细胞和组织内脂滴的荧光成像试剂的制作方法

1.本发明涉及一种细胞和组织内脂滴的荧光成像试剂。


背景技术：

2.脂滴(脂质液滴，lipid droplet)是三酰基甘油、胆固醇酯等中性脂质被单层的磷脂膜包裹而成的球状的细胞器。主要多见于脂肪细胞内，但在任何细胞中都普遍存在。迄今为止认为脂滴的主要作用是贮存中性脂质，然而在近年的研究中明确了：它参与着细胞内的脂质代谢调控。此外，有脂滴与自噬(autophagy)有关的研究报道等与脂滴的形成、生长、分解的机制有关的研究正在逐步推进。另一方面，在组织(个体)中脂肪的过度堆积会导致组织的功能不全，会引起糖尿病、动脉硬化等病症出现。另外，近年来，一种肝炎病症即非酒精性脂肪肝炎(nash)的发病急增。若放置非酒精性脂肪肝炎，则具有发展成肝硬化、肝癌的危险性。因此，阐明脂滴在细胞和组织内的形成、生长、分解的机制，这不仅对细胞生物学来讲重要，对上述疾患的诊断和治疗也很重要。因此，认为有必要开发用于对活细胞、组织内的脂滴进行高灵敏度实时成像的分子探针。
3.荧光成像法是对细胞、组织在存活状态下简便进行成像的方法，普遍用于生物/医学研究中。在学术水平上，关于对脂滴进行成像的荧光试剂已有较多报道，但被实用化的试剂数量和种类有限。图1示出目前正在市售的脂滴荧光成像试剂。多数研究者使用bodipy493/503、尼罗红(nile red)。bodipy493/503在500nm附近显示绿色荧光，脂滴选择性也高。然而，存在光稳定性不高、脂滴滞留性低、因斯托克斯位移(stokes
‑
shift，最大吸收波长与最大荧光波长的能量差)小而导致的激发光泄漏等问题点。另外，尼罗红也会较多分布于脂滴以外的细胞器中，因此脂滴选择性低。而且，吸收以及荧光光谱依赖于周边的微环境而大幅改变，难以与其他荧光试剂进行多重染色。另外，专利文献1中报道了使用稠环噻吩化合物的油滴染色剂，但是该化合物的激发光的吸收峰广泛存在于蓝色至绿色，成像重叠，难以进行多色成像。为了解决这些问题，开发了lipidye、lipi系列(lipi
‑
蓝、lipi
‑
绿、lipi
‑
红)。这些试剂虽然可以对细胞内脂滴进行选择性成像，但是在活组织内的脂滴成像方面尚无研究成果。
4.关于活组织内的脂滴成像，取代了硝基苯类的尼罗蓝(nile blue)衍生物(mns
‑
nb，图2)在专利文献2中被报道。mns
‑
nb在极性溶剂中，会在硝基苯单元与尼罗蓝之间产生光诱导电子转移反应。另一方面，在低极性溶剂中，不易产生光诱导电子转移反应，显示红色荧光。mns
‑
nb虽然是能够实现组织内的脂滴成像的试剂，但是存在荧光量子产率低(0.21：氯仿中)，斯托克斯位移小等问题点。
5.现有技术文献
6.专利文献
7.专利文献1：日本特开2018
‑
145422号公报
8.专利文献2：日本专利第6241014号公报


技术实现要素：

9.发明所要解决的问题
10.如上所述，目前市售的用于脂滴成像的荧光试剂限定于培养细胞。此外，作为非市售化合物的mns
‑
nb在实用化方面尚存在诸多问题。因此，本发明的问题在于提供一种能对培养细胞水平至个体水平中的脂滴进行高灵敏度成像的荧光试剂。认为通过这种荧光试剂能对开发源于脂肪的过度堆积的疾患的诊断药、治疗药有很大贡献。
11.用于解决问题的方案
12.为了解决上述问题，本发明人等进行了深入研究，其结果是发现了：开发了具有香豆素骨架的试剂，通过使用该试剂，能够对细胞以及组织内的脂滴选择性地进行荧光成像，从而完成了本发明。
13.即，本发明的主旨涉及以下内容。
14.[1]一种脂滴检测用试剂，其包含下述通式(i)所示化合物。
[0015][0016]
(式中，
[0017]
m表示0～5的整数；
[0018]
n表示0～5的整数；
[0019]
x选自由硫原子、氧原子以及nr所示的基团构成的组中；
[0020]
r是氢原子或－(ch2)
y
ch3所示的基团；
[0021]
y表示0～5的整数。)
[0022]
[2]根据[1]所述的检测用试剂，其中，m和n为1。
[0023]
[3]根据[1]或[2]所述的检测用试剂，其中，y为0。
[0024]
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的检测用试剂，其中，用于检测生物体试样中的脂滴。
[0025]
[5]根据[4]所述的检测用试剂，其中，生物体试样是细胞或组织。
[0026]
[6]根据[1]～[3]中任一项所述的检测用试剂，其中，用于检测生物体个体中的脂滴。
[0027]
[7]一种脂滴检测方法，其包括将[1]～[6]中任一项所述的检测用试剂给药至生物体试样或生物体个体(人除外)中的工序。
[0028]
[8]根据[7]所述的脂滴检测方法，其中，将含有检测用试剂和助溶剂的溶液给药至生物体试样或生物体个体(人除外)。
