一种提高藻类P700检测信号的方法与流程

一种提高藻类p700检测信号的方法
技术领域
1.本发明涉及一种提高藻类p700检测信号的方法，属于光合作用光谱技术领域。


背景技术：

2.光合作用是地球上进行的最大规模的化学反应。放氧光合生物吸收太阳能并裂解水分子，释放出了地球上绝大多数生命活动所需的氧气，同时固定大气或水中的co2并合成有机物，为新陈代谢提供能量。在高等植物和真核藻类中，光合作用的场所是叶绿体。叶绿体的类囊体膜上排布着四个膜蛋白复合物：光系统ii(psii)、细胞色素b6f(cytb6/f)、光系统i(psi)和腺苷三磷酸合酶(atp synthase)。它们紧密协作共同完成光能吸收、电子传递和能量转化，最终合成腺苷三磷酸(atp)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(辅酶ii)(nadph)。其中，psi主要参与光合电子传递的最终步骤，即氧化类囊体囊腔侧的质体蓝素(pc)，还原基质侧的铁氧还蛋白(fd)。
3.psi由核心复合物(即反应中心)和其周围的捕光天线复合物(light-harvesting complex i，lhci)组成，核心复合物负责电荷分离和电子传递，而外周捕光天线复合物负责捕获光能，并进行光保护。在psi的反应中心有一个具有光化学反应性的叶绿素a分子二聚体，即p700。p700在300～830nm光谱范围内有广泛的吸收，其中在430和700nm处有吸收负峰，最大吸收负峰在700nm处，而在800nm左右有吸收正带。此外，p700可被不同波段的光-作用光(又称活化光)激发，变成具有高能电子的激发态分子p700*，p700*射出电子后变成p700

，p700

从还原的pc捕获电子重新变成p700。p700的氧化与还原不仅反映流经和围绕psi的电子传递，还可以反映psi甚至psii的功能。
4.p700的氧化与还原可通过700nm(最大吸收峰)的光吸收变化来检测，但是对叶片来说，容易受到叶绿素荧光和光散射的干扰，700nm处的光吸收非常复杂，难以表征p700的氧化与还原。1988年，schreiber等通过测量单一波长820nm的光吸收变化检测p700的氧化还原，此方法适合叶绿体、单细胞藻类和活体叶片。但是离体叶绿体以及藻类悬浮液存在严重的光散射，pc在800～900nm范围内的光吸收干扰，都会影响p700的检测，从而导致p700检测信号小，信噪比低，信号漂移等问题。klughammer等利用双波长差示吸收技术检测p700的光吸收变化(810～860nm)，很好地降低了由单一波长测量导致的影响。2008年schreiber等利用饱和脉冲技术，通过检测p700在近红外(830～875nm)的差示吸收变化计算psi的能量转化。
5.p700氧化还原动力学技术可实现快速、无损、原位和活体检测。目前，检测p700氧化还原动力学的仪器主要有led激发-探测光谱仪(jts-10,bio-logic sas,france)、调制叶绿素荧光仪(pam-101,walz,germany)、双通道调制叶绿素荧光仪(dual-pam-100,walz,germany)和四通道动态led阵列近红外光谱仪(dual-klas-nir,walz,germany)等。这些仪器非常适合测量高等植物叶片的p700氧化还原变化，但对于悬浮样品，尤其是绿藻，其p700氧化还原动力学信号较小，为增加p700信号，可适当增加藻细胞的浓度，但是一味增加悬浮液浓度，会导致其偏离比尔定律，造成测量结果的不准确。因此，需要提供一种新的提高藻
类p700的检测信号的方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种提高藻类p700检测信号的方法，该方法能够达到与叶片相同的测量效果。
7.本发明所提供的提高藻类p700检测信号的方法，包括如下步骤：
8.将藻类的悬浮液固定于微孔滤膜上，晾干后即可进行p700的信号检测；
9.所述藻类为绿藻。
10.上述的方法中，所述悬浮液的浓度可为20～50μg/ml，优选25μg/ml。
11.上述的方法中，将所述悬浮液通过真空泵过滤到所述微孔滤膜上。
12.上述的方法中，所述微孔滤膜可为水系混合纤维素滤膜。
13.上述的方法中，所述微孔滤膜的孔径可为0.1～0.8微米，优选0.22微米(适合莱茵衣藻)。
14.上述的方法中，可采用pam-101双波长检测单元ed-p700dw(810～870nm)进行p700氧化还原动力学测定，最终得到psi的光化学量子产量；
15.可采用双通道调制叶绿素荧光仪利用饱和脉冲法进行p700氧化还原动力学测定，最终得到psi的能量转化；
16.可采用led激发-探测光谱仪进行p700氧化还原动力学测定，最终得到p700的氧化速率、p700

