一种血脂快速检测仪及检测方法与流程

1.本发明涉及血脂检查技术领域，具体涉及一种血脂快速检测仪及检测方法。


背景技术：

2.血脂检测包括总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇等项目。我国成人血脂异常人群已达1.8亿，高脂血症可导致脑卒中、冠心病、心肌梗死和猝死。因此，定期进行血脂检测对防治心脑血管疾病具有重要意义。
3.目前，市面上快速血脂检测仪的原理是采用干化学酶法，采集的血液与试纸条中的化学试剂、酶发生生化显色反应，通过血脂仪检测试剂条反射光强度，再计算血脂含量。但是，此类血脂仪普遍存在以下缺点：1.显色反应时间长，影响因素多，易带来较大误差；2.测量反射光强度易受到试纸条显色均匀程度、基底反射和光散射等因素影响；3.必须包含光源、光强检测器和光路仪，仪器难以微型化。
4.这种设计上的先天不足是采用了显色反射光度法造成的，难以通过工艺技术上的改进来弥补。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种血脂快速检测仪及检测方法，采用酶免疫分析法与试纸条技术相结合，建立一种商品化的便携、快速、高稳定性及灵敏度的血脂快速检测系统。
6.本发明提供的一种血脂快速检测仪，包括试纸条、电极板和电化学工作站，所述试纸条上设置有用于吸收待测溶液的虹吸口，所述试纸条与电极板通过三电极体系连接，所述电极板与电化学工作站连接进行测定；
7.所述试纸条有三种，分别是固定有胆固醇氧化酶的总胆固醇测定用试纸条、固定有胆固醇酯酶的高密度脂蛋白胆固醇测定用试纸条以及固定有脂蛋白脂肪酸和甘油激酶的甘油三酯测定用试纸条。
8.优选地，所述三电极体系包括依次设于试纸条上的工作电极、参比电极和对电极以及设于电极板上的三个电极接口，三个所述电极接口与工作电极、参比电极和对电极一一对应。
9.优选地，所述工作电极、参比电极和对电极均为丝网印刷电极。
10.优选地，所述虹吸口的容积为0.0012cm3。
11.本发明提供的一种血脂快速检测方法，采用上述的血脂快速检测仪，包括如下步骤：
12.s1步骤：总胆固醇的测定：将总胆固醇测定用试纸条置于待测溶液中，通过虹吸口的虹吸效应吸入待测溶液后，将总胆固醇测定用试纸条的工作电极、参比电极和对电极分别插入电极板的三个接口中，连接化学工作站进行测定；
13.甘油三酯的测定：将甘油三酯测定用试纸条置于待测溶液中，通过虹吸口的虹吸
效应吸入待测溶液后，将甘油三酯测定用试纸条的工作电极、参比电极和对电极分别插入电极板的三个接口中，连接化学工作站进行测定；
14.高密度脂蛋白胆固醇的测定：将高密度脂蛋白胆固醇测定用试纸条置于待测溶液中，通过虹吸口的虹吸效应吸入待测溶液后，将高密度脂蛋白胆固醇测定用试纸条的工作电极、参比电极和对电极分别插入电极板的三个接口中，连接化学工作站进行测定；
15.s2步骤：低密度脂蛋白胆固醇的计算：根据s1步骤中测得的总胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇的值，计算出低密度脂蛋白胆固醇的值。
16.优选地，所述化学工作站在测定时，以5.0mmol/l铁氰化钾作为测量探针，利用差分脉冲伏安法作为测量方法，扫描电位为
‑
0.2～0.6v，扫速为 100mv。
17.优选地，s1步骤中，所述总胆固醇测定用试纸条的制备方法具体如下：
18.取试纸条在壳聚糖溶液中浸泡，烘干后放入naoh溶液中浸泡，二次水漂洗，以除去游离未被固定的壳聚糖；然后将固定有壳聚糖的试纸条放入戊二醛溶液中浸泡，二次水漂洗，用吸水纸吸取多余水分，烘干；再将试纸条浸泡于胆固醇氧化酶溶液，取出并用二次水漂洗，烘干得到固定有胆固醇氧化酶的总胆固醇测定用试纸条。
19.优选地，s1步骤中，所述高密度脂蛋白胆固醇测定用试纸条的制备方法具体如下：
20.取试纸条在固定化酶溶液中浸泡后，取出，用二次水漂洗，以除去游离未被固定的固定化酶，烘干得到固定有胆固醇酯酶的高密度脂蛋白胆固醇测定用试纸条。