[0029]
[9]根据[8]所述的脂滴检测方法，其中，助溶剂为白蛋白。
[0030]
[10]一种化合物，其由下述通式(i)’表示。
[0031][0032]
(式中，
[0033]
m表示0～5的整数；
[0034]
n表示0～5的整数；
[0035]
x’选自由氧原子和nr’所示的基团构成的组中；
[0036]
r’是－(ch2)
y
ch3所示的基团；
[0037]
y表示0～5的整数。)
[0038]
[11]根据[10]所述的化合物，其中，m和n为1。
[0039]
[12]根据[10]或[11]所述的化合物，其中，y为0。
[0040]
发明效果
[0041]
根据本发明，能提供一种对细胞和组织内的脂滴选择性进行荧光成像的试剂。
附图说明
[0042]
图1示出市售的脂滴荧光成像试剂的结构式。
[0043]
图2示出尼罗蓝衍生物(mns
‑
nb)的结构式。
[0044]
图3示出在实施例中合成的本发明的一个方案的化合物的结构式。
[0045]
图4示出本发明的化合物(pc6s)的吸收/荧光光谱。
[0046]
图5示出本发明的一个方案的化合物(pc6o、pc6nh、pc6nme)的吸收/荧光光谱。
[0047]
图6示出将pc6s和市售的脂滴成像试剂添加到hela细胞中而得到的荧光成像图像(附图用照片代替)。
[0048]
图7示出pc6s和市售的脂滴成像试剂在细胞内的光稳定性的评价结果。
[0049]
图8示出pc6s和市售的脂滴成像试剂在细胞内的滞留性的评价结果(附图用照片代替)。
[0050]
图9示出给药pc6s的小鼠肝脏表面的强度图像和寿命图像(附图用照片代替)。
[0051]
图10示出给药pc6s的小鼠内的脂肪组织和脂滴的荧光强度成像图像(附图用照片代替)。图10的a示出皮下脂肪组织的荧光成像图像；图10的b示出腹部脂肪组织的荧光成像图像；图10的c示出骨骼肌的荧光成像图像；图10的d示出心肌的荧光成像图像；图10的e示出心脏周围脂肪组织的荧光成像图像；图10的f示出肾脏的荧光成像图像。
[0052]
图11示出给药pc6s的小鼠内的脂肪组织和脂滴的非剖腹成像图像(附图用照片代替)。图11的a示出pc6s给药前(小鼠自体荧光)的图像；图11的b示出pc6s给药后的图像。
[0053]
图12示出给药pc6s的小鼠内的脂肪组织以及脂滴的剖腹成像图像(附图用照片代替)。图12的a示出剥开皮肤所拍摄的图像；图12的b示出剥开皮肤和内脏的覆膜所拍摄的图像。
具体实施方式
[0054]
以下，对本发明进行说明。
[0055]
＜脂滴检测用试剂＞
[0056]
本发明的一个方案涉及一种脂滴检测用试剂(以下，有时会称“本发明的脂滴检测用试剂”。)，其包含下述通式(i)所示化合物。在此，脂滴是指，例如细胞内所包含的含有脂质的球形的液滴。
[0057]
通式(i)所示的化合物是具有以下结构的化合物。
[0058][0059]
在通式(i)中，m表示0～5的整数。从合成上的观点考虑，m优选为0～2的整数。另外，从溶解性的观点考虑，m优选为1～2的整数，m更优选为1。
[0060]
在通式(i)中，n表示0～5的整数。从合成上的观点考虑，n优选为0～2的整数。另外，从溶解性的观点考虑，m优选为1～2的整数，n更优选为1。
[0061]
在通式(i)中，x选自由硫原子、氧原子以及nr所示的基团构成的组中，r是氢原子或－(ch2)
y
ch3所示的基团，y是0～5的整数。从合成上的观点考虑，y优选为0～2的整数，y更优选为0。
[0062]
作为上述通式(i)所示的化合物的具体例子，可列举出下述列举的化合物，但本发明并不限定于此。
[0063][0064]
通式(i)所示的化合物的荧光的光物理特性，例如，最大吸收/荧光波长、荧光量子产率(φ
f
)以及荧光寿命(τ
f
)等可以通过公知的测定方法进行测定。例如，最大吸收/荧光波长、荧光产率可以使用发光量子产率测定装置等，采用将通式(i)所示的化合物溶解于溶剂等而成的试样来进行测定。荧光寿命可以使用荧光寿命测定装置对各溶剂中的上述化合物的荧光寿命(τ
f
)进行测定。
[0065]
荧光量子产率(φ
f
)可以根据化合物的结构、溶剂的种类等来变更，没有特别限定，例如为0.5以上、0.7以上、或0.8以上。
[0066]
荧光寿命(τ
f
)可以根据化合物的结构、溶剂的种类等来变更，没有特别限定，例如为2.0ns(纳秒)以上、2.5ns以上、3.0ns以上或3.5ns以上。
[0067]
通式(i)所示的化合物在溶剂中的最大激发波长可以根据化合物的结构、溶剂的种类等来变更，没有特别限定，例如为430nm～510nm。另外，溶剂中的最大荧光波长也可以适当设定，例如为480nm～650nm。
[0068]
《化合物的制造方法》
[0069]
