新型混合基质在MALDI-MS细菌鉴定中的应用的制作方法

新型混合基质在maldi
‑
ms细菌鉴定中的应用
技术领域
1.本发明属于细菌鉴定技术领域，尤其涉及新型混合基质在maldi
‑
ms细菌鉴定中的应用。


背景技术：

2.基质辅助激光解析离子化质谱（maldi
‑
ms）目前已经被广泛应用于蛋白质组学，代谢组学以及临床中的微生物分析。它是一种快速，灵敏，高通量的分析方法。它的原理是通过特殊有机小分子化合物作为基质吸收激光能量，进行质子化传递，进而使分析物离子化，从而达到检测目的。
3.传统基质检测细菌得到的大多是亲水性蛋白质的指纹谱图，这就导致在传统maldi检测中，无法区分相似细菌。但是许多相似细菌虽然前期临床表现相似但在疾病后期对感染者造成的后果有较大差异，对其进行准确的区分，在临床治疗上是有十分重要的现实意义的。例如大肠埃希菌和志贺氏菌。大肠埃希菌和志贺氏菌在临床上都是常见的细菌，二者在临床上的早期表现都为腹痛、腹泻和发热，但是与大肠埃希菌相比，志贺氏菌可引起更严重的痢疾疾病，严重者甚至会危及生命。
4.现有maldi
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ms检测细菌使用的基质是α
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氰基
‑4‑
羟基肉桂酸 (chca)，但是由于chca对亲水性蛋白质有良好的检测效果，但对于疏水性蛋白质的检测有一定的限制，所以使用传统基质对细菌检测时得到的指纹谱图不够全面，因此现有maldi
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ms检测细菌很难对相似细菌进行区分。