21.优选地，s1步骤中，所述甘油三酯测定用试纸条的制备方法具体如下：
22.取试纸条在脂蛋白脂肪酸溶液中浸泡，取出，用二次水漂洗，以除去游离未被固定的脂蛋白脂肪酸，烘干；再将试纸条放入甘油激酶溶液中浸泡后，取出，并用二次水漂洗，烘干得到固定有胆固醇酯酶的甘油三酯测定用试纸条。
23.优选地，所述总胆固醇测定用试纸条对应的待测溶液的制备方法是：取 2.0ml的丙酮和2.0ml无水乙醇混合生成丙酮
‑
乙醇处理液备用，使用前，取血液样品1.0ml，加入1.0ml丙酮
‑
乙醇处理液，搅拌3
‑
4min，摇匀即得；
24.所述甘油三酯测定用试纸条和高密度脂蛋白胆固醇测定用试纸条对应的待测溶液的制备方法是：取5.0ml血液样品试管中，加入5.0ml0.01mol/l，ph 7.0磷酸盐缓冲液及1.0ml饱和硫酸铵溶液，摇匀，静置5 min后待测，所析出淡黄色透明液体即为待测溶液。
25.本发明的有益效果体现在：
26.本发明采用丝网印刷试纸条，利用电化学方法，结合酶对底物的催化作用，可实现tg、tc以及hdl
‑
c值的高灵敏快速检测，进而通过计算得到 ldl
‑
c的值，实现血脂四项的快速检测。本发明研究了不同酶的固定方法、结合时间、作用浓度范围等参数，考察了酶试纸条的稳定性、重现性等影响因素，结果表明，所制备试纸条可分别在1.00～5.17
×
10
‑4mmol/l、2.30～ 1.20
×
10
‑4mmol/l、1.60～0.60
×
10
‑4mol/l、1.50～4.53
×
10
‑4mol/l范围对总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇进行检测，对血脂四项分析系统商业化生产提供了参考。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件
或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
28.图1为本发明提供的血脂快速检测仪的结构示意图；
29.图2为空白试纸条稳定性研究结果示意图；
30.图3为总胆固醇测定用试纸条稳定性研究结果示意图；
31.图4为总胆固醇测定工作曲线；
32.图5为总胆固醇测定拟合曲线对比图；
33.图6为高密度脂蛋白胆固醇测定用试纸条稳定性研究结果示意图；
34.图7为甘油三酯测定用试纸条稳定性研究结果示意图。
35.附图中，1
‑
试纸条，2
‑
虹吸口，3
‑
三电极体系，4
‑
电极板，5
‑
电化学工作站。
具体实施方式
36.下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
37.需要注意的是，除非另有说明，本技术使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
38.本发明实施例中提及的电化学工作站购自上海辰华仪器公司，型号为 chi660c电化学工作站；甘油三月桂酸酯、高密度脂蛋白胆固醇、硫酸化环糊精、甘油激酶、脂蛋白脂肪酸、壳聚糖、氢氧化钠、戊二醛、磷酸盐缓冲液、胆固醇氧化酶、铁氰化钾、胆固醇、tritonx
‑
100、异丙醇，以上试剂均购自于阿拉丁试剂公司，实验用水为二次去离子水。血清模拟样品由优利特公司提供。
39.实施例1
40.本实施例提供的一种血脂快速检测仪，包括试纸条1、电极板4和电化学工作站5，所述试纸条上设置有用于吸收待测溶液的虹吸口2，所述虹吸口的容积优选为0.0012cm3，所述试纸条与电极板通过三电极体系3连接，所述电极板4与电化学工作站5连接进行测定；
41.所述试纸条1有三种，分别是固定有胆固醇氧化酶的总胆固醇测定用试纸条、固定有胆固醇酯酶的高密度脂蛋白胆固醇测定用试纸条以及固定有脂蛋白脂肪酸和甘油激酶的甘油三酯测定用试纸条。