通式(i)所示的化合物可以基于后述实施例的记载和公知的有机合成方法来制造。
[0070]
《试剂》
[0071]
本发明的脂滴检测用试剂包含具有上述结构的化合物。通过该结构，具有荧光下的优异的光物理特性(荧光量子产率、荧光寿命以及斯托克斯位移等)。特别是在各种溶剂中具有如上述那样优异的光物理特性，因此，不仅在细胞中，作为活体中的脂滴检测用试剂也是有用的。另外，通过采用上述结构，具有优异的脂滴选择性和细胞内滞留性。因此，能够用作特异性高的脂滴检测用试剂。
[0072]
本发明的脂滴检测用试剂可以仅由通式(i)所示的化合物构成，只要不妨碍本发明效果，也可以进一步包含用作溶剂、添加物以及脂滴检测用试剂的除本发明的化合物以外的化合物。
[0073]
＜脂滴检测方法＞
[0074]
本发明的一个方案涉及一种脂滴检测方法(以下，有时称为“本发明的脂滴检测方法”。)，其包括将本发明的脂滴检测用试剂给药至生物体试样或生物体个体(人除外)的工序。
[0075]
另外，本发明的另一方案涉及一种脂滴检测方法，其中，将包含本发明的脂滴检测用试剂和助溶剂的溶液给药至生物体试样或生物体个体(人除外)。用作脂滴检测用试剂的通式(i)所示的化合物有时会呈现出水难溶性。在该情况下，可以将如下溶液给药至生物体试样或生物体个体(人除外)，该溶液是将通式(i)所示的化合物溶解于通式(i)所示的化合物可溶解的有机溶剂，将其与包含助溶剂的水溶液混合而制备出的溶液。助溶剂只要是能赋予通式(i)所示的化合物水溶性，且具有生物相容性，就没有限定，例如，优选白蛋白、明胶、酪蛋白等生物相容性蛋白质。助溶剂可以使用一种或者混合使用两种以上。助溶剂在水溶液中例如可以以1～30质量％，优选5～20质量％，更优选7.5～10质量％来使用。通式(i)所示的化合物可以适当调整，在将通式(i)所示的化合物可溶解的有机溶剂与包含助溶剂的水溶液混合而制备出的溶液中，例如可以以0.01～50mm，优选0.1～5mm，更优选0.5～1mm来使用。
[0076]
本发明的脂滴检测方法还可以包括检测本发明的脂滴检测用试剂的工序。脂滴检测用试剂的检测可以基于公知的荧光试剂的检测方法来进行。
[0077]
本发明的脂滴检测用试剂例如可以用作用于检测生物体试样中的脂滴的检测用试剂。生物体试样没有限定，例如为细胞或分离出来的组织等。另外，本发明的脂滴检测用试剂也能应用于生物体，进行检测，可以用作用于检测生物体个体中的细胞、组织等中的脂
滴的检测用试剂。
[0078]
本发明的脂滴检测用试剂能对存在于细胞内的脂滴进行特异性检测。因此，作为细胞中的脂滴检测用试剂是有用的。
[0079]
存在于细胞内的脂滴的检测例如可以按照如下的方式进行。
[0080]
将本发明的脂滴检测用试剂添加至包含脂滴或预测包含脂滴的细胞。
[0081]
之后，通过利用荧光显微镜等对本发明的脂滴检测用试剂的荧光信号进行观测，能对细胞内所包含的脂滴进行检测。
[0082]
本发明的脂滴检测用试剂在细胞中的添加量可以根据所使用的细胞、脂滴的比例等来适当变更，例如可以以0.01～100μm的终浓度，优选0.1～10μm的终浓度向细胞添加。
[0083]
在将本发明的脂滴检测用试剂溶解于溶剂后再添加至细胞的情况下，作为溶剂，没有限定，例如可以使用正己烷、二丁醚、乙酸乙酯、乙腈、二甲基亚砜等有机溶剂等。
[0084]
作为添加本发明的脂滴检测用试剂的细胞，只要是包含脂滴或预测包含脂滴的细胞，就没有特别限制，例如可列举出3t3
‑
l1细胞、分离脂肪细胞等。另外，也可以使用在不含脂滴的细胞或含少量脂滴的细胞中人为地形成脂滴的细胞。作为不含脂滴的细胞或含少量脂滴的细胞，例如可列举出hela细胞、ueet
‑
12细胞、nih3t3细胞等。作为形成脂滴的方法，例如可列举出通过将油酸添加到细胞中的方法等来诱导脂滴的方法。
[0085]
本发明的脂滴检测用试剂还能对组织中的脂滴、生物体个体(存活的生物体个体)中的脂滴和脂肪组织进行特异性检测。因此，可用作组织中的脂滴以及生物体内的脂滴和脂肪组织的检测用试剂。
[0086]
存在于组织内的脂滴的检测例如可以按照如下的方式进行。
[0087]
将本发明的脂滴检测用试剂添加至包含脂滴或预测包含脂滴的组织。
[0088]
之后，通过利用荧光显微镜等对本发明的脂滴检测用试剂的荧光信号进行观测，能对组织内所包含的脂滴进行检测。
[0089]
本发明的脂滴检测用试剂在组织中的添加量可以根据所使用的组织、脂滴的比例等而适当变更，例如可以以0.01～100μm的终浓度，优选0.1～10μm的终浓度向组织添加。
[0090]
在将本发明的脂滴检测用试剂溶解于溶剂后再添加至组织的情况下，作为溶剂，没有限定，例如可以使用正己烷、二丁醚、乙酸乙酯、乙腈、二甲基亚砜等有机溶剂等。进而，还可以与生物相容性的液体组合使用。此外，如上所述，还可以将包含本发明的脂滴检测用试剂的有机溶剂与包含助溶剂的水溶液混合而制备出的溶液添加至组织。
