一种强化微生物降解多环芳烃的方法及微生物菌剂与流程

1.本发明涉及一种强化微生物降解多环芳烃的方法，属于环境污染生物处理技术领域，主要用于废水、土壤等多环芳烃污染环境的修复处理。


背景技术：

2.多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,pahs)是土壤、沉积物、水和大气环境中广泛检出的污染物，主要来源于人类活动，包括化石燃料不完全燃烧、工业排放、汽车尾气等。环境中的多环芳烃污染具有致癌、致畸和诱变作用，对人类健康构成潜在风险。多环芳烃污染修复是有利于人体健康和生态系统可持续发展的重要环境问题。
3.微生物修复是一种成本低、效益好和环境友好的修复方法。但是直接向污染土壤等环境中投加降解菌的修复方法，降解菌活性低，降解效果不理想。
4.中国专利申请公开号为cn104492804a的现有技术公开了臭氧预处理强化微生物降解修复污染土壤的系统及方法，针对多环芳烃污染土壤，首先采用臭氧预处理，再向反应容器中添加生物表面活性剂和液态培养基、进行联合降解和定期取样测定直至修复完成。其采用臭氧预处理和生物表面活性剂增溶技术来强化微生物降解联合技术，克服了单一技术的局限性，且操作简便，成本低廉，运行周期短，去除效果好，多环芳烃的去除率达93％以上，且不产生二次污染，大大削弱了多环芳烃污染土壤对人体和环境的危害，为土壤修复提供了新的思路。充分利用了臭氧预处理、生物表面活性剂增溶强化以及土著微生物自身降解作用的相联合，使得各种技术互为补充，臭氧预处理使得后端生物降解的修复效果得以提高，多环芳烃的去除率达93％以上，同时也缩短了修复周期。该方法对多环芳烃污染土壤进行臭氧预处理的步骤在实验室中容易实现，但其难以适用于直接针对大面积受污染的土体的原位处理。


技术实现要素：

5.1.要解决的问题
6.针对现有技术中微生物降解多环芳烃的效率有限的技术问题，本发明提供一种强化微生物降解多环芳烃的方法，通过利用阳离子改性蒙脱土调节微生物关键酶活性以及矿物
‑
微生物界面生物电化学过程，从而增强微生物生长代谢等生命活动，进而提高污染物的降解率。
7.2.技术方案
8.一种强化微生物降解多环芳烃的方法，包括将微生物接种于阳离子改性蒙脱土的步骤；所述微生物包括mycobacterium sp.njs
‑
1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号cgmcc 1.10964。本发明通过利用阳离子改性蒙脱土调节微生物提供微生物生长介质，表面阳离子影响关键酶活性以及矿物
‑
微生物界面生物电化学过程，从而增强微生物生长代谢等生命活动，进而调高污染物的降解率。
9.优选地，所述阳离子改性蒙脱土包括fe(iii)改性蒙脱土、co(ii)改性蒙脱土、na
(i)改性蒙脱土中的一种或多种，特别优选fe(iii)改性蒙脱土。
10.优选地，所述多环芳烃包括芘、苯并[a]芘、菲、荧蒽、蒽中的一种或多种。
[0011]
优选地，具体包括以下步骤：
[0012]
s1采用灭菌营养肉汤培养基培养扩繁mycobacterium sp.njs
‑
1菌，随后用灭菌ph7.0磷酸盐缓冲液清洗菌液并调节细菌数量或细菌密度达到特定值；
[0013]
s2向阳离子改性蒙脱土中加入灭菌无机盐培养基，随后接种步骤s1所述mycobacterium sp.njs
‑
1菌；
[0014]
s3将接种菌后的阳离子改性蒙脱土与含有多环芳烃的污染物在适当条件下混合培养，降解多环芳烃；
[0015]
或
[0016]
s1采用阳离子改性蒙脱土吸附固定含有多环芳烃的污染物；
[0017]
s2采用灭菌营养肉汤培养基培养扩繁mycobacterium sp.njs
‑
1菌，随后用灭菌ph7.0磷酸盐缓冲液清洗菌液并调节细菌数量或细菌密度达到特定值；
[0018]
s3向吸附有污染物的阳离子改性蒙脱土中加入灭菌无机盐培养基，随后接种步骤s2所述mycobacterium sp.njs
‑
1菌在适宜条件下混合培养，降解多环芳烃。
[0019]
优选地，通过离子交换法制备阳离子饱和改性蒙脱土；选取蒙脱土k10，研磨过筛，所述过筛的筛孔大小为不小于200目。
