具有抗真菌和清除自由基活性的环色-缬-丝-异亮-亮肽及制备方法与流程

技术特征：
1.具有抗真菌和清除自由基活性的环色
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缬
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丝
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异亮
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亮肽，其特征在于：所述环色
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缬
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丝
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异亮
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亮肽的结构式如下：所述环色
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缬
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丝
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异亮
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亮肽为白色粉末状，是由色氨酸、缬氨酸、丝氨酸、异亮氨酸和亮氨酸，以酰胺键连接而成的十五元环状五肽；所述环色
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缬
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丝
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异亮
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亮肽具有清除自由基活性和抗白色链珠菌活性；对二苯基苦基苯肼自由基dpph的半数清除浓度dc
50
为1.32mg/ml，在200 μg /ml的浓度下对白色链珠菌的抑菌圈直径为13.25mm。2.根据权利要求1所述具有抗真菌和清除自由基活性的环色
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缬
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丝
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异亮
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亮肽的制备方法，其特征在于操作步骤如下：（1）菌种培养将蛙粪霉（basidiobolussp.）经过一级斜面菌种培养、二级液体种子培养、三级液体种子培养和四级培养，得到液体的最终发酵物或固体的最终发酵物；（2）最终发酵物中有效成分的提取和精制用甲醇或乙醇提取最终发酵物中的有效成分，采用反相色谱方法纯化，得到白色粉末状的环色
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缬
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丝
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异亮
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亮肽。3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于：所述步骤（1）的具体操作如下：（1.1）一级斜面种子培养将蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂pda斜面培养基，每支试管接种1～3接种环原始菌种，于25～36℃恒温、培养4～8d，得到一级菌种；（1.2）二级液体种子培养将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；在大于等于100 ml三角瓶中加入30～50%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1～3支斜面菌种，在全温振荡培养箱中，温度25～36℃、转速150～250 rpm条件下，培养3～7d，即得到二级菌种；液体摇瓶培养基由葡萄糖25.0～50.0 g/l、麦芽提取物10.0～30.0 g/l、蛋白胨2.0～6.0 g/l、酵母浸出粉1.0～4.0 g/l、氯化钾0.3～2.0 g/l、七水硫酸镁0.3～2.0 g/l、磷酸二氢钾0.3～2.0 g/l和水混合均匀制成；
（1.3）三级液体种子培养将二级菌种接种到大于等于5l的发酵罐，装液量为罐体积的50～80%，接种量3～10%；在通气量按体积比1l:1～2l、压力0.1～0.2mp、25～36℃条件下，恒温通气培养2～5天，得到三级菌种；发酵罐中的培养基同步骤（1.2）中的液体培养基；（1.4）四级培养四级培养为液体培养，将三级菌种接种到大于等于50l的发酵罐，装液量为罐体积的50～80%，接种量3～10%；在通气量按体积比1l:1～2l、压力0.1～0.2mp、温度25～36℃条件下，恒温通气培养5～15天，得到液体的最终发酵物；发酵罐中的培养基与步骤（1.2）中的液体培养基相同。4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于：所述蛙粪霉（basidiobolussp.）为蛙生蛙粪霉、固孢蛙粪霉或裂孢蛙粪霉中的一种。5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：所述步骤（1.4）中，四级培养为固体培养，将三级菌种拌入固体培养基中，接种量为固体料量的3～10%，25～36℃恒温培养5～15天，得到固体的最终发酵物；所述固体培养基由葡萄糖25.0～50.0 g/l、麦芽提取物10.0～30.0 g/l、蛋白胨2.0～6.0 g/l、酵母浸出粉1.0～4.0 g/l、氯化钾0.3～2.0 g/l、七水硫酸镁0.3～2.0 g/l、磷酸二氢钾0.3～2.0 g/l、琼脂15.0～30.0 g/l和水混合均匀制成。6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）的具体操作如下：（2.1）最终发酵物的预处理将液体的最终发酵物经0.20～1.0μm滤膜过滤或2000
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12000转/分钟条件下离心分离，得到菌丝体；将菌丝体冷冻干燥，粉碎，过20～120目筛，得到预处理物；（2.2）预处理物中有效成分的提取和分离纯化（2.2.1）提取将预处理物用甲醇或乙醇提取；料液比为1kg:2～20l、超声波功率10～100khz，提取时间为10～200分钟；在转速大于等于2000转/分钟条件下离心，或0.20～1.0μm滤膜过滤；取滤液或离心上清，在温度小于等于100℃浓缩到原体积的1/2～1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收甲醇或乙醇；（2.2.2）分离纯化采用反相色谱方法纯化浓缩脱醇液，固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即rpc18；用甲醇和水按0～100：100～0配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为676的色谱流份；将所述色谱流份在小于等于100℃温度条件下浓缩到粘稠状，在低于170℃条件下干燥；得到白色粉末状的环色
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缬
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丝
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异亮
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亮肽。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2.1）中，将固体的最终发酵物在30～130℃干燥到含水率小于等于20%，粉碎，过20～120目筛，得到预处理物。8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2.2.2）中，所述反相碳十八填料即rpc18的颗粒直径为3～50微米。

技术总结
本发明涉及具有抗真菌和清除自由基活性的环色


技术研发人员：何亚琼
受保护的技术使用者：皖北卫生职业学院
技术研发日：2021.09.09
技术公布日：2021/11/2