[0091]
作为通过本发明的脂滴检测用试剂所检测的组织，没有限定，例如可列举出：皮下脂肪、内脏脂肪、异位脂肪(例如，堆积于肌肉、肝脏、心脏、胰腺、肾脏等脏器的脂肪)等。
[0092]
存在于生物体个体内的脂滴的检测例如可以按照如下的方式进行。
[0093]
将本发明的脂滴检测用试剂给药至生物体个体。
[0094]
之后，通过利用使用了共聚焦显微镜等的生物体成像手法对本发明的脂滴检测用试剂的荧光信号进行观测，能在不固定生物体个体且存活状态下，对生物体内的脂肪组织进行检测。
[0095]
作为本发明的脂滴检测用试剂的给药方式，例如可列举出：静脉内给药、皮下给药、肌肉内给药。
[0096]
此外，本发明的脂滴检测用试剂的给药量也根据给药对象、给药方式等而不同，例
如，可以在0.01～1.0μmol/kg体重，优选为0.1～0.5μmol/kg体重的范围内给药。
[0097]
在将本发明的脂滴检测用试剂溶解于溶剂后再给药于生物体个体的情况下，作为溶剂，没有限定，例如可以使用正己烷、二丁醚、乙酸乙酯、乙腈、二甲基亚砜等有机溶剂。而且，还可以与生物相容性的液体组合给药。另外，还可以如上所述，将包含本发明的脂滴检测用试剂的有机溶剂与包含助溶剂的溶液混合而制备出的溶液添加至生物体个体。
[0098]
作为给药对象的生物体个体，没有特别限定，例如可列举出：包括哺乳动物(小鼠、人、猪、狗、兔、人等)的脊椎动物、无脊椎动物。
[0099]
＜本发明的化合物＞
[0100]
下述通式(i)’所示的化合物是根据本发明合成得到的新型化合物。即，本发明的一个方案涉及一种下述通式(i)’所示的化合物(以下，有时会称为“本发明的化合物”。)。
[0101]
通式(i)’所示的化合物是具有以下结构的化合物。
[0102][0103]
在通式(i)’中，m表示0～5的整数。从合成上的观点考虑，m优选为0～2的整数。此外，从溶解性的观点考虑，m优选为1～2的整数，m更优选为1。
[0104]
在通式(i)’中，n表示0～5的整数。从合成上的观点考虑，n优选为0～2的整数。此外，从溶解性的观点考虑，m优选为1～2的整数，n更优选为1。
[0105]
在通式(i)’中，x’选自由氧原子和nr’所示的基团构成的组中，r’为－(ch2)
y
ch3所示的基团，y是0～5的整数。从合成上的观点考虑，y优选为0～2的整数，y更优选为0。
[0106]
[实施例]
[0107]
以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但这些是本发明的示例，本发明的范围并不限定于这些。
[0108]
＜合成例＞
[0109]
如下所述地合成了化合物pc6s、pc6o、pc6nh、pc6nme。
[0110]
路线1表示pc6s、pc6o、pc6nh、pc6nme的合成路径。
[0111][0112]
＜7－(二乙基氨基)萘－2－醇(1)＞
[0113]
使用密封管(seal tube)将2，7－二羟基萘(3.0g，18.7mmol)、二亚硫酸钠(7.11g，37.4mmol)、二乙胺(9.7ml，93.5mmol)、水(7ml)的混合液在140℃下搅拌了6小时。空冷却后，向反应溶液中加入二氯甲烷，用水清洗数次。利用无水硫酸钠干燥有机层，进行了浓缩。对得到的粗产物采用快速自动纯化装置(isolera spektra，biotage)而进行生成(硅胶柱，展开溶剂：正己烷∶乙酸乙酯(4∶1，v/v)，得到了化合物1(产量：1.26g，31％)。
[0114]1h nmr(400mhz，cdcl3，tms)：δ7.59－7.53(2h，q)，6.94－6.90(2h，m)，6.76－6.73(1h，d)，6.69(1h，s)，4.78(1h，br)，3.46－3.41(4h，q)，1.22－1.18(6h，t)。
[0115]
＜7－(甲氧基甲氧基氨基)萘－2－基]二乙胺(2)＞
[0116]
将化合物1(0.86g，4mmol)溶解于脱水dmf，使用冰浴设定为－15℃，加入氢氧化钠(250mg，10.4mmol)，搅拌直至氢气的产生停止。向该溶液中加入氯甲基甲醚(0.38ml，5.0mmol)，在室温下搅拌了6小时。将反应溶液注入水中，利用乙酸乙酯萃取。用无水硫酸钠干燥有机层，进行了浓缩。对得到的粗产物使用快速自动纯化装置(isolera spektra，biotage)而进行生成(硅胶柱，展开溶剂：正己烷∶乙酸乙酯(9∶1，v/v)，得到了化合物2(产量：0.91g，88％)。