42.所述三电极体系3包括依次设于试纸条上的工作电极、参比电极和对电极以及设于电极板上的三个电极接口，三个所述电极接口与工作电极、参比电极和对电极一一对应。所述工作电极、参比电极和对电极均为丝网印刷电极，石墨的导电性好,质量轻且延展性强,容易印刷并且不会生锈。
43.实施例2
44.本实施例提供一种血脂快速检测方法，采用如实施例1所记载的血脂快速检测仪，具体包括如下步骤：
45.s1步骤：总胆固醇(tc)的测定：将总胆固醇测定用试纸条置于待测溶液中，通过虹吸口的虹吸效应吸入待测溶液后，将总胆固醇测定用试纸条的工作电极、参比电极和对电极分别插入电极板的三个接口中，连接化学工作站进行测定；
46.甘油三酯(tg)的测定：将甘油三酯测定用试纸条置于待测溶液中，通过虹吸口的
虹吸效应吸入待测溶液后，将甘油三酯测定用试纸条的工作电极、参比电极和对电极分别插入电极板的三个接口中，连接化学工作站进行测定；
47.高密度脂蛋白胆固醇(hdl
‑
c)的测定：将高密度脂蛋白胆固醇测定用试纸条置于待测溶液中，通过虹吸口的虹吸效应吸入待测溶液后，将高密度脂蛋白胆固醇测定用试纸条的工作电极、参比电极和对电极分别插入电极板的三个接口中，连接化学工作站进行测定；
48.s2步骤：低密度脂蛋白胆固醇(ldl
‑
c)的计算：根据s1步骤中测得的总胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇的值，计算出低密度脂蛋白胆固醇的值，计算公式为ldl
‑
c含量＝tc含量
‑
hdl
‑
c含量。
49.在本实施例中，所述化学工作站在测定时，以5.0mmol/l铁氰化钾作为测量探针，利用差分脉冲伏安法作为测量方法，扫描电位为
‑
0.2～0.6v，扫速为100mv。
50.需要说明的是，s1步骤中，总胆固醇的测定中所采用的待测溶液的制备方法是：取2.0ml的丙酮和2.0ml无水乙醇混合生成丙酮
‑
乙醇提取液备用，在使用前，取血液样品1.0ml，加入1.0ml丙酮
‑
乙醇处理液，搅拌3
‑ꢀ
4min，摇匀制得；
51.甘油三酯的测定和高密度脂蛋白胆固醇的测定所采用的待测溶液的制备方法是：取5.0ml血液样品于试管中，加入5.0ml 0.01mol/l，ph 7.0的磷酸盐缓冲液及1.0ml饱和硫酸铵溶液，摇匀，静置5min后所析出的淡黄色透明液体即为其待测溶液。
52.需要说明的是，s1步骤中总胆固醇的测定、甘油三酯的测定以及高密度脂蛋白胆固醇的测定无先后顺序的限定，单独进行其中任一项的测定，可以得到对应的测定结果，三项均测得结果后，通过计算可以得出低密度脂蛋白胆固醇的值，具体的计算方法为现有技术，在此不再赘述。
53.在本实施例中，所用的总胆固醇测定用试纸条的制备方法具体如下：
54.将试纸条浸入10.0ml 0.1％的壳聚糖溶液中浸泡10min，取出，烘干；而后将修饰后的试纸条放入0.05mol/l naoh溶液中浸泡5min后，二次水漂洗2次，以除去游离未被固定的壳聚糖；将固定有壳聚糖的试纸条放入0.8％的戊二醛溶液中浸泡100min，二次水漂洗3次，用吸水纸吸取多余水分，烘干；将上述试纸条浸泡于胆固醇氧化酶溶液30min，取出，并用二次水漂洗2次，烘干备用。
55.在本实施例中，所述高密度脂蛋白胆固醇测定用试纸条的制备方法具体如下：
56.将abse
‑
交联琼脂1.0g(抽泸后湿重)置于冰水浴中冷却，顺次加入 1.0ml冷蒸馏水、1.0ml 1.0mol/l冷盐酸，搅匀并滴加1.0ml 5％冷亚硝酸钠，温和搅拌反应20min后用砂芯漏斗过滤，再用0.05mol/l冷盐酸和冷蒸馏水各洗3次，滤干重氮盐衍生物后立即投入170酶单位的胆固醇酯酶 0.5ml磷酸缓冲液(ph 7.2)的混合液中，用1.0mol/l碳酸钠调ph至8.0，在冰浴中温和搅拌进行偶联反应3小时，过滤得上清液，以少量11.0mol/l 氯化钠溶液洗2次，洗涤液与上清液合并，以测定未偶联胆固醇酯酶活力，然后继续用11.0mol/l氯化钠溶液和磷酸缓冲溶液各洗10次，滤干，得桔黄色的固定化胆固醇酯酶，再用α
‑
