一种用于3D细胞球体形成容器的制作方法及培养容器与流程

本发明涉及一种细胞培养容器,更具体地说，它涉及一种用于3d细胞球体形成容器的制作方法及培养容器。

背景技术：

1、3d细胞球体培养技术可有效模拟人体体内细胞生长的三维微环境，能够真实复刻细胞增殖、分化、胞间互作及药物耐受等生物学行为，是再生医学、肿瘤药理学筛选、类器官构建、药物毒性评价等领域的核心体外研究模型。现有用于3d细胞球体培养的容器及其制备工艺普遍存在结构性技术缺陷，存在成球均一性差、光学成像干扰大、实验重复性不足、适配性有限等问题，严重制约了高精度3d细胞模型的构建与高通量药物筛选的规模化应用。

2、现有技术中，3d细胞球体的主流制备方式主要包括基质胶包裹培养、改性超低吸附容器培养及专用设备体系培养三类，均存在明显技术弊端。其中，基质胶包裹培养依托凝胶基质实现细胞三维包裹成型，但基质胶内部孔隙分布不均，易造成培养体系内氧气、营养物质传递受阻及代谢废物蓄积，导致细胞球体中心缺氧坏死、球体尺寸与形态离散度大，实验批次一致性差。同时，基质胶自身透光性能不佳且存在自发荧光干扰，无法满足高倍显微成像、动态实时观测及定量分析的使用需求，且材料成本高、操作流程复杂，不适用于高通量筛选场景。

3、常规商用超低吸附培养容器，多采用高分子表面疏水改性或等离子体粗糙化工艺制备，通过提升容器表面疏水性抑制细胞贴壁，进而诱导细胞自聚集成球。但该类制备工艺对表面粗糙度可控性差，成型后容器内壁微观平整度不足，易导致细胞聚集不均匀，最终形成的细胞球体大小不一、形态不规则，极大降低了实验数据的准确性与可靠性。同时，粗糙化改性结构易引发光学折射、成像虚影及边缘畸变，无法实现高清显微成像与精准的球体尺寸量化分析。此外，传统改性涂层与基底结合力弱，培养过程中经多次换液、培养液浸泡易出现涂层局部脱落、失效，引发细胞局部贴壁、球体解体，体系培养稳定性较差。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种表面具有超高平整度、透光性好且涂层性能稳定的一种用于3d细胞球体形成容器的制作方法及培养容器。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种用于3d细胞球体形成容器的制作方法，包括以下步骤：s1、容器基底清洁处理：选取常规聚苯乙烯材质的培养板、培养皿、矩阵板作为基底，通过无菌去离子水以及乙醇溶液进行超声清洗，从而去除基底表面的残留杂质；

3、s2、容器基底干燥处理：清洗完成的容器基底放置于无菌无尘烘箱中低温烘干，并通过低温等离子体对基底表面进行活化处理，形成培养容器，在处理完成后需要保证基底的平整度，表面无划痕凸起；

4、s3、磷酸胆碱涂层液精准配制：选取生物相容性磷酸胆碱类聚合物作为核心功能原料，搭配无水乙醇与无菌缓冲液复配，制备均质透明的功能涂层液；

5、s4、高精度平整涂覆：通过精密浸涂工艺，对预处理完成的培养容器表面进行全覆盖均匀涂覆，在培养容器表面形成厚度均一的液膜；

6、s5、干燥固化成型处理：涂覆完成的培养容器放置于恒温恒湿的无尘环境模拟设备中，先调节设备中的温度为37℃，并通过超低速平台慢摇工艺完成液膜流平定型，在定型完成后，在1h-2h的时间段内进行梯度升温至50℃-70℃，实现培养容器表面聚合物分子的充分固化；

7、s6、后处理与质控检测：在固化完成后，对培养容器进行环氧乙烷灭菌，同时对培养容器进行表面平整度检测、透光率性能检测以及细胞超低吸附性检测，若检测培养容器合格，则对当前培养容器进行出货收纳，反之，则基于不合格的性能对培养容器进行返工。