[0117]1h nmr(400mhz，cdcl3，tms)：δ7.60－7.55(2h，q)，7.17(1h，s)，6.96－6.93(1h，d)，6.89－6.86(1h，s)，6.78(1h，s)，5.27(2h，s)，3.46－3.41(4h，q)，1.22－1.18(6h，t)。
[0118]
＜6－二乙基氨基－3－(甲氧基甲氧基)萘－2－甲醛(3)＞
[0119]
将化合物2(2.80g，10.8mmol)溶解于脱水二乙醚，在－20℃下用30分钟加入叔丁基锂(1.9mol/l戊烷溶液，8.5ml，16.2mmol)，搅拌了2小时。向该溶液中加入脱水n，n－二甲基甲酰胺(dmf)(25ml，320mmol)，在－20℃下搅拌1小时后，加入4n hcl(10ml)，在－20℃下搅拌了30分钟。向反应溶液中加入乙酸乙酯，利用0.5n hcl、饱和碳酸氢钠水溶液、食盐水清洗有机层数次。利用无水硫酸钠干燥有机层，进行了浓缩。对得到的粗产物使用快速自动
纯化装置(isolera spektra，biotage)而进行生成(硅胶柱，展开溶剂：正己烷∶乙酸乙酯(9∶1，v/v)，得到了化合物3(产量：2.45g，79％)。
[0120]1h nmr(400mhz，cdcl3，tms)：δ10.43(1h，s)，8.19(1h，s)，7.69－7.66(1h，d)，7.15(1h，s)，6.95－6.93(1h，d)，6.69(1h，s)，5.36(2h，s)，3.55(3h，s)，3.49－3.44(4h，q)，1.24－1.21(6h，t)。
[0121]
＜6－二乙基氨基－3－(羟基)萘－2－甲醛(4)＞
[0122]
将化合物3(1.59g，5.5mmol)溶解于异丙醇∶5n hcl(70ml∶35ml)中，在60℃下搅拌了4小时。从反应溶液中减压馏去异丙醇，加入乙酸乙酯，利用水清洗有机层数次。利用无水硫酸钠干燥有机层，进行了浓缩。对得到的粗产物使用快速自动纯化装置(isolera spektra，biotage)而进行生成(硅胶柱，展开溶剂：正己烷∶乙酸乙酯(4∶1，v/v)，得到了化合物4(产量：1.31g，98％)。
[0123]1h nmr(400mhz，cdcl3，tms)：δ10.53(1h，s)，9.85(1h，s)，7.85(1h,s)，7.66－7.63(1h，d)，6.93－6.90(1h，d)，6.90(1h，s)，6.60(1h，s)，3.51－3.45(4h，q)，1.28－1.22(6h，t)。
[0124]
＜3－(苯并[d]噻唑－2－基)－8－(二乙基氨基)－2h－苯并[g]色烯－2－酮(3－(benzo[d]thiazol－2－yl)－8－(diethylamino)－2h－benzo[g]chromen－2－one，pc6s)＞
[0125]
将化合物4(120mg，0.49mmol)、2－(2－苯并噻唑)乙酸乙酯(122mg，0.55mmol)溶解于无水乙醇，滴加哌啶5滴左右，在60℃下搅拌了4小时。过滤析出的固体，对过滤物使用快速自动纯化装置(isolera spektra，biotage)而进行生成(硅胶柱，展开溶剂：正己烷∶乙酸乙酯(1∶1，v/v)，得到了化合物pc6s(产量：157mg，80％)。
[0126]1h nmr(400mhz，cdcl3，tms)：δ9.08(1h，s)，8.08－8.06(1h，d)，7.99(1h，s)，7.97－7.95(1h，d)，7.79－7.77(1h，d)，7.53－7.49(1h，t)，7.44(1h，s)，7.41－7.38(1h，t)，7.11－7.08(1h，d)，6.79(1h，s)，3.55－3.49(4h，q)，1.29－1.25(6h，t)。
[0127]
pc6s的esi－ms(m/z)的以c
24
h
21
n2o2s[m h]

计的计算值(calcd for)：401.12，实验值(found)：401.2。
[0128]
＜3－(苯并[d]恶唑－2－基)－8－(二乙基氨基)－2h－苯并[g]色烯－2－酮(3－(benzo[d]oxazol－2－yl)－8－(diethylamino)－2h－benzo[g]chromen－2－one，pc6o)＞
[0129]
将化合物4(122mg，0.50mmol)、2－(2－苯并恶唑基)乙酸乙酯(120mg，0.59mmol)溶解于无水乙醇中，加入哌啶5滴左右，在60℃下搅拌了4小时。过滤析出的固体，对过滤物使用快速自动纯化装置(isolera spektra，biotage)而进行生成(硅胶柱，展开溶剂：正己烷∶乙酸乙酯(1∶1，v/v)，得到了化合物pc6o(产量：138mg，72％)。
[0130]1h nmr(400mhz，cdcl3，tms)：δ8.79(1h，s)，7.93(1h，s)，7.86－7.84(1h，t)，7.77－7.75(1h，d)，7.63－7.61(1h，t)，7.40(1h，s)，7.38－7.36(1h，t)，7.11－7.08(1h，d)，6.78(1h，s)，3.55－3.50(4h，q)，1.29－1.25(6h，t)。
