一种抗肿瘤纳米药物及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及肿瘤化疗技术领域，尤其涉及一种抗肿瘤纳米药物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.化疗药物是一种治疗肿瘤的药物。化疗药物可杀灭肿瘤细胞。这些药物能作用在肿瘤细胞生长繁殖的不同环节上，抑制或杀死肿瘤细胞。化疗药物治疗是目前治疗肿瘤的主要手段之一。肿瘤的化疗目前存在的缺陷有生物利用度低，非特异性靶向，并且治疗过程中容易出现多种耐药，最终导致肿瘤病人复发，走向生命终点。因此，开发新型的抗肿瘤药物具有重大的临床意义。
3.将不同抗肿瘤机制的药物因子组合包装成单一的纳米颗粒，可同时发挥两种药物的抗肿瘤作用，增强药效，减少药物抗药性，达到强效抗肿瘤作用。最近，美国麻省理工学院研究人员设计出一种新型纳米粒子，能同时将两种药物运送到大脑肿瘤部位，可增强对多形性胶质母细胞瘤的治疗效果，目前已在动物实验中取得成功。该项研究发布在英国《自然
·
通讯》(nature communications)杂志上，研究者发现，给脂质体纳米粒子加上转铁蛋白涂层，能使粒子顺利通过血脑屏障，并准确抵达肿瘤部位同时避开正常细胞。据了解，脂质体是一种中空的人工球状微粒，外壳是脂质双分子层。研究人员在脂质体内部装上化疗药物替莫唑胺，负责破坏肿瘤细胞的dna(脱氧核糖核酸)；用外壳装载一种名为“jq
‑
1”的实验药物，负责阻止肿瘤细胞修复dna损伤。两者联合发挥作用，能减少药物抵抗。
4.但现有技术是通过脂质体或者纳米颗粒载体装载两种药物，这种方法造成药物装载率不高，而且载体也会带来生物安全性和免疫原性问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种抗肿瘤纳米药物及其制备方法与应用。
6.本发明将药物通过在水溶液中自组装，形成纳米颗粒，无需载体，具有很强的抗肿瘤活性。
7.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种抗肿瘤纳米药物，所述抗肿瘤纳米药物包含一种双磷酸盐、一种肿瘤化疗药物和至少一种金属离子。
8.本发明将双磷酸盐与另一种抗肿瘤药物加入盐溶液中，组装成纳米颗粒。本发明的抗肿瘤纳米药物可制备成纳米颗粒冻干粉及悬浊液，可用于肿瘤患者腹腔灌注化疗，静脉注射化疗，口服，灌肠等使用给药方法。本发明的抗肿瘤纳米药物具有抗血管生成和促肿瘤凋亡双重作用，且可以与其它化疗药物或者抗体同时给药。
9.作为本发明所述抗肿瘤纳米药物的优选实施方式，所述双磷酸盐为阿仑膦酸盐、依替膦酸钠、氯膦酸钠、伊班膦酸钠或唑来膦酸。
10.作为本发明所述抗肿瘤纳米药物的优选实施方式，所述肿瘤化疗药物为烷化剂、
抗代谢药、抗癌抗生素、中药类药物或激素类药物。
11.作为本发明所述抗肿瘤纳米药物的优选实施方式，所述抗肿瘤纳米药物的制备方法为：将阿仑膦酸钠水溶液，thz1盐酸盐水溶液，加入氯化钙溶液中，调节ph值至中性或碱性，搅拌后离心得到纳米药物，用水溶液及乙醇洗去游离药物，得到aln
‑
ca
‑
thz1抗肿瘤纳米药物。
12.作为本发明所述抗肿瘤纳米药物的优选实施方式，所述抗肿瘤纳米药物的制备方法为：将阿仑膦酸钠水溶液，5氟尿嘧啶水溶液，加入氯化钙溶液中，调节ph值至中性或碱性，搅拌后离心得到纳米药物，用水溶液及乙醇洗去游离药物，得到aln
‑
ca
‑
5fu抗肿瘤纳米药物。
13.作为本发明所述抗肿瘤纳米药物的优选实施方式，所述抗肿瘤纳米药物可在纳米颗粒表面进一步修饰靶向肿瘤的基团或靶向正常组织的基团。
14.本发明的纳米颗粒表面带氨基，可与多种基团反应，因此可在纳米颗粒表面进一步修饰各种肿瘤或正常组织靶向的基团。
15.作为本发明所述抗肿瘤纳米药物的优选实施方式，所述靶向肿瘤的基团为rgd多肽、叶酸或转铁蛋白。
16.作为本发明所述抗肿瘤纳米药物的优选实施方式，所述rgd多肽为nhs
‑
peg
‑
rgd，所述nhs
‑
peg
‑
rgd的分子量为500
‑
15000。
17.本发明同时提供所述的抗肿瘤纳米药物在制备治疗癌症的药物中的应用。
18.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述癌症为卵巢癌。