8、本发明进一步设置为：所述的步骤s3还包括涂层液的配置方法，包括以下步骤：s31、将生物相容性磷酸胆碱类聚合物溶解于无水乙醇中，形成8 mg/ml的储备液；

9、s32、对储备液进行静置，使得生物相容性磷酸胆碱类聚合物完全溶解于无水乙醇中；

10、s33、溶解完成后，通过无菌缓冲液以及无水乙醇稀释储备液至1.6mg/ml，同时无水乙醇与缓冲液的的体积比为1:1；

11、s34、对稀释完成的储备液进行静置，保证添加后的无水乙醇以及缓冲液充分溶解。

12、本发明进一步设置为：所述的步骤s4还包括以下步骤：s41、将处理完成的培养容器匀速无振动的浸入配置完成的储备液中；

13、s42、在培养容器浸入完成后，在储备液中保持静止，使得涂层液充分湿润基底表面；

14、s43、基于需要的涂层厚度，以1cm/min-30cm/min的速度匀速无振动的从储备液中拉出。

15、本发明进一步设置为：所述的步骤s5还包括以下步骤：s51、在37℃环境下，对涂覆完成的培养容器放置于恒温恒湿摇床上，并保持水平放置，保证培养容器表面液膜在重力作用下均匀分布；

16、s52、启动摇床，使得摇床以超低转速启动慢摇，使得涂层液在基底表面持续缓慢流动，消除局部厚度不均，持续运行13h；

17、s53、在低温慢摇加工完成后，对处理完成的培养容器转移至恒温无尘烘箱中，以1℃/min的速率升温至50℃，并维持30min，再以0.5℃/min升温至70℃，并持续60min；

18、s54、在固化完成后，自然冷却至室温，从而防止涂层应力开裂。

19、本发明进一步设置为：所述的步骤s6还包括以下步骤：s61、将包装好的培养容器设置于灭菌柜内部，确保环氧乙烷、热量和湿度能够充分穿透所有产品；

20、s62、在灭菌柜内设置生物指示剂，用于对灭菌效果进行检测；

21、s63、在灭菌的过程中，对灭菌柜内的各个参数进行检测，获取灭菌时间、灭菌柜内部的压力、湿度温度以及环氧乙烷的消耗量；

22、s64、在灭菌完成后，将加工完成的产品转移至检测设备中，对检测设备进行强制通风解析，持续时间为t；

23、s65、在t时间段后，对检测设备中的环氧乙烷的残留量进行检测，检测值为x，若x＞10 μg/g，则判断当前环氧乙烷残留量过高，持续进行通风，反之，则判断当前培养容器环氧乙烷残留量较少，跳至s66进行物理性能检测；

24、s66、通过轮廓仪沿培养容器表面进行线性扫描，获取培养容器的表面轮廓，同时对表面轮廓进行检测，若培养容器表面未出现颗粒或裂纹，则判断当前培养容器表面平整度合格，跳至s67继续检测，反之，则重新对培养容器进行表面涂覆；

25、s67、以未设置有涂层的同材质容器作为空白对照组，并设置对照组的透射率为100%，对涂层后的培养容器进行可见光的检测，并对培养容器的透光率进行判断，若培养容器的透光率相对于对照组的透光率≥95%，则判断当前培养容器透光率合格，跳至s68继续检测，反之，则重新对培养容器表面进行涂覆；

26、s68、对需要培养的细胞以其适应的密度接种于带涂层的培养容器内部，以适宜的的环境参数进行培养，并对细胞的形态进行检测，若细胞在培养容器内呈悬浮的紧密球状聚集，则判断当前培养容器吸附性好，反之，若巨细胞贴壁伸展或松散聚集，则判断当前培养容器吸附性差。

27、优选的，所述的步骤s66还包括表面轮廓平整度检测，包括凸起颗粒检测步骤：s661、在培养容器表面，与所述培养容器表面相平行的设有若干投射光路，所述投射光路一端为出光口，另一端为信号接收端口；

28、s662、投射光路悬于待检测培养容器表面上端，并沿待检测培养容器方向移动，在移动的过程中，信号接收端口接收光信号；

29、s663、若各个所述信号接收端口同时丢失光信号，则判断当前培养容器表面未出现凸起颗粒，反之，若其中一个或多个信号接收端口丢失光信号，则判断该投射光路对应的培养容器表面存在凸起；

30、以及裂纹检测步骤：s664、以与待检测培养容器表面相垂直的位置，设置出光口，出光口朝向培养容器方向并向培养容器方向投射网状检测光线；

31、s665、出光口上设置有图像采集装置，在投射光线的过程中，图像采集装置获取培养容器表面的光线信息；

32、s666、若培养容器表面光线出现扭曲偏折，则判断当前位置的培养容器出现凹陷裂纹，反之，则判断当前培养容器表面平整。

33、本技术还公开了一种用于3d细胞球体形成容器的制作方法制得的培养容器，所述培养容器包括安装盒体以及设置于安装盒体上方的密封盖板，所述安装盒体内沿其长度方向均匀设有若干培养腔室，各个所述培养腔室底部设有若干微腔，所述细胞沉降并聚集于围墙内形成球体。