[0131]
pc6o的esi－ms(m/z)的以c
24
h
21
n2o3[m h]

计的计算值：385.15，实验值：385.2。
[0132]
＜3－(1h－苯并[d]咪唑－2基)－8－(二乙基氨基)－2h－苯并[g]色烯－2－酮(3－(1h－benzo[d]imidazol－2－yl)－8－(diethylamino)－2h－benzo[g]chromen－
2－one，pc6nh)＞
[0133]
将化合物4(80mg，0.36mmol)、2－(2－苯并咪唑基)乙酸乙酯(100mg，0.49mmol)溶解于无水乙醇中，加入哌啶5滴左右，在60℃下搅拌4小时。过滤析出的固体，对过滤物使用快速自动纯化装置(isolera spektra，biotage)而进行生成(硅胶柱，展开溶剂：氯仿∶甲醇(97∶3，v/v)，得到了化合物pc6nh(产量：64mg，46％)。
[0134]1h nmr(400mhz，cdcl3，tms)：δ11.31(1h，s)，9.11(1h，s)，7.95(1h，s)，7.80－7.77(1h，t)，7.55－7.51(1h，m)，7.44(1h，s)，7.30－7.29(1h，t)，7.12－7.09(1h，d)，6.79(1h，s)，3.55－3.49(4h，q)，1.29－1.25(6h，t)。
[0135]
pc6nh的esi－ms(m/z)的以c
24
h
22
n3o2[m h]

计的计算值：384.16，实验值：384.1。
[0136]
＜8－(二乙基氨基)－3－(1－甲基－1h－苯并[d]咪唑－2基)－2h－苯并[g]色烯－2－酮(8－(diethylamino)－3－(1－methyl－1h－benzo[d]imidazol－2－yl)－2h－benzo[g]chromen－2－one，pc6nme)＞
[0137]
将化合物4(80mg，0.36mmol)、2－(1－甲基－2－苯并咪唑基)乙酸乙酯(100mg，0.46mmol)溶解于无水乙醇中，加入哌啶5滴左右，在60℃下搅拌了4小时。过滤析出的固体，对过滤物使用快速自动纯化装置(isolera spektra，biotage)而进行生成(硅胶柱，展开溶剂：氯仿∶甲醇(97∶3，v/v)，得到了化合物pc6nme(产量：40mg，28％)。
[0138]1h nmr(400mhz，cdcl3，tms)：δ8.37(1h，s)，7.88(1h，s)，7.81－7.80(1h，d)，7.77－7.72(1h，m)，7.44(1h，s)，7.43－7.41(1h，d)，7.34－7.29(2h，m)，7.11－7.08(1h，d)，6.80(1h，s)，3.85(3h，s)，3.54－3.49(4h，q)，1.29－1.25(6h，t)。
[0139]
pc6nme的esi－ms(m/z)的以c
25
h
24
n3o2[m h]

计的计算值为：398.18，实验值：398.1。
[0140]
＜3－(苯并[d]噻唑－2－基)－8－(二甲基氨基)－2h－苯并[g]色烯－2－酮(3－(benzo[d]thiazol－2－yl)－8－(dimethylamino)－2h－benzo[g]chromen－2－one)＞
[0141]
基于上述路线1，合成了标题的化合物。
[0142]1h nmr(400mhz，cdcl3，tms)：δ9.08(1h，s)，8.08－8.06(1h，d)，7.99(1h，s)，7.97－7.95(1h，d)，7.79－7.77(1h，d)，7.53－7.49(1h，t)，7.44(1h，s)，7.41－7.38(1h，t)，7.11－7.08(1h，d)，6.79(1h，s)，3.55－3.49(6h，t)。
[0143]
＜测定方法＞
[0144]
(最大吸收波长、最大荧光波长以及荧光量子产率的测定)
[0145]
使用发光量子产率测定装置(c9920
‑
01；日本滨松光子学公司制)，测定出上述化合物在各溶剂中的最大吸收波长(λabs/nm)、最大荧光波长(λflu/nm)以及荧光量子产率(φ
f
)。
[0146]
对于吸收光谱，使用紫外可见分光光度计(ubest
‑
550；日本分光公司制)进行测定，对于荧光发光光谱，使用荧光分光光度计(f
‑
7000；日本日立公司制)进行了测定。
[0147]
(荧光寿命的测定)
[0148]
使用小型荧光寿命测定装置(quntaurus
‑
tau；日本滨松光子学公司制)，测定出上述化合物在各溶剂中的荧光寿命(τ
f
)。
[0149]
荧光产率，即荧光量子产率(φ
