VWB-attP和φC31-attP整合酶介导的基因重组方法及在链霉菌中应用与流程

技术特征：
1.一种利用vwb-attp和φc31-attp整合酶介导的基因重组方法，其特征在于，包括步骤：(1)在链霉菌的基因组中引入至少1个外源的attb位点，获得携带有外源attb位点的链霉菌；(2)将包含(i)φc31整合酶模块和/或vwb整合酶模块、和(ii)目的基因或目的基因簇的载体引入到步骤(1)的链霉菌中，选择目标基因或目标基因簇整合到链霉菌基因组内源attb位点以及外源attb位点的链霉菌，从而获得整合入多拷贝基因或基因簇的链霉菌。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的链霉菌包括阿维链霉菌、红色糖多孢菌、林可链霉菌。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的链霉菌为红色糖多孢菌，并且所述外源的attb位点引入到红色糖多孢菌基因组的geosmin合成基因簇中，较佳地，取代该基因簇的原sace_4907基因。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，红色糖多孢菌的基因组中包含位于红色糖多孢菌基因组sace_8013的vwb整合酶所识别的内源的attb位点，较佳地，序列如seq id no:12所示。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的链霉菌为林可链霉菌，并且(i)所述外源的attb位点引入到林可链霉菌基因组的cysteate nrps基因簇中，较佳地，取代该基因簇的原slinc0744基因；和/或(ii)所述外源的attb位点引入到林可链霉菌基因组的moenomycin基因簇中，较佳地，取代该基因簇的原slinc6338基因、slinc6339基因和slinc63340基因。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的链霉菌为阿维链霉菌，并且所述外源的attb位点引入到阿维链霉菌基因组的寡霉素生物合成基因簇pks中，较佳地，取代该基因簇的原olma1-a7基因。7.一种红色糖多孢菌基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌的基因组中包括至少1个外源的attb位点，并且，所述外源的attb位点引入到红色糖多孢菌基因组的geosmin合成基因簇中，较佳地，取代该基因簇的原sace_4907基因。8.一种权利要求7所述的红色糖多孢菌基因工程菌的用途，其特征在于，用于制备携带多拷贝目的基因或目的基因簇的红色糖多孢菌工程菌。9.一种基因组中整合有多拷贝目的基因或目的基因簇的红色糖多孢菌工程菌，其特征在于，所述红色糖多孢菌工程菌的基因组中至少包括2个拷贝的位于以下位置的目的基因簇：(a)红色糖多孢菌工程菌基因组中内源attb位点所在位置，并取代该位置原有的attb位点；(b)红色糖多孢菌工程菌基因组中geosmin合成基因簇中，较佳地，取代该基因簇的原sace_4907基因。10.一种利用链霉菌高效表达目标基因或目标基因簇的方法，其特征在于，所述的方法包括：(a)以权利要求1所述的方法制备链霉菌工程菌，使链霉菌基因组中整合入多拷贝目标基因或目标基因簇；
(b)培养步骤(a)获得的链霉菌工程菌，从而高效表达目标基因或目标基因簇。

技术总结
本发明提供了一种VWB-attP和φC31-attP整合酶介导的基因重组方法及在链霉菌中应用。具体地，本发明利用VWB-attP整合酶和φC31-attP整合酶系统介导的位点特异性整合机制将这两种整合酶模块构建在同一个含有目的基因的质粒中，通过属间接合转移可快速将需要表达的目的基因以多拷贝的数量重组至链霉菌染色体的相应attB位点上。本发明的方法在阿维菌素，红霉素和林可霉素产生菌中进行了应用。红霉素和林可霉素产生菌中进行了应用。


技术研发人员：刘文 张庆林 冯俊寅 潘佳明 陈单丹 王杰
受保护的技术使用者：中国科学院上海有机化学研究所湖州生物制造创新中心
技术研发日：2020.04.30
技术公布日：2021/11/2