再还原速率和p700

含量。
17.本发明方法具有如下有益效果：
18.1.减少基线漂移；
19.2.增强检测信号；
20.3.提高检测结果的稳定性和准确性。
附图说明
21.图1为实施例1(图1(b))和对比例1(图1(a))中采用pam-101双波长检测单元ed-p700dw(810～870nm)进行的p700氧化还原动力学测定结果。
22.图2为实施例2(图2(b))和对比例2(图2(a))中采用双通道调制叶绿素荧光仪利用饱和脉冲法进行p700氧化还原动力学测定结果。
23.图3为实施例3(图3(b))和对比例3(图3(a))中采用led激发-探测光谱仪进行p700氧化还原动力学测定结果。
24.图4为对比例4中水系微孔滤膜(图4(a))、有机尼龙滤膜(图4(b))和玻璃纤维滤膜(图4(c))分别采用pam-101双波长检测单元ed-p700dw(810～870nm)进行p700氧化还原动力学测定结果。
25.图5为对比例4中水系微孔滤膜(图5(a))、有机尼龙滤膜(图5(b))和玻璃纤维滤膜(图5(c))分别采用双通道调制叶绿素荧光仪利用饱和脉冲法进行p700氧化还原动力学测定结果。
26.图6为对比例4中水系微孔滤膜(图6(a))、有机尼龙滤膜(图6(b))和玻璃纤维滤膜(图6(c))分别采用led激发-探测光谱仪进行p700氧化还原动力学测定结果。
27.图7为藻液过滤到水系微孔滤膜(图7(a))、有机尼龙滤膜(图7(a))和玻璃纤维滤膜(图7(a))后的照片。分别如图7(a)、图7(b)和图7(c)所示。
具体实施方式
28.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
29.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
30.实施例1、
31.取对数生长期的绿藻-莱茵衣藻(直径5μm)，浓度定为25μg/ml，然后取10ml衣藻悬浮液通过真空泵(约70pa，5min)滤到白色微孔滤膜(水系混合纤维素，孔径0.22μm)上，等稍干后，暗适应10分钟。将载有绿藻的微孔膜(1cm
×
1cm)放入有镜面的比色杯内，使用pam-101双波长检测单元ed-p700dw(810-870nm)(walz,germany)进行p700氧化还原动力学测定。630nm的活化光(约80μmolm-2
s-1
，持续30秒)，可将一小部分p700氧化，该活化光开关引起p700在820nm处光吸收的变化即δa。之后720nm的活化光(约20μmolm-2
s-1
，持续30秒)会再次诱导p700的氧化。在照光期间施加饱和脉冲(约3000μmolm-2
s-1
，持续800毫秒)，p700在820nm处的光吸收瞬间达到峰值，p700被完全氧化，随后饱和脉冲诱导产生的大量电子会使p700

瞬间还原，达到完全还原状态。饱和脉冲开关引起p700在820nm处的光吸收的变化即δamax。根据公式(δamax-δa)/δamax可以估算psi的光化学量子产量y(i)。
32.对比例1、
33.直接测定绿藻-莱茵衣藻的悬浮液，测定方法同实施例1。
34.图1(a)和图1(b)分别为藻液(对比例1)和藻液经微孔滤膜过滤后(实施例1)，采用pam-101双波长检测单元ed-p700dw(810～870nm)进行p700氧化还原动力学测定的结果，对比两个图可以看出，采用藻液直接检测时，p700检测信号非常小，而且信号持续时间很短，而藻液经微孔滤膜过滤后进行检测时，p700检测信号和持续时间均明显提高。
35.实施例2、
36.取对数生长期的绿藻-莱茵衣藻(直径5μm)，浓度定为25μg/ml，然后取10ml衣藻悬浮液通过真空泵(约70pa，5min)过滤到白色微孔滤膜(水系混合纤维素，孔径0.22μm)上，等稍干后，暗适应10分钟。将载有绿藻的微孔膜(直径50mm)放置在叶室内，采用双通道调制叶绿素荧光仪采用饱和脉冲法，进行p700氧化还原动力学测定(dual-pam-100,walz,德国)。测量开始时打开测量光(830～875nm)，基线平稳后，打开远红光，p700逐渐形成稳定的p700

