一种检测含有正电荷聚合物细菌内毒素的方法与流程

1.本发明涉及药物分析领域，特别是一种检测含有正电荷聚合物细菌内毒素的方法。


背景技术：

2.细菌内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，当革兰氏阴性菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。因此，细菌内毒素广泛存在于自然界中。内毒素的危害是非常严重的，会引起：1.发热反应，人体对于细菌内毒素极为敏感。极微量(1～5ng/kg)内毒素就能引起体温上升；2.白细胞反应，细菌内毒素进入宿主体内以后，由于细胞发生移动并黏附到组织毛细血管上，血流中占白细胞总数60％～70％的中性粒细胞数量迅速减少；3.内毒素休克，大量内毒素作用于机体的巨噬细胞、中性粒细胞以及补体系统和凝血系统等，会导致微循环障碍，出现微循环衰竭、低血压、缺氧、酸中毒等，于是导致病人休克。因此，生物制品类、注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂以及医疗器材类(如一次性注射器，植入性生物材料)必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。
3.现有技术方案存在的主要问题：细菌内毒素最常用的检查法一般是鲎试剂试验法，1964年由美国学者levin和bang发现微量革兰氏阴性菌内毒素也可以引起凝胶反应，从而在1968年创立了一种定性或定量检测微量细菌内毒素的体外分析方法(鲎试剂检测法)。其检测原理是：鲎体内有一种变形细胞，细胞内中血蓝蛋白，一旦接触到细菌的内毒素，就会激活蛋白凝固原，导致凝集现象的发生。鲎试剂检测法操作简便，所以得到广泛的使用，但是鲎试剂法的前提是要排除样品中其他物质对检测的干扰，以防止检测结果的偏差。特别是带有正电荷的聚合物会与带有负电荷的内毒素吸附结合，导致待测液中内毒素无法与鲎试剂发生凝结。
4.在细菌内毒素检测工作中，如遇到杂质干扰，通常采用稀释倍数法或调解待测液酸碱度的方法，以减少检测中遇到的干扰。但是，当某些医疗器械、药物或其浸提液中含有带正电荷的聚合物，这些物质溶出后会与内毒素吸附结合。通过稀释倍数法或调解待测液酸碱度通常导致检测时出现假阴性的现象；市场需要一种能够排除正电荷聚合物对细菌内毒素检测过程的干扰，同时不引入外源性内毒素的检测方法，本发明解决这样的问题。