萘酚作封闭处理，固定化酶会转变为橙红色，用磷酸缓冲液保存在冰箱中待用；将试纸条浸泡在固定化酶溶液中30 min，取出，二次水漂洗2次，以除去游离未被固定的固定化酶，烘干备用。
57.在本实施例中，所述甘油三酯测定用试纸条的制备方法具体如下：
58.将试纸条浸入5.0ml 0.1％的脂蛋白脂肪酸溶液中30min，取出，二次水漂洗2次，
以除去游离未被固定的脂蛋白脂肪酸，烘干备用。将试纸条放入0.05mol/l甘油激酶溶液中浸泡5min后，取出，并用二次水漂洗2次，烘干备用。甘油三酯可在脂蛋白脂肪酸的作用下水解生成甘油和atp，甘油在甘油激酶的作用下与atp作用产生电流变化。
59.实施例3
60.试纸条初始稳定性研究
61.对未固定任何酶的初始状态下的试纸条进行稳定性及重现性实验，以 5.0mmol/l铁氰化钾作为测量探针，差分脉冲伏安法作为测量方法，扫描电位为
‑
0.2～0.6v，扫速为100mv，其氧化峰如图2所示，从图中可以看出。丝网印刷电极呈现良好的稳定性及重现性，进一步研究了20组试纸条，对其峰电流数据进行数据分析，结果如表1所示：
62.表1印刷电极稳定性试验数据
[0063][0064]
20组试纸条所测氧化峰电流值相对偏差为0.20％，表明所定制的试纸条具有较好的稳定性。
[0065]
实施例4
[0066]
按照实施例2中记载的方法批量制备不同浓度胆固醇氧化酶修饰的总胆固醇测定用试纸条，并对试纸条批量稳定性进行研究，以5mmol/l铁氰化钾作为测量探针，差分脉冲伏安法作为测量方法，扫描电位为
‑
0.2～0.6v，扫速为100mv，其氧化峰如图3所示。
[0067]
从图3中可以看出，探针氧化峰电流强度随着胆固醇氧化酶浓度的降低而降低。进一步对三个浓度(分别为1.500μg/l、0.770μg/l和0.885μg/l) 个10组试纸条稳定性进行研究，对其峰电流数据进行分析，结果如表2所示：
[0068]
表2胆固醇氧化酶修饰电极稳定性试验数据
[0069]
[0070][0071]
从表中可以看出，当固定胆固醇氧化酶浓度为0.885μg/ml时，试纸条具有较佳的批量稳定性，因此选择0.885μg/ml胆固醇氧化酶进行后续实验。
[0072]
实施例5
[0073]
配置不同浓度胆固醇溶液(胆固醇浓度分别为5.17mmol/l/5.17
×
10
‑4mmol/l)，利用制备好的胆固醇氧化酶修饰印刷电极进行吸附，并测定其氧化峰电流强度，并在此基础上，分析了电流响应值与胆固醇浓度的线性关系，如图4及图5所示，结果表明，胆固醇浓度与探针氧化峰电流强度在 1.00～5.17
×
10
‑4mmol/l范围内呈线性关系，线性方程为i(μa)＝
‑
0.0725 c(μg/l)
‑
2.4222，相关系数r2＝0.9875，该方法检出限dl＝3.7
×
10
‑5mol/l。
[0074]
实施例6
[0075]
按照实施例2中记载的方法批量制备不同浓度胆固醇酯酶修饰的高密度脂蛋白胆固醇测定用试纸条，并对试纸条批量稳定性进行了研究，以5 mmol/l铁氰化钾作为测量探针，差分脉冲伏安法作为测量方法，扫描电位为
ꢀ‑
0.2～0.6v，扫速为100mv，其氧化峰如图6所示。
[0076]
从图6中可以看出，探针氧化峰电流强度随着胆固醇酯酶浓度的降低而降低，对其峰电流数据进行分析，结果如表3所示：
[0077]
表3胆固醇酯酶修饰电极稳定性试验数据
[0078][0079]
从表中可以看出，当固定胆固醇酯酶浓度为2.500μg/ml时，试纸条具有较佳的批量稳定性，因此选择2.500μg/ml胆固醇酯酶进行后续实验。
[0080]
实施例7
[0081]
按照实施例2中记载的方法批量制备不同浓度甘油激酶修饰的甘油三酯测定用试纸条，并对试纸条批量稳定性进行了研究，以5.0mmol/l铁氰化钾作为测量探针，差分脉冲伏安法作为测量方法，扫描电位为
‑
0.2～0.6v，扫速为100mv，其氧化峰如图7所示。
[0082]
从图7中可以看出，探针氧化峰电流强度随着甘油激酶浓度的降低而降低，对其峰电流数据进行分析，结果如表4所示：