f
)是指，在物质所吸收的光子中，作为荧光发射的
光子的比例。因此，荧光产率越高，发光效率越好，表示发光强度越强。另外，荧光寿命(τ
f
)的值具有分子固有的值。
[0150]
(光稳定性和滞留性的测定)
[0151]
采用荧光显微镜(ix71；日本奥林巴斯公司制)，经时获取细胞的荧光成像图像，测定出光稳定性(i
t
/i0)以及滞留性。
[0152]
<实施例1>
[0153]
通过上述制造例合成的本发明的化合物(图3，pc6s、pc6o、pc6nh、pc6nme)具有8
‑
二乙基氨基苯并香豆素骨架。对于这些化合物，测定了光物理特性。
[0154]
在图4中示出pc6s在各溶剂中的吸收/荧光光谱。另外，在表1中示出光物理参数。观测到最大吸收波长在455～504nm，最大荧光波长在498～642nm，最大吸收波长和最大荧光波长随着溶剂的极性的增加，均呈现向长波长方向移位。荧光量子产率在所有溶剂中具有0.8以上。
[0155]
[表1]
[0156][0157]
n
‑
hexane：正己烷
[0158]
bu2o：二丁醚
[0159]
etoac：乙酸乙酯
[0160]
mecn：乙腈
[0161]
dmso：二甲基亚砜
[0162]
ε：介电常数
[0163]
最大吸收波长，最大荧光波长，
[0164]
φ
f
：荧光量子产率，τ
f
：荧光寿命
[0165]
在图5中示出pc6o、pc6nh、pc6nme在二丁醚和乙腈中的吸收/荧光光谱，此外，将光物理参数示于表2。
[0166]
[表2]
[0167][0168]
最大吸收波长，最大荧光波长，φ
f
：荧光量子产率，τ
f
：荧光寿命
[0169]
<实施例2>
[0170]
对于培养细胞内的脂滴成像，进行了pc6s与市售的脂滴荧光成像试剂(lipidye、尼罗红、bodipy493/503、lipi绿)的性能比较实验。项目设定为发光强度、脂滴选择性、光稳定性、滞留性。
[0171]
在图6中示出了：向在400μm油酸存在下培养了48小时的hela细胞中，将各荧光试剂以最终浓度达到100nm的方式进行添加，培养30分钟，进行清洗后，使用倒置型荧光显微镜(ix71；日本奥林巴斯公司制)观察到的荧光成像图像(物镜：100倍油浸，激发波长：450
‑
500nm，观测波长：515
‑
565nm，lipidye的激发波长：400
‑
440nm，观测波长：＞475nm)。可知：与添加了bodipy493/503、lipi绿的hela细胞相比，添加了pc6s、lipidye、尼罗红的hela细胞的荧光强度更大。此外，就pc6s、lipidye而言，hela细胞内的脂滴能够清晰地成像，相对于此，就尼罗红而言，还观测到了从脂滴以外的细胞器发出的荧光信号。这表示尼罗红的脂滴选择性低，与过去的报告相一致。另外，lipidye是呈现绿色荧光的试剂，但是无法使用普通的绿色荧光试剂用的滤光器(在试剂主页(home page，hp)中记载有注意事项)。就lipidye而言，需要使用405nm附近的激发波长，在长时间观察中可能会对细胞产生光毒性。
[0172]
光稳定性和滞留性是在追踪脂滴的形成/融合/分解过程这种长时间测定中重要的因子。将各荧光试剂以最终浓度达到100nm的方式添加至3t3
‑
l1细胞(脂肪细胞)，培养30分钟，进行清洗后，照射成像所需的激发光(450
‑
500nm，lipidye的激发波长：400
‑
440nm)，进行了光稳定性的评价。将刚照射后设为0秒，每隔20秒获取一次成像图像，对图像的强度进行了解析。将相对于照射时间的荧光强度比(i
t
/i0)的曲线图(plot)示于图7。揭示了：与市售的试剂相比，pc6s的光稳定性最高。
[0173]
为了评价各试剂在细胞内的滞留性，将各荧光试剂以最终浓度达到100nm(lipi
‑
绿为500nm)的方式添加至3t3
‑
l1细胞(脂肪细胞)，在培养30分钟后以及对试剂清洗后，在24小时后获取了成像图像。将荧光成像图像示于图8。pc6s、lipi
‑
绿、lipidye即使在24小时后也能够进行脂滴成像，相对于此，bodipy493/503、尼罗红的荧光强度显著减少。由此示出了：pc6s、lipi
‑
绿、lipidye的细胞内滞留性高。
[0174]
将上述结果总结于表3。通过表3明确了：与市售的脂滴荧光成像试剂相比，pc6s具有更优异的特性。
[0175]
[表3]
[0176][0177]
＜实施例3＞
[0178]
示出使用了pc6s的生物体组织内脂滴和脂肪组织的荧光成像。pc6s在水(生理食盐水)中的溶解性显著低，因此难以直接溶解。此外，在将溶解于二甲基亚砜(dmso)的5mm储备溶液(stock solution)添加至生理食盐水中的情况下(按体积比计10％)，pc6s会析出，因此无法给药至小鼠。于是，将5mm储备溶液添加至含有10％牛血清白蛋白的生理食盐水中(按体积比计10％)，其结果是，pc6s的析出得以抑制。在mns