技术实现要素：

5.本发明实施例的目的在于提供新型混合基质在maldi
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ms细菌鉴定中的应用，旨在解决传统基质对细菌检测时得到的指纹谱图不够全面和无法区分相似细菌的问题。
6.本发明实施例是这样实现的，新型混合基质在maldi
‑
ms细菌鉴定中的应用，步骤如下：步骤一：在固体培养基上培养待测细菌24h；步骤二：将chca和chca
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c3分别溶于50%乙腈含2.5%三氟乙酸溶液中配制chca和chca
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c3基质液，保存于4℃的冰箱中以备用；步骤三：分别取chca基质液和chca
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c3基质液以体积比1:2均匀混合；步骤四：取步骤一培养得到的细菌均匀涂在maldi
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ms配套的靶板上；步骤五：步骤四靶板上的细菌风干后，将步骤三得到的混合基质溶液点在干后的细菌上；步骤六：将步骤四中滴加混合基质溶液的细菌在室温下自然风干；步骤七：待当步骤六中的溶剂挥发结晶后直接进行maldi分析。
7.进一步的技术方案，所述步骤二中所述基质溶液浓度为10
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15mg/ml。
8.进一步的技术方案，所述步骤四中混合基质的体积为0.5
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1μl。
9.进一步的技术方案，所述步骤七数据在线性正离子模式下采集用于获得待测细菌的质谱图。
10.进一步的技术方案，所述步骤七中使用的基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱仪型号为autoflex speed tof/tof，激光波长为355nm的nd:yag激光器。
11.进一步的技术方案，所述基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱仪测试时的加速电压为20.000kv，延迟引出电压为18.000kv，延迟引出时间为150ns。
12.进一步的技术方案，所述基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱仪测试时的反射器电压为20.000kv，透镜电压为6.000kv，频率为500hz。
13.本发明实施例提供的新型混合基质在maldi
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ms细菌鉴定中的应用，这种新型maldi混合基质可以同时检测到亲水性蛋白质和疏水性蛋白质，从而扩大了分析物的质谱峰数量，使其能够更准确的鉴定细菌，实现了细菌的快速，高灵敏的区分鉴定；这种混合基质可以同时检测到多种亲水蛋白质和疏水蛋白质的质谱峰，从而提高了使用maldi
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ms区分细菌的准确性，使其能够区分大肠埃希菌和志贺氏菌等相似的细菌。使得临床给药更加精准。
附图说明
14.图1为chca和chca
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c3的结构式；图2为chca和chca
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c3分别作为基质检测大肠埃希菌质谱图；图3为优化混合基质体积比的最优条件maldi质谱图；图4为混合基质检测待测细菌的质谱图，图4中a为阴沟肠杆菌图进行maldi检测得到的谱图，图4 中b为铜绿假单胞菌进行maldi检测得到的谱图；图5为混合基质分别检测大肠埃希菌和志贺氏菌的质谱图。
具体实施方式
15.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
16.以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
17.对比例一步骤一：在固体培养基上培养大肠埃希菌24h；步骤二：将chca溶于50%乙腈含2.5%三氟乙酸溶液中配制浓度为10
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15mg/ml的chca基质液，保存于4℃的冰箱中以备用；步骤三：取步骤一中培养得到的大肠埃希菌均匀涂在maldi
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ms配套的靶板上；步骤四：待步骤三靶板上的大肠埃希菌风干后，将步骤二得到的chca基质液取0.5
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1μl点在干后的大肠埃希菌上；步骤五：将步骤四中滴加chca基质液的大肠埃希菌在室温下自然风干；步骤六：待当步骤六中的溶剂挥发结晶后直接进行maldi分析。
18.对比例二步骤一：在固体培养基上培养大肠埃希菌24h；
步骤二：将chca
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c3溶于50%乙腈含2.5%三氟乙酸溶液中配制浓度为10
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15mg/ml的chca
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c3基质液，保存于4℃的冰箱中以备用；步骤三：取步骤一中培养得到的大肠埃希菌均匀涂在maldi
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ms配套的靶板上；步骤四：待步骤三靶板上的大肠埃希菌风干后，将步骤二得到的chca
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c3基质液取0.5
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1μl点在干后的大肠埃希菌上；步骤五：将步骤四中滴加chca
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c3基质液的大肠埃希菌在室温下自然风干；步骤六：待当步骤六中的溶剂挥发结晶后直接进行maldi分析。
19.根据对比例1和2所示，所述待测细菌为大肠埃希菌，数据在线性正离子模式下采集，结果如图2中a为chca作为基质检测大肠埃希菌谱图和图2中b为chca
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c3作为基质检测大肠埃希菌质谱图所示，表明用chca
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c3作基质时，检测到更多的质谱峰，并且chca和chca
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c3单独作为基质检测细菌时得到的指纹谱图有很大不同。
20.对比例三步骤一：在固体培养基上培养大肠埃希菌24h；步骤二：将chca和chca
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c3分别溶于50%乙腈含2.5%三氟乙酸溶液中配制浓度为10
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15mg/mlchca和chca
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c3基质液，保存于4℃的冰箱中以备用；步骤三：分别取chca基质液和chca
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c3基质液以体积比2:1均匀混合；步骤四：取步骤一培养得到的大肠埃希菌均匀涂在maldi
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ms配套的靶板上；步骤五：步骤四靶板上的大肠埃希菌风干后，将步骤三得到的混合基质溶液取0.5
‑
