进行进一步分析测试。
[0081]
表7连翘叶提取物对肠道菌种水平的影响
[0082]
[0083]
从上表可以看出，高剂量给药组(d
‑
h 100mg/kg)和中剂量给药组(d
‑
l，75 mg/kg)对于菌种akkermansia muciniphila的数量有实质的提升作用，尤其是高剂量组，相对于对照组提升比例为29.1％。
[0084]
上述实验结果表明，akk菌在小鼠的肠道内相对含量较低，从肠道菌群的门、纲、目、科、属、种的水平分析，正常未给药组肠道内akk菌的含量为0，通过高、中、低剂量给药后，低剂量(50mg/kg)组的肠道akk菌的含量仍然为0，但是高(100mg/kg)和中剂量(75mg/kg)的akk菌含量分别为29.1％和0.9％，因此，证明了连翘叶提取物能够有效的提高肠道akk菌的丰度，并且随之用量的提高，akk菌的丰度随之增加，并且在用量为100mg/kg时作用效果极为明显。
[0085]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。