‑
nb的给药中，将dmso的储备溶液直接给药至小鼠。给药dmso有时会使小鼠休克死亡，认为本发明中的给药方法是安全性较高的方法。在此，从处于麻醉下的小鼠的尾静脉给药500μm的溶液100～200μl(50至100nmol)，使用共聚焦激光显微镜进行了荧光成像实验(激发波长：488nm，观测波长：510
‑
560nm)。在本实验中，使用了不仅能够获取荧光强度图像，还能够获取荧光寿命图像的显微镜(flim：fluorescence lifetime imaging microscope，荧光寿命显微镜)(simple
‑
tau
‑
150
‑
dx；becker&hickl)。动物实验依照群马大学的动物实验安全管理规定实施。
[0179]
已知脂肪肝小鼠模型与普通小鼠相比，肝脏内堆积有大量脂滴。在此，向小鼠(c57bl/6j)饲喂两周或十周超高脂肪胆碱缺乏甲硫氨酸减量饲料，由此制作了脂肪肝小鼠模型。在图9中示出向普通小鼠和脂肪肝小鼠模型给药100nmol的pc6s而得到的荧光强度成像图像和荧光寿命成像图像。对于饲喂普通饲料的小鼠，在肝细胞内能确认到小脂滴。另一方面，对于脂肪肝模型小鼠(两周)，在遍布整个肝脏表面成像有大脂滴，可知肝脏内有脂质堆积。进而，在饲喂十周脂肪饲料的小鼠组，不仅观测到了来自脂滴的荧光，还观测到了来自与脂滴形状不同的结构体的强荧光。可以认为，这是伴随着肝脏的纤维化，来源于巨噬细胞的细胞浸润并由此产生自体荧光。在强度成像方面，无法将脂滴鲜明地成像，但在寿命成像方面，能将自体荧光(蓝)与pc6s的荧光(橙)区别成像。
[0180]
个体内存在各种各样的脂肪组织和脂滴。使用pc6s进行了成像。在图10中示出向
小鼠(balb/cajcl)给药50nmol的pc6s而得到的皮下脂肪组织、腹部脂肪组织、骨骼肌、心肌、心脏周围脂肪组织、肾脏的荧光成像图像。心肌、心脏周围脂肪组织的成像图像是使小鼠安乐死后摘出所拍摄到的。从堆积有脂质的位置观测到了源自pc6s的荧光。特别是在肾脏中，能对分布在尿细管细胞内的小脂滴实现成像，期待今后能用作用于对糖尿病等生活习惯病和肾脏的功能障碍中的脂质的关系进行研究的工具。
[0181]
＜实施例4＞
[0182]
示出使用了pc6s的生物体组织内脂滴和脂肪组织的非剖腹成像。向裸体小鼠饲喂两周高脂肪饲料，由此制作了脂肪肝小鼠模型。从处于麻醉下的裸体小鼠的尾静脉给药pc6s(50nmol)。利用简易型体内(in vivo)成像装置(discovery(注册商标)；indec biosystem)进行了摄影(裸体小鼠为仰卧)。设定激发波长为450
‑
490nm，观测波长为520nm以上。在图11中示出裸体小鼠的非剖腹成像图像。从肝脏周边(用点线圈包围的部分)观察到了源自pc6s的荧光。
[0183]
为了确认观测到来自肝脏的荧光，进行剖腹并进行了摄影。在图12中示出裸体小鼠的剖腹成像图像。在肝脏观测到了源自pc6s的荧光。示出了：本发明的荧光成像试剂在不剖腹情况下也能使用。
[0184]
进而，本发明的荧光成像试剂能应用于未固定化的生物体试样、生物体，进行检测，但也能用于固定化的试样。在4％多聚甲醛/磷酸缓冲液中将在400μm油酸存在下培养了48小时的hela细胞固定20分钟，将pc6s以最终浓度达到100nm的方式添加，培养30分钟，进行清洗后，与实施例2同样，使用倒置型荧光显微镜获取到荧光成像图像。其结果，在固定化的hela细胞中也检测到了pc6s的荧光。
[0185]
另外，也能通过pc6s与hoechst33342、mito tracker红并用来进行多色成像。
[0186]
另外，将hela细胞在以最终浓度达到100nm的方式添加了pc6s的培养基中培养30分钟后，去除未引入到细胞内的pc6s，与实施例2同样，使用倒置型荧光显微镜获取到荧光成像图像(0小时)。在400μm油酸存在下培养了24小时，在4、8、12、24小时后获取到荧光成像图像。其结果是，实现了对脂滴逐渐形成的状态进行经时成像。
[0187]
另外，向96孔板中接种hela细胞，粘接于玻片后，向培养基中添加pc6s(最终浓度0.1μm、0.5μm、1μm、10μm、20μm、40μm、50μm)，培养了24小时。清洗后，利用细胞增殖/细胞毒性测定用套装cck
‑
8进行了细胞毒性评价。试剂添加两小时后，测定吸光度，其结果是，在任何浓度下均未确认到显著细胞毒性。
[0188]
根据上述结果，通过本发明而开发出的荧光成像试剂是能进行细胞内脂滴和活体内的脂肪组织、脂滴的成像的新型试剂。
[0189]
产业上的可利用性
[0190]
本发明能够应用于生物体试样、生物体个体的脂滴的荧光成像。