[0020]
优选地，所述阳离子改性蒙脱土通过离子交换法制备，具体包括：
[0021]
a)蒙脱土与金属阳离子的氯化物溶液固液比为1:20；
[0022]
b)金属阳离子当量浓度为0.1n；
[0023]
c)采用离子交换法，交换次数不小于2次；
[0024]
d)每次交换震荡平衡时间不小于2h；
[0025]
e)交换完成后，用超纯水清洗4次以上直至无cl
‑
。
[0026]
优选地，所述降解菌为mycobacterium sp.njs
‑
1，分离自多环芳烃污染农田，能够以芘为唯一碳源生长，并能降解苯并[a]芘、菲、荧蒽、蒽等。
[0027]
优选地，所述降解菌mycobacterium sp.njs
‑
1扩繁条件包括：好氧培养，在灭菌营养肉汤培养基中接种适量菌液，在28℃和160rpm避光条件下培养过夜；用灭菌ph7.0 0.1m磷酸盐缓冲液清洗两次，调整菌密度为od600＝0.30。
[0028]
优选地，所述步骤s2或s3降解体系改性蒙脱土与无机盐培养基固液质量比为1:(20～100)，mycobacterium sp.njs
‑
1菌株接种稀释后od600不小于0.03。
[0029]
优选地，相对于未添加铁离子改性蒙脱土的原始菌密度，铁离子改性蒙脱土使mycobacterium sp.njs
‑
1菌种的菌密度在1～3d内提高3倍以上。
[0030]
一种微生物菌剂，包括mycobacterium sp.njs
‑
1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号cgmcc 1.10964；还包括铁离子改性蒙脱土。阳离子改性蒙脱土能够显著促进降解菌mycobacterium sp.njs
‑
1生长，提高关键酶活性以及生物电化学活性。
[0031]
优选地，所述铁离子改性蒙脱土中铁离子的交换率在50％～100％范围内。
[0032]
3.有益效果
[0033]
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
[0034]
(1)蒙脱土特有的高比表面积及孔隙结构能影响微生物的分布、调节微生物活性，
并缓解不利环境(重金属、有机污染物等)对微生物造成的胁迫压力；蒙脱土与微生物的相互作用可以获得更好的生存竞争力和更有效的微生物活性，从而在一定程度上强化对目标污染物的生物修复作用；阳离子改性蒙脱土具有亲水特征，具有较强的“离子
‑
π键”交互作用，有利于微生物和污染物的附着和分布；本发明通过利用阳离子改性蒙脱土调节微生物关键酶活性以及矿物
‑
微生物界面生物电化学过程，基于蒙脱土、微生物及多环芳烃的相互作用，利用蒙脱土表面固定的阳离子调节矿物电化学特性，促进微生物在矿物表面生长形成生物膜，提高微生物
‑
矿物
‑
污染物间的生物电化学过程，达到强化微生物降解多环芳烃的目的；
[0035]
(2)本发明的铁离子改性蒙脱土用于强化微生物降解多环芳烃具有突出的效果，这可能是由于fe是一些氧化还原蛋白的辅基，通过自身价态变化来调控酶活性以及传递电子，同时可以作为胞外电子受体，在微生物
‑
矿物界面生物电化学过程中发挥重要作用；从菌密度的增长可以得知铁离子改性蒙脱土对微生物具有较强亲和力，能够促进微生物生长；从过氧化物酶活性、双加氧酶活性及电子传递活性结果可以得知，铁离子改性蒙脱土能够有效强化微生物氧化还原酶和生物电化学活性；
[0036]
(3)本发明的铁离子改性蒙脱土和微生物共培养后，制作成微生物菌剂，操作简单，不产生二次污染，铁离子改性蒙脱土对微生物生物化学过程具有显著的促进作用，菌剂可应用于土壤和污水等环境原位生物修复。
附图说明
[0037]
图1为本发明实施例1中不同阳离子改性蒙脱土存在下接种微生物( )和不接种微生物(
‑
)条件下降解芘的动力学曲线(芘初始浓度15mg/l)，mt为未改性蒙脱土在接种菌条件下的处理；
[0038]
图2为本发明实施例1中不同阳离子改性蒙脱土存在下培养不同时间后微生物对芘的降解率(芘初始浓度100mg/l)，其中blank为未接种菌且不加蒙脱土的处理，mt为未改性蒙脱土且未接种菌的处理；
[0039]