库，远红光(约20μmolm-2
s-1
)持续10秒后关闭，同时打开非常强(10000μmolm-2
s-1
，持续时间200毫秒)的饱和脉冲，p700达到完全氧化状态(p
m
)。饱和脉冲关闭后，p700的光吸收迅速下降并达到平稳，此时p700处于完全还原状态(p
o
)。40秒后，打开630nm的活化光(约80μmolm-2
s-1
)，一部分p700开始被氧化，活化光打开1秒后再打开强饱和脉冲,有活性的、开放的psi反应中心被完全氧化(p
m’)，之后每隔20秒打开强饱和脉冲(饱和脉冲的间隔时间可根据样品、饱和脉冲的光强等调整)，直至p
m’达到稳定。根据p
o
、p、p
m’和p
m
计算psi的能量转化：y(i)＝(pm
’-
p)/pm,y(nd)＝(p-po)/pm,y(na)＝(pm-pm’)/pm。
37.对比例2、
38.直接测定绿藻-莱茵衣藻的悬浮液，测定方法同实施例2。
39.图2(a)和图2(b)分别为藻液(对比例2)和藻液经微孔滤膜过滤后(实施例2)，采用
双通道调制叶绿素荧光仪利用饱和脉冲法进行p700氧化还原动力学测定的结果，对比两个图可以看出，采用藻液直接检测时，p700检测信号非常小，信号飘移严重，而藻液经微孔滤膜过滤后进行检测时，p700检测信号明显提高且减少了信号飘移。
40.实施例3、
41.取对数生长期的绿藻-莱茵衣藻(直径5μm)，浓度定为25μg/ml，然后取10ml衣藻悬浮液通过真空泵(约70pa，5min)过滤到白色微孔滤膜(水系混合纤维素，孔径0.22μm)上，等稍干后，暗适应10分钟。将载有绿藻的微孔膜(直径50mm)放置在叶室内，利用led激发-探测光谱仪进行p700氧化还原动力学测定(jts-10,法国)。测量开始时打开测量光(705nm)，基线平稳后，打开远红光(约2500μmolm-2
s-1
)，p700逐渐形成稳定的p700

库，远红光持续10秒后关闭。远红光关闭后，p700的光吸收迅速下降并达到平稳。根据该曲线可以判断p700的氧化速率、p700

的再还原速率、稳态p700

的量。
42.对比例3、
43.直接测定绿藻-莱茵衣藻的悬浮液，测定方法同实施例3。
44.图3(a)和图3(b)分别为藻液(对比例3)和藻液经微孔滤膜过滤后(实施例3)，采用led激发-探测光谱仪进行p700氧化还原动力学测定的结果，对比两个图可以看出，采用藻液直接检测时，p700检测信号非常小，p700

约800，而藻液经微孔滤膜过滤后进行检测时，p700检测信号明显增加，p700

约5000，检测信号增加了6倍。
45.对比例4、水系微孔滤膜、有机尼龙滤膜和玻璃纤维滤膜的对照验
46.将藻液过滤到水系微孔滤膜、有机尼龙滤膜和玻璃纤维滤膜后的照片分别如图7(a)、图7(b)和图7(c)所示。
47.测定方法同实施例1。
48.水系微孔滤膜、有机尼龙滤膜和玻璃纤维滤膜分别采用pam-101双波长检测单元ed-p700dw(810～870nm)进行p700氧化还原动力学测定，p700

信号逐渐降低，约52、45、32，分别如图4(a)、图4(b)和图4(c)所示。
49.测定方法同实施例2。
50.水系微孔滤膜、有机尼龙滤膜和玻璃纤维滤膜分别采用饱和脉冲法进行p700氧化还原动力学测定，结果分别如图5(a)、图5(b)和图5(c)所示。可以看出，水系微孔滤膜p700检测信号明显提高且减少了信号飘移，有机尼龙滤膜和玻璃纤维滤膜p700检测信号偏小，信号飘移严重。
51.测定方法同实施例3。
52.水系微孔滤膜、有机尼龙滤膜和玻璃纤维滤膜分别采用led激发-探测光谱仪进行p700氧化还原动力学测定，结果分别如图6(a)、图6(b)和图6(c)所示。虽然三种滤膜检测的p700

比较接近，但是水系微孔滤膜的检测结果最好，表现在p700氧化过程非常流畅，且能达到相对稳定的最大p700

状态；有机尼龙滤膜达到了一个瞬间的最大p700

状态，但是持续时间非常短，玻璃纤维滤膜在p700氧化过程中受阻，氧化过程不顺畅。
53.由上述对比可以看出，将藻类悬浮液固定在微孔滤膜上，可以显著提高藻类p700的检测信号，而且相较于其他材质的微孔滤膜如有机尼龙滤膜和玻璃纤维滤膜，水系微孔滤膜的效果更优。