[0083]
表4甘油激酶修饰电极稳定性试验数据
[0084][0085][0086]
从表4中可以看出，当固定甘油激酶浓度为1.500μg/ml时，试纸条具有较佳的批量稳定性，因此选择1.500μg/ml甘油激酶进行后续实验。
[0087]
实施例8
[0088]
(1)总胆固醇测定用试纸条的重现性和使用寿命研究
[0089]
按照实施例2中记载的方法分批次制备20支总胆固醇测定用试纸条，并对浓度为5.17mmol/l的胆固醇进行了测定，其相对标准偏差rsd＝1.26％，表明不同批次制备的试纸条具有较好的重现性。将试纸条置于80℃烘箱进行加速老化试验，结果表明，24h后，同批次20支试纸条测定浓度为 5.17mmol/l的胆固醇所得结果相对标准偏差rsd＝1.35％，48h后，同批次20 支试纸条测定浓度为5.17mmol/l的胆固醇所得结果相对标准偏差 rsd＝3.37％；加速老化一周后，同批次20支试纸条测定浓度为5.17mmol/l的胆固醇所得结果相对标准偏差rsd＝4.41％，且其测定电流值结果较24h结果降低了3.06％，表明总胆固醇测定用试纸条具有较长的使用寿命。
[0090]
(2)甘油三酯测定用试纸条的重现性和使用寿命研究
[0091]
按照实施例2中记载的方法分批次制备20支甘油三酯测定用试纸条，并对浓度为1.21mmol/l的甘油三酯进行了测定，其相对标准偏差 rsd＝1.55％，表明不同批次制备的试纸条具有较好的重现性。将试纸条置于 80℃烘箱进行加速老化试验，结果表明，24h后，同批次20支试纸条测定浓度为1.21mmol/l的甘油三酯所得结果相对标准偏差rsd＝3.55％，48h后，同批次20支试纸条测定浓度为1.21mmol/l的甘油三酯所得结果相对标准偏差rsd＝6.56；加速老化一周后，同批次20支试纸条测定浓度为1.21mmol/l的甘油三酯所得结果相对标准偏差rsd＝7.62％，且其测定电流值结果较24h结果降低了4.07％，表明试纸条具有较长的使用寿命。
[0092]
(3)高密度脂蛋白测定用试纸条的重现性和使用寿命研究
[0093]
按照实施例2中记载的方法分批次制备20支高密度脂蛋白测定用试纸条，并对浓
度为1.06mmol/l的高密度脂蛋白进行了测定，其相对标准偏差 rsd＝1.27％，表明不同批次制备的试纸条具有较好的重现性。将试纸条置于 80℃烘箱进行加速老化试验，结果表明，24h后，同批次20支试纸条测定浓度为1.06mmol/l的高密度脂蛋白所得结果相对标准偏差rsd＝1.28％，48h 后，同批次20支试纸条测定浓度为1.06mmol/l的高密度脂蛋白所得结果相对标准偏差rsd＝2.29％；加速老化一周后，同批次20支试纸条测定浓度为 1.06mmol/l的高密度脂蛋白所得结果相对标准偏差rsd＝3.30％，且其测定电流值结果较24h结果降低了2.02％，表明试纸条具有较长的使用寿命。
[0094]
实施例9
[0095]
按照实施例2记载的各种试纸条的待测溶液的制备方法对血液样品进行处理，然后分别利用总胆固醇测定用试纸条、甘油三酯测定用试纸条、高密度脂蛋白测定用试纸条对处理后的血液样品进行胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白测定，结果如表5至表7所示，检测结果回收率分别为 103.2％～108.9％、102.2％～106.9、104.4～115.7％之间，表明该试纸条具有一定的实际应用能力。因血液样本检测结果无医学检测结果对照，因此暂未列出。
[0096]
表5血液样品总胆固醇分析结果
[0097][0098][0099]
表6血液样品甘油三酯分析结果
[0100][0101]
表7血液样品高密度脂蛋白分析结果
[0102][0103]
注：ldl
‑
c含量＝tc含量
‑
hdl
‑
c含量。
[0104]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。