技术实现要素：

5.为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测含有正电荷聚合物细菌内毒素的方法，能够排除正电荷聚合物对细菌内毒素检测过程的干扰，同时不引入外源性内毒素。
6.为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
7.一种检测含有正电荷聚合物细菌内毒素的方法，包括如下步骤：
8.步骤一，器皿前处理，除去外源性内毒素；
9.步骤二，树脂前处理：将阴离子交换树脂、阳离子交换树脂分别用强碱和强酸浸
泡，再用检查用水清洗阴离子交换树脂、阳离子交换树脂，至试纸检测清洗液呈中性；将阳离子交换树脂放在滤网的下方，将阴离子交换树脂放入滤网上方，加入无热原检查用水至没过阴离子交换树脂为止，震荡，再取出倒掉阴离子交换树脂，用无热原检查用水将滤网上层清洗干净，将阳离子交换树脂密封保存备用；
10.步骤三，制备细菌内毒素阳性对照液；
11.步骤四，制备供试品溶液和供试品阳性液；
12.步骤五，准备鲎试剂；
13.步骤六，取供试品溶液、检查用水、供试品阳性液、阳性对照液，分别加入已复溶好的鲎试剂中，加样完毕后置恒温器中保温60
±
2分钟观察结果，当阴性对照管均为阴性，阳性对照管均为阳性，供试品阳性对照管均为阳性，试验有效。
14.前述的一种检测含有正电荷聚合物细菌内毒素的方法，步骤二中将阴离子交换树脂、阳离子交换树脂分别用强碱和强酸浸泡的具体方法是：将阳离子交换树脂中加入1mol/l hcl溶液浸泡不少于1小时，在阴离子交换树脂中加入1mol/l naoh溶液浸泡不少于1小时。
15.前述的一种检测含有正电荷聚合物细菌内毒素的方法，阴离子交换树脂与阳离子交换树脂的份数比为1:1
‑
5:1。
16.前述的一种检测含有正电荷聚合物细菌内毒素的方法，制备细菌内毒素阳性对照液的方法为：取细菌内毒素工作标准品，开启后加入检查用水，封口膜封口后置于漩涡震荡仪上混匀，再加入检查用水，逐步稀释为0.5eu/ml和0.25eu/ml，其中0.25eu/ml为阳性对照液。
17.前述的一种检测含有正电荷聚合物细菌内毒素的方法，制备供试品溶液和供试品阳性液的方法包括如下步骤：
18.(1)若待测样品为液体，可直接稀释得到待测液后使用；若待测样品为固体，需对样品进行浸提，浸提液为待测液备用；
19.(2)将待测液与步骤二密封保存备用的阳离子交换树脂按1:1
‑
10:1的体积质量比于无热原试管中进行混合，再在摇床中震荡不少于2小时，最后于20
‑
35℃条件下静置20
‑
60min；
20.(3)将处理后的样品溶液使用检查用水稀释制备成有效稀释倍数下的供试品溶液，有效稀释倍数mvd＝cl/λ，式中l为供试品的细菌内毒素限值，c为供试品溶液的浓度，当l以eu/ml表示时，c等于1.0ml/ml，当l以eu/mg或eu/u表示时，c的单位需为mg/ml或u/ml，λ为鲎试剂的标示灵敏度eu/ml；
21.(4)使用细菌内毒素工作标准品溶液将处理后的样品溶液稀释制备成含2λ内毒素、有效稀释倍数下mvd的供试品阳性液。
22.前述的一种检测含有正电荷聚合物细菌内毒素的方法，制备鲎试剂的方法为：取5倍于供试品数量的0.1ml/支的鲎试剂，按照标示量加入检查用水复溶备用。
23.前述的一种检测含有正电荷聚合物细菌内毒素的方法，阳离子交换树脂包括：强酸性阳离子交换树脂或弱酸性阳离子交换树脂；阴离子交换树脂为氢氧型阴离子交换树脂。
24.前述的一种检测含有正电荷聚合物细菌内毒素的方法，带正电荷的聚合物包括：
季铵盐类、双胍类、氯己定类、醇类、酚类、有机胺类、砒啶类或异噻唑啉酮类。
25.本发明的有益之处在于：
26.本发明的检测方法，能够检测含有正电荷聚合物样品的细菌内毒素，通过阳离子交换树脂对待测液的处理，可有效降低待测液中含有正电荷的聚合物，可有效避免假阴性检测结果；
27.本发明操作简单；
28.本发明提供了一种制备无热原阳离子交换树脂的方法。
附图说明
29.图1是本发明检测设备的一种实施例的结构示意图；
30.图2是本发明树脂前处理时检测设备的一种实施例的结构示意图；
31.图中附图标记的含义：
32.1器皿，2滤网，3树脂，301阴离子交换树脂，302阳离子交换树脂。
具体实施方式
33.以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
34.用以下实施例验证本发明能够有效避免假阴性。
35.实施例1：
36.取含有正电荷聚合物—盐酸聚六亚甲基双胍的某护理液作为待测样品。护理液做内毒素检查，限值为0.5eu/ml，鲎试剂灵敏度选用0.125eu/ml。
37.细菌内毒素检查方法如下：