图3为本发明实施例2中不同阳离子改性蒙脱土存在下芘降解过程中：a：菌密度变化；b：过氧化物酶活性变化；c：双加氧酶活性变化；d：菌密度与芘降解率的关系；e：过氧化物酶活性与芘降解率的关系；f：双加氧酶活性与芘降解率的关系；
[0040]
图4为本发明实施例2中不同阳离子改性蒙脱土存在下芘降解过程中微生物电化学活性(a:电子传递活性及b：电子传递容量)变化及其与芘降解的关系。
具体实施方式
[0041]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0042]
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0043]
浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数
值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。
[0044]
以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
[0045]
作为举例，以下实施例中采用芘和分枝杆菌mycobacterium sp.njs
‑
1进行实验。所述菌株是以芘为唯一碳源的降解菌，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，为革兰氏阳性菌。
[0046]
实施例1
[0047]
一、阳离子改性蒙脱土的制备
[0048]
阳离子改性蒙脱土制备过程，包括以下步骤，具体为：
[0049]
(1)蒙脱土的前处理
[0050]
将蒙脱土研磨，过200目尼龙筛。
[0051]
(2)离子交换法制备阳离子改性蒙脱土
[0052]
称取3.0g蒙脱土置于一系列100ml离心管中，分别加入60ml超纯水超声分散清洗两次，随后加入60ml当量浓度为0.1n nacl,cucl2，cocl2，nicl2，fecl3，加盖后于25℃，160rpm震荡平衡2h，然后4000rpm离心10min，弃去上清液，分别再次加入60ml 0.1n上述金属阳离子溶液，在25℃，160rpm震荡平衡2h，以达到蒙脱土完全被阳离子饱和的目的。样品离心后弃去上清液，加入60ml超纯水震荡清洗5min，然后4000rpm离心10min，弃去上清液，相同方法再重复清洗3次，以洗去弱结合态阳离子和cl
‑
离子。样品60℃烘干，研磨过200目尼龙筛，制得不同阳离子饱和改性蒙脱土，储存于玻璃试剂瓶备用。改性蒙脱土中阳离子含量及交换率如表1所示。
[0053]
表1改性蒙脱土金属阳离子含量(mg/kg)及交换率
[0054][0055]
二、多环芳烃污染阳离子改性蒙脱土
[0056]
使多环芳烃与阳离子改性蒙脱土混合，包括以下步骤，具体为：
[0057]
称取0.2g第一项中阳离子改性蒙脱土于50ml玻璃离心管，加入0.4ml丙酮配置的芘溶液(浓度为500mg/l或5000mg/l)，轻轻摇匀，然后静置与通风橱中，待丙酮完全挥发，制
得芘含量为1mg/g或10mg/g的污染蒙脱土。
[0058]
三、降解菌的培养扩繁
[0059]
降解菌的活化和扩繁，降解菌为mycobacterium sp.njs
‑
1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号cgmcc 1.10964。该菌分离筛选自多环芳烃污染农田，能够以芘为唯一碳源和能源生长。活化和扩繁包括如下步骤，具体为：
[0060]
将保存于
‑
80℃甘油中的降解菌解冻，接种于灭菌的营养肉汤培养基中，接种比例为每100ml培养基接种0.2ml保藏液，随后于28℃，160rpm好氧避光培养过夜，待菌株生长至对数期，取出，转移至灭菌离心管中5000rpm离心收集下层菌体，然后采用灭菌磷酸盐缓冲液(ph7.0)清液2次，重新悬浮后调节细菌密度使得od600＝0.30,细菌数量约为1.6
×
108cfu/ml。
[0061]
四、阳离子改性蒙脱土表面芘的微生物降解实验
[0062]
阳离子改性蒙脱土表面芘的微生物降解，包括如下步骤，具体为：
[0063]