19.本发明的有益效果：
20.(1)本发明与其它发明相比，不需要药物载体，将双磷酸盐与化疗药物自组装形成纳米药物。本发明选用的双磷酸盐具有抑制肿瘤细胞迁移活性，能够抑制肿瘤扩散。结合其它化疗药物能更进一步提高药效。
21.(2)与其他方法制备的纳米药物相比，本发明制备的纳米药物表面带有大量氨基，可以与多种基团反应，以此在纳米药物表面修饰其他官能团。
22.(3)本发明小分子药物药效差及毒性大的问题，提出一种将两种小分子药物自组装形成纳米颗粒，以及利用该方法制备的纳米药物用于抗肿瘤治疗：具有肿瘤靶向及有效抑制肿瘤增殖及转移的作用。本发明构建小鼠人卵巢癌腹腔瘤模型，待在小鼠腹腔内形成实体瘤后，将纳米药物通过腹腔注射入小鼠腹腔，通过小动物活体成像仪监测肿瘤发展情况，通过小鼠生存曲线及肿瘤大小评估抗肿瘤药效。
附图说明
23.图1：样品2的透射电子显微镜图片；从透射结果来看，制备的样品分散均匀，单个颗粒的大小约为20nm左右。
24.图2：样品2的x射线光电子能谱(xps)图片；从x射线光电子能谱来看，纳米药物由c，o，p，ca四种元素组成。
25.图3：aln
‑
ca
‑
thz1可时间
‑
浓度依赖地抑制卵巢癌细胞增殖(n＝6)。
26.图4：a，细胞划痕实验结果(n＝3)；b，细胞划痕实验迁移率统计图(n＝3)***p<0.001。
27.图5：不同药物组治疗skov3荷瘤小鼠体内生物发光图像。
具体实施方式
28.为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
29.实施例1
30.将0.66g阿仑膦酸钠溶解于50ml去离子水中，标记为溶液a；将0.2g无水氯化钙溶解于50ml去离子水中，标记为溶液b；将0.033g盐酸阿霉素溶解于10ml去离子水中，标记为溶液c。将a，b，c溶液加在一起，标记为溶液d，用naoh将溶液d的ph值调为5.0，常温下反应2小时。通过离心收集样品，用去离子水洗涤1次，酒精(100％无水乙醇)洗涤2次，并做成冻干粉，标记为aln
‑
ca
‑
dox(样品1)。
31.实施例2
32.将0.66g阿仑膦酸钠溶解于50ml去离子水中，标记为溶液a；将0.2g无水氯化钙溶解于50ml去离子水中，标记为溶液b；将0.022g盐酸thz1溶解于10ml去离子水中，标记为溶液c。将a，b，c溶液加在一起，标记为溶液d，用naoh将溶液d的ph值调为5.0，常温下反应2小时。通过离心收集样品，用去离子水洗涤1次，酒精洗涤2次。并做成冻干粉，标记为aln
‑
ca
‑
thz1(样品2)。
33.实施例3
34.将0.66g阿仑膦酸钠溶解于50ml去离子水中，标记为溶液a；将0.2g无水氯化钙溶解于50ml去离子水中，标记为溶液b；将0.03g 5
‑
氟尿嘧啶(5fu)溶解于10ml去离子水中，标记为溶液c。将a，b，c溶液加在一起，标记为溶液d，用naoh将溶液d的ph值调为5.0，常温下反应2小时。通过离心收集样品，用去离子水洗涤1次，酒精洗涤2次。并做成冻干粉，标记为aln
‑
ca
‑
5fu(样品3)。
35.实施例4
36.将0.66g阿仑膦酸钠溶解于50ml去离子水中，标记为溶液a；将0.2g无水氯化钙溶解于50ml去离子水中，标记为溶液b；将0.02g奥沙利铂溶解于10ml去离子水中，标记为溶液c。将a，b，c溶液加在一起，标记为溶液d，用naoh将溶液d的ph值调为5.0，常温下反应2小时。通过离心收集样品，用去离子水洗涤1次，酒精洗涤2次。并做成冻干粉，标记为aln
‑
ca
‑
oxa(样品4)。
37.实施例5
38.取10mg实施例2制备得到的aln
‑
ca
‑
thz1冻干粉，分散于10ml无水乙醇中，标记为溶液a，在溶液a中加入1mg nhs
‑
peg
‑
rgd，反应24小时，离心收集样品，冻干，标记为aln
‑
ca
‑
thz1
‑
rgd(样品5)。
39.实施例6
40.将10mg rgd多肽
‑
聚乙二醇
‑
n
‑
羟基琥珀酰亚胺(英文名：rgd
‑
peg2000
‑
nhs)溶于10ml dmso中，再加入100mg pamam/capo分散在此溶液中，黑暗、常温下反应24小时。离心，透析，冻干，即得到rgd修饰的磷酸钙纳米材料，简称为rgd
‑
peg