38.1、器皿1前处理：试验所用玻璃器皿1及金属工具需经高温热处理除去可能存在的外源性内毒素；
39.2、树脂3前处理：分别取10g强酸性阳离子交换树脂302(苯乙烯—二乙烯苯磺酸基阳离子交换树脂)和强碱性阴离子交换树脂301(苯乙烯季铵基阴离子交换树脂)，放入图1的装置中，分别用1mol/l hcl溶液和1mol/lnaoh溶液浸泡阳离子交换树脂和阴离子交换树脂2小时，使树脂中含有的微生物灭活同时去除部分树脂中的细菌内毒素。然后分别倒掉hcl溶液和naoh溶液，用检查用水清洗树脂数次，至试纸检测清洗液呈中性。再将经漂洗至中性的阴离子交换树脂装入图1的管中，阴离子交换树脂位于滤网2之上，阴阳离子交换树脂份数比为1:1，再加入适量无热原检测用水，至少没过阴离子交换树脂，如图2。将装有树脂的管子放入摇床中，震荡2小时，取出倒掉阴离子交换树脂，并用无热原检查用水将滤网2上层清洗干净。阳离子树脂密封保存备用。
40.3、细菌内毒素阳性对照液制备：
41.取细菌内毒素工作标准品1支，开启后加入1ml检查用水，封口膜封口后置于漩涡震荡仪上混匀15分钟，再使用检查用水逐步稀释为0.5eu/ml和0.25eu/ml，其中0.25eu/ml为阳性对照液。
42.4、供试品溶液制备：
43.取护理液与第2步处理后的树脂按照1:1(体积质量比)进行混合，于摇床上震荡3小时，于30℃水浴条件下静置30min。供试液：分别取0.2ml的震荡处理后的护理液和0.2ml
的检查用水混合。
44.供试品阳性液：分别取0.2ml震荡处理后的护理液和0.2ml的0.5eu/ml内毒素溶液混合。
45.5、鲎试剂的准备：
46.根据供试品的数量，取若干支0.1ml/支鲎试剂，按照标示量加入检查用水复溶备用。
47.6、检测
48.取供试品溶液、检查用水、供试品阳性液、阳性对照液各0.1ml，分别加入第5步已复溶好的鲎试剂中，加样完毕后置恒温器中保温60
±
2分钟观察结果，当阴性对照管均为阴性，阳性对照管均为阳性，供试品阳性对照管均为阳性，试验有效。
49.实施例2：
50.取含有正电荷聚合物—双胍类聚合物的湿性敷料作为待测样品。敷料做内毒素检查，限值为20eu/ml，鲎试剂灵敏度选用0.25eu/ml。
51.细菌内毒素检查方法步骤与实施例1相同，步骤2中阴阳离子交换树脂份数比为5:1；步骤4中湿性敷料浸提液与第2步处理后的树脂按照5:1(体积质量比)进行混合；
52.实施例3：
53.取含有正电荷聚合物—氯己定的某液体敷料作为待测样品。液体敷料做内毒素检查，限值为20eu/ml，鲎试剂灵敏度选用0.5eu/ml。
54.细菌内毒素检查方法步骤与实施例1相同，步骤2中阴阳离子交换树脂份数比为3:1；步骤4中取液体敷料与第2步处理后的树脂按照10:1(体积质量比)进行混合；
55.对比实施例1：与实施例1相同只是缺少树脂前处理。
56.取含有正电荷聚合物—盐酸聚六亚甲基双胍的某护理液作为待测样品。护理液做内毒素检查，限值为0.5eu/ml，鲎试剂灵敏度选用0.125eu/ml。
57.细菌内毒素检查方法如下：
58.1、器皿1前处理：试验所用玻璃器皿及金属工具需经高温热处理除去可能存在的外源性内毒素；
59.3、细菌内毒素阳性对照液制备：
60.取细菌内毒素工作标准品1支，开启后加入1ml检查用水，封口膜封口后置于漩涡震荡仪上混匀15分钟，再使用检查用水逐步稀释为0.5eu/ml和0.25eu/ml，其中0.25eu/ml为阳性对照液。
61.4、供试品溶液制备：
62.取护理液与阳离子交换树脂按照1:1(体积质量比)进行混合，于摇床上震荡3小时，于30℃水浴条件下静置30min。供试液：分别取0.2ml的震荡处理后的护理液和0.2ml的检查用水混合。
63.供试品阳性液：分别取0.2ml震荡处理后的护理液和0.2ml的0.5eu/ml内毒素溶液混合。
64.5、鲎试剂的准备：
65.根据供试品的数量，取若干支0.1ml/支鲎试剂，按照标示量加入检查用水复溶备用。
66.6、检测
67.取供试品溶液、检查用水、供试品阳性液、阳性对照液各0.1ml，分别加入第5步已复溶好的鲎试剂中，加样完毕后置恒温器中保温60
±
2分钟观察结果，结果如表1所示：
68.表1
[0069] 阳性对照阴性对照供试品溶液供试品阳性液实施例1 —— 实施例2 —— 实施例3 —— 对比实施例1 ———
[0070]
由以上实验可知：未经前处理的对比实施例1的供试品阳性液会出现阴性结果，导致检测结果无效。本发明通过阳离子交换树脂对待测液的处理，可有效降低待测液中含有正电荷的聚合物，可有效避免假阴性检测结果。
[0071]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。