1μl点在干后的大肠埃希菌上；步骤六：将步骤五中滴加混合基质溶液的大肠埃希菌在室温下自然风干；步骤七：待当步骤六中的溶剂挥发结晶后直接进行maldi分析。
21.对比例四步骤一：在固体培养基上培养大肠埃希菌24h；步骤二：将chca和chca
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c3分别溶于50%乙腈含2.5%三氟乙酸溶液中配制浓度为10
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15mg/mlchca和chca
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c3基质液，保存于4℃的冰箱中以备用；步骤三：分别取chca基质液和chca
‑
c3基质液以体积比1:1均匀混合；步骤四：取步骤一培养得到的大肠埃希菌均匀涂在maldi
‑
ms配套的靶板上；步骤五：步骤四靶板上的大肠埃希菌风干后，将步骤三得到的混合基质溶液取0.5
‑
1μl点在干后的大肠埃希菌上；步骤六：将步骤五中滴加混合基质溶液的大肠埃希菌在室温下自然风干；步骤七：待当步骤六中的溶剂挥发结晶后直接进行maldi分析。
22.对比例五步骤一：在固体培养基上培养大肠埃希菌24h；步骤二：将chca和chca
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c3分别溶于50%乙腈含2.5%三氟乙酸溶液中配制浓度为10
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15mg/mlchca和chca
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c3基质液，保存于4℃的冰箱中以备用；步骤三：分别取chca基质液和chca
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c3基质液以体积比1:2均匀混合；步骤四：取步骤一培养得到的大肠埃希菌均匀涂在maldi
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ms配套的靶板上；步骤五：步骤四靶板上的大肠埃希菌风干后，将步骤三得到的混合基质溶液取0.5
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1μl点在干后的大肠埃希菌上；
步骤六：将步骤五中滴加混合基质溶液的大肠埃希菌在室温下自然风干；步骤七：待当步骤六中的溶剂挥发结晶后直接进行maldi分析。
23.对比例六步骤一：在固体培养基上培养大肠埃希菌24h；步骤二：将chca和chca
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c3分别溶于50%乙腈含2.5%三氟乙酸溶液中配制浓度为10
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15mg/mlchca和chca
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c3基质液，保存于4℃的冰箱中以备用；步骤三：分别取chca基质液和chca
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c3基质液以体积比1:3均匀混合；步骤四：取步骤一培养得到的大肠埃希菌均匀涂在maldi
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ms配套的靶板上；步骤五：步骤四靶板上的大肠埃希菌风干后，将步骤三得到的混合基质溶液取0.5
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1μl点在干后的大肠埃希菌上；步骤六：将步骤五中滴加混合基质溶液的大肠埃希菌在室温下自然风干；步骤七：待当步骤六中的溶剂挥发结晶后直接进行maldi分析。
24.根据对比例3
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6所示，所述待测细菌为大肠埃希菌，数据在线性正离子模式下采集。综上所述，如图3所示混合基质鉴定细菌最佳条件为混合体积比为1:2。
25.实施例一混合基质在maldi质谱中检测细菌的方法的步骤如下：步骤一：在固体培养基上分别培养阴沟肠杆菌和铜绿假单胞菌24h；步骤二：将chca和chca
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c3分别溶于50%乙腈含2.5%三氟乙酸溶液中配制浓度为10
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15mg/mlchca和chca
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c3基质液，保存于4℃的冰箱中以备用；步骤三：分别取chca基质液和chca
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c3基质液以体积比1:2均匀混合；步骤四：取步骤一培养得到的阴沟肠杆菌和铜绿假单胞菌分别均匀涂在maldi
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ms配套的靶板上；步骤五：步骤四靶板上的阴沟肠杆菌和铜绿假单胞菌风干后，将步骤三得到的混合基质溶液均取0.5
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1μl分别点在干后的阴沟肠杆菌和铜绿假单胞菌上；步骤六：将步骤五中滴加混合基质溶液的阴沟肠杆菌和铜绿假单胞菌在室温下自然风干；步骤七：待当步骤六中的溶剂挥发结晶后直接进行maldi分析。
26.根据实施例一，数据在线性正离子模式下采集，结果如图4为混合基质检测待测细菌质谱图所示，表明用混合基质作基质时，检测到较好的细菌质谱图。
27.实施例二混合基质在maldi质谱中测定大肠埃希菌和志贺氏菌的步骤如下：步骤一：在固体培养基上分别培养大肠埃希菌和志贺氏菌24h；步骤二：将chca和chca
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c3分别溶于50%乙腈含2.5%三氟乙酸溶液中配制浓度为10
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15mg/mlchca和chca
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c3基质液，保存于4℃的冰箱中以备用；步骤三：分别取chca基质液和chca
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c3基质液以体积比1:2均匀混合；步骤四：取步骤一培养得到的大肠埃希菌和志贺氏菌分别均匀涂在maldi
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ms配套的靶板上；步骤五：步骤四靶板上的大肠埃希菌和志贺氏菌风干后，将步骤三得到的混合基质溶液取0.5
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1μl分别点在干后的大肠埃希菌和志贺氏菌上；
步骤六：将步骤五中滴加混合基质溶液的大肠埃希菌和志贺氏菌在室温下自然风干；步骤七：待当步骤六中的溶剂挥发结晶后分别进行maldi分析。
28.根据实施例二，数据分别在线性正离子模式下采集，结果如图5中a为混合基质检测大肠埃希菌谱图和图5中b为混合基质检测志贺氏菌质谱图所示，表明用混合基质检测相似细菌时，检测到更多的两种细菌的差异谱峰。可以将两种细菌区分开来。
29.本发明上述实施例中提供了新型混合基质在maldi
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ms细菌鉴定中的应用，这种新型maldi混合基质可以同时检测到亲水性蛋白质和疏水性蛋白质，从而扩大了分析物的质谱峰数量，使其能够更准确的鉴定细菌，实现了细菌的快速，高灵敏的区分鉴定；这种混合基质可以同时检测到多种亲水蛋白质和疏水蛋白质的质谱峰，从而提高了使用maldi
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ms区分细菌的准确性，使其能够区分大肠埃希菌和志贺氏菌等相似的细菌。使得临床给药更加精准。
30.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。