在50ml玻璃离心管中向第二项所得芘污染的改性蒙脱土中加入灭菌无机盐培养基，随后接种第三项中降解菌，接种后使细菌密度od600不小于0.03。降解体系中改性蒙脱土与无机盐培养基溶液质量比为1:50(1:20～1:100均可)。然后置于28℃，160rpm恒温摇床避光培养。培养不同时间后采用有机溶剂提取，高效液相色谱(hplc)法测定提取液中剩余芘的含量，绘制降解动力学曲线(图1)，并计算芘降解率。如表2所示，零级动力学和一级动力学均能较好表征芘降解规律。芘(c0＝15mg/l)在5天内降解率达到95％以上，fe(iii)改性蒙脱土处理效果最优，在3天后降解率达到93.6％，其次为na(i)和co(ii)改性蒙脱土的处理，5天后降解率均高于95％。如图2，当芘浓度增大到100mg/l时，fe(iii)、co(ii)、na(i)改性蒙脱土的处理在16天内降解率达到95％以上，而不加蒙脱土的处理降解率仅有不到60％。以上结果说明阳离子改性的蒙脱土(特别是fe(iii)改性蒙脱土)处理能够显著强化芘的微生物(mycobacterium sp.njs
‑
1)降解效果。但某些对微生物生长和代谢不利的阳离子如cu(ii)、ni(ii)等阳离子改性蒙脱土会抑制该降解菌对芘的降解。
[0064]
表2阳离子改性蒙脱土表面芘微生物降解动力学参数(c0＝15mg/l)
[0065][0066]
实施例2
[0067]
(一)阳离子改性蒙脱土促进微生物生长的研究
[0068]
阳离子改性蒙脱土促进微生物生长的研究，包括如下步骤，具体为：
[0069]
采用实施例1的方法构建微生物
‑
矿物(mycobacterium sp.njs
‑1‑
阳离子改性蒙脱土)降解芘(c0＝15mg/l)的培养体系，在培养第1天和第3天分析微生物生长状况，采用方法为平板计数法，具体过程为：吸取0.1ml培养液于9ml无菌水中，摇匀，通过逐级稀释法稀
释样品，稀释至104和105倍，分别吸取0.1ml稀释后的样品接种到无菌营养肉汤固体培养基上，涂布均匀后的培养皿倒置于28℃培养箱中培养48h，然后对形成的菌落进行计数，获得细菌生长密度变化。结果如下(图3a)：培养1天和3天后，相对于未添加铁离子改性蒙脱土的原始菌密度，阳离子改性蒙脱土的处理cfu较接种时分别增长了3～4倍和8～10倍，且与芘降解率密切相关(图3d)，表明阳离子改性蒙脱土促进了降解菌的生长，其中fe(iii)改性蒙脱土的强化处理效果最好。
[0070]
(二)阳离子改性蒙脱土强化微生物降解酶活性的研究
[0071]
阳离子改性蒙脱土强化微生物降解酶活性的研究，包括如下步骤，具体为：
[0072]
采用实施例1的方法构建微生物
‑
矿物(mycobacterium sp.njs
‑1‑
阳离子改性蒙脱土)降解芘(c0＝15mg/l)的培养体系，在培养第1、3、5天测定双加氧酶活性和电子传递活性及容量，具体方法如下：
[0073]
(1)过氧化物酶活性：具体过程为：吸取0.2ml样品液，加入2ml含有5mm的二羟基苯丙氨酸(l
‑
dopa,ph 7.0pbs缓冲液配制)和0.1％h2o2，在28℃下培养1.5小时后，用分光光度法在460nm波长下检测产物的生成量(ε
460
＝37000m
‑1cm
‑1)。结果显示(图3b)：不同阳离子改性蒙脱土的处理过氧化物酶活性随芘降解呈现不同的变化规律，fe(iii)改性蒙脱土的处理过氧化物酶活性始终处于较高的水平。
[0074]
(2)双加氧酶活性(儿茶酚2,3双加氧酶catechol 2,3
‑
dioxygenase，c23o)：具体过程为：吸取0.2ml样品液，加入1ml含有0.5mm的儿茶酚(pbs缓冲液配制，ph 7.0)在28℃下培养4小时后，用分光光度法在375nm波长下检测产物的生成量(ε
375
＝36000m
‑1cm
‑1)。结果显示(图3c)：随着芘的逐渐降解，双加氧酶活性升高，降解第5天酶活性达到最大。其中fe(iii)和na(i)改性蒙脱土的处理双加氧酶活性最大。
[0075]
通过相关分析可以发现芘降解过程中细菌过氧化物酶活性与芘降解率(图3e)，以及双加氧酶活性与芘降解率(图3f)具有显著的相关关系，表明提高关键酶活性是阳离子改性蒙脱土增强芘降解的一个主要途径。