‑
capo。
41.将100mg 5
‑
氟尿嘧啶溶解于10ml dmso中，充分溶解，并将1mg上述rdg
‑
peg
‑
capo分散于此溶液中。黑暗、室温环境下于室温反应48小时。即已经装载5
‑
fu药物rgd
‑
peg
‑
capo
纳米颗粒，简称为rgd
‑
peg
‑
capo/5fu。
42.实施例7aln
‑
ca
‑
thz1细胞杀伤实验
43.复苏并培养人卵巢癌细胞skov3至对数期，收集细胞，细胞计数后调整细胞悬液浓度，在96孔板中间区域每孔加入100ul含细胞悬液的mccoys 5a完全培养基(含10％fbs)，使每孔细胞个数在5000
‑
8000(边缘孔用无菌双蒸水填充)。将96孔板放置在5％co2，37℃的条件下孵育，至细胞单层铺满96孔板孔底，加入浓度梯度的aln
‑
ca
‑
thz1，浓度分别为：100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78mg/l。处理过的细胞分别孵育24、48、72小时后每孔加入10ul的cck8溶液，静置2
‑
4小时后，每孔在470nm波长下的透射光强用微孔板分光光度计测定，以此计算出各孔内细胞存活率，并根据相对应的aln
‑
ca
‑
thz1浓度作图。
44.结果如图3所示，用不同浓度的aln
‑
ca
‑
thz1分别处理卵巢癌细胞24、48、72小时，采用cck8法检测细胞的增殖活性，在干预时间相同的情况下，aln
‑
ca
‑
thz1对细胞增殖的抑制率随浓度的增加而增加；在干预浓度相同的情况下，aln
‑
ca
‑
thz1对细胞增殖的抑制率随时间的增加而增加。
45.实施例8抑制肿瘤细胞迁移实验
46.取对数生长期的skov3细胞，胰酶消化后，以1
×
104/孔的密度接种于12孔板内。于37℃及5％co2饱和湿度的恒温培养箱中静置培养。常规培养至细胞呈单层，细胞融合度达到85％时，用100μl的无菌枪头在孔板底部平行划2个宽度一致的“一”字型划痕纵线，立即用pbs洗3次，以洗去悬浮的细胞和细胞碎片。显微镜下拍照记录划痕区相对距离(0小时)。负压吸取所有pbs液后，加入含2mg/l aln
‑
ca
‑
thz1的2％血清培养基1ml，以未加药的2％血清培养基为对照组，继续在培养箱中培养。显微镜下观察并在24小时拍照后置于恒温培养箱中继续培养，放大倍数为200
×
。每个划痕分别拍摄6个不同的部位。在adobe illustrator(ai)软件里面量出不同时间不同分组划痕的宽度；细胞迁移率＝(0小时细胞间距
‑
24小时细胞间距)/0小时细胞间距*100％。
47.细胞划痕实验的结果如图4所示，显示aln
‑
ca
‑
thz1组的划痕距离明显大于对照组，表明细胞活动和迁移能力被减弱，aln
‑
ca
‑
thz1起到显著抑制卵巢癌细胞迁移的作用。
48.实施例9动物实验
49.skov3细胞分散于pbs中，调节细胞密度为2
×
107/ml，用1ml注射器抽取0.2ml细胞悬液，75％酒精消毒5
‑
6周龄雌性裸鼠腹部皮肤，于左下腹回抽无血后，注入裸鼠腹腔，细胞数为4
×
106个。自注入肿瘤细胞5天后，将裸鼠随机分为一组对照组和三组处理组，对照组腹腔内注射pbs 0.2ml，处理组腹腔内分别注射naaln 0.16mg/只鼠，thz1 0.02mg/只鼠，aln
‑
ca
‑
thz1 0.2mg/只鼠，每7天注射一次，连续注射三次。每日观察裸鼠的精神状况、皮肤、饮食、活动能力等，于移植肿瘤后第七天起测量裸鼠的腹围、体重，用小鼠活体成像仪观察腹腔移植瘤的生长情况，并计算各组小鼠的生存天数。应用spss12.0统计软件进行数据处理，实验数据均以均数
±
标准差表示。
50.结果如图5所示，四组荷瘤裸鼠均在腹腔形成移植瘤，成瘤率100％。aln
‑
ca
‑
thz1处理组裸鼠腹腔肿瘤荧光值小于对照组，并且转移灶数量没有增加，说明aln
‑
ca
‑
thz1在体内可抑制肿瘤的生长和转移，对于卵巢癌腹腔转移的治疗具有潜在的价值。
51.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当
理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。