[0076]
(三)阳离子改性蒙脱土强化微生物生物电化学活性研究
[0077]
阳离子改性蒙脱土强化微生物生物电化学活性研究，包括如下步骤，具体为：
[0078]
采用实施例1的方法构建微生物
‑
矿物(mycobacterium sp.njs
‑1‑
阳离子改性蒙脱土)降解芘(c0＝15mg/l)的培养体系，在培养第1、3、5天测定双加氧酶活性和电子传递活性及容量，具体方法如下：
[0079]
(1)电子传递活性(electrontransportsystemactivity，etsa)：吸取0.5ml样品液，加入0.5ml pbs缓冲液(ph 7.0)和0.5ml碘硝基四唑紫(int，0.1％)，30℃避光培养。培养结束后加入5ml甲醇终止反应，提取产物甲臜(intf)，然后采用分光度计在490nm处测定产物吸光度，根据标准曲线计算产物intf。电子传递活性以单位时间内生成的intf来表示。结果显示(图4a)，na(i)改性蒙脱土处理电子传递活性随芘降解而增加，而fe(iii)改性蒙脱土处理有下降趋势，总的来说fe(iii)改性蒙脱土的处理电子传递活性高于na(i)改性蒙脱土，这可能是由于fe是一些氧化还原蛋白的辅基，通过自身价态变化来调控酶活性以及传递电子，同时可以作为胞外电子受体，在微生物
‑
矿物界面生物电化学过程中发挥重要作用，因此，铁离子改性蒙脱土界面芘降解速度更快。
[0080]
(2)电子传递容量：采用电化学工作站，记录样品电流时间(i
‑
t)曲线，测量样品供
电子能力(edc)。具体过程如下：向电解池中加入9mlpbs缓冲液(ph 7)和0.1m的kcl，平衡所需的氧化还原电位至0.61v，随后加入0.1ml的电子转移介质abts(10mm)出现氧化峰电流，再次达到恒定的背景电流后，向电解池中加入0.1ml样品液，出现样品氧化峰电流。通过如下公式计算样品电子供给能力：
[0081][0082]
其中v为样品体积，iox为基线校正后的氧化电流，f为法拉第常数(f＝96485c mol
‑1)，edc单位为μmol e
‑
ml
‑1。结果显示(图4b)：阳离子改性蒙脱土
‑
微生物降解系统具有较高电子供给能力，随芘降解先升高后降低，fe(iii)改性蒙脱土的处理电子供给能力初期稍高于na(i)改性蒙脱土，但在后期则相反。结果说明随着芘降解，降解系统供电子能力先增加后减小。结合以上结果可以得知，阳离子改性蒙脱土通过调控降解酶活性和生物电化学活性强化芘降解。
[0083]
以上结果表明fe(iii)、co(ii)、na(i)等金属阳离子改性蒙脱土能够通过促进微生物生长和关键酶代谢活性，促进矿物
‑
微生物间的电子传递等生物电化学过程，进而强化对多环芳烃(芘)的降解，其中以fe(iii)改性蒙脱土的强化效果最好，在土壤污染修复中具有较好的应用潜力。
[0084]
在一些实施例中，阳离子改性蒙脱土强化微生物降解作用采用如下的方法来实现：
[0085]
s1采用灭菌营养肉汤培养基培养扩繁mycobacterium sp.njs
‑
1菌至细菌数量或细菌密度达到特定值；s2向阳离子改性蒙脱土中加入灭菌无机盐培养基，随后接种步骤s1的mycobacterium sp.njs
‑
1菌；s3将接种菌后的阳离子改性蒙脱土加入含有多环芳烃的污染溶液进行混合培养，降解多环芳烃，例如芘，相对于单独的mycobacterium sp.njs
‑
1菌直接用于降解芘，具有更高的降解率；且相对于未改性的蒙脱土与mycobacterium sp.njs
‑
1菌混合后降解芘，具有更高的降解率。
[0086]
在一些实施例中，采用不同批次制备的铁离子改性蒙脱土来强化微生物降解作用，其中铁离子的交换率在50～100％范围内，相对于单独的mycobacterium sp.njs
‑
1菌直接用于降解芘，具有更高的降解率；且相对于未改性的蒙脱土与mycobacterium sp.njs
‑
1菌混合后降解芘，具有更高的降解率。
[0087]
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。