34、通过采用上述技术方案，有益效果：1、本技术提供了一种用于3d细胞球体形成容器的制作方法，通过在容器基底表面平整涂覆有磷酸胆碱涂层液，从而能够使得细胞能够在容器基底表面形成规则球体，并且涂层后的培养容器具有高透光性，降低了光学成像的干扰性，在容器结构层面，本技术在安装盒体内沿其长度方向设置有若干培养腔室，各培养腔室底部设有若干微腔，细胞在磷酸胆碱超低吸附涂层的协同作用下自然沉降并聚集于微腔内形成规则球体，且所述培养容器表面的涂层为生物相容性磷酸胆碱类聚合物，能够使得培养容器表面具有超低吸附特性，使细胞无法贴壁而被迫聚集，同时涂层与基底结合力强、稳定性高，经多次换液和长期培养不发生脱落失效，且在涂覆完成后对容器进行干燥固化处理，使得涂层表面粗糙度趋近于0，保留了基底本体高透光性能，根本上消除了培养容器表面平整度低导致的光学折射、成像虚影等问题，在培养容器制造完成后，通过对培养容器表面光泽度检测、透光率检测以及细胞超低吸附性能检测，确保成品的物理性能、光学性能和生物学功能均达到预设标准。

35、2、进一步的，本技术通过磷酸胆碱涂层液精准配置，形成均质透明的涂层液，在配置的过程中，通过预先配置8 mg/ml的储备液并静置至完全溶解，其次通过加入无菌缓冲液和无水乙醇按照1:1的体积比稀释至1.6 mg/ml并再次静置充分溶解，该多步配制方案确保了涂层液中聚合物分子充分伸展、均匀分散，避免了传统简单配制方式中聚合物团聚、溶解不充分导致的涂层微观缺陷，同时，为了保证培养容器表面的厚度均匀，通过精密浸涂工艺，将培养容器匀速无振动的推入涂层液，使得涂层液能够充分浸润基底表面，并再次匀速对培养容器进行提出，且涂层厚度能够通过控制提拉速度精准实现，拉出速度越快，涂层厚度越薄，且放入与提出的过程中保证培养容器匀速无振动，保证液膜在基底表面自主均匀流平，形成无针孔、无褶皱、厚度均一的超薄液膜，且所述的磷酸胆碱两性分子能吸附7-8个水分子形成水墙，使细胞、蛋白质等物质无法贴附于容器表面，从而实现优异的超低吸附性能，同时mpc聚合物对合成树脂具有良好的附着力，保障了涂层的长期使用稳定性，上述配制与涂覆工艺的有机结合，使得本发明所述培养容器的涂层均匀性、厚度可控性和超低吸附性能均显著优于现有技术，为细胞球体的均一性形成提供了可靠的结构保障。

36、3、同时，在对涂层液进行干燥固化的过程中，本技术通过阶段性梯度干燥固化工艺，在保证涂层充分干燥固化的同时保证了培养容器的光学性能，在干燥固化的过程中，先将涂覆完成的培养容器在37°c恒温恒湿环境下通过超低速平台慢摇实现液膜的流平定型，通过延长流平窗口期使涂层液在基底表面充分自主流平，消除涂覆过程中可能产生的微小厚度不均，再以1°c/min的速率梯度升温至50°c维持30分钟，再以0.5°c/min升温至70°c持续60分钟，通过梯度升温避免热冲击导致的涂层应力开裂，同时确保聚合物分子链获得充分热能进行重排与交联，形成致密、稳定的功能层，固化完成后自然冷却至室温进一步防止涂层应力开裂，并且，对固化完成的培养容器进行环氧乙烷灭菌，且灭菌温度小于磷酸胆碱聚合物的热分解温度，在保证无菌的同时不会对涂层结构以及容器基材造成热损伤，且在灭菌后对产品进行强制通风解析直至环氧乙烷残留量x≤10 μg/ml，确保了产品的生物安全性。上述梯度干燥固化与灭菌工艺的协同作用，使得本发明所述培养容器的涂层致密性、基底结合力和生物安全性均达到最优平衡。

37、4、并且，本技术通过建立“表面平整度全检—透光率全检—细胞超低吸附性能批次抽检”的三重质控体系，并结合优化的培养容器微腔结构设计，实现了从物理性能到光学性能再到生物学功能的全面质量把控，相对于表面平整度检测方面，本发明通过轮廓仪沿培养容器表面进行线性扫描，获取表面轮廓并检测是否存在颗粒或裂纹，从根源上避免了传统粗糙化工艺导致的细胞聚集不均匀问题，相对于在透光率检测方面，本发明以未设置涂层的同材质容器作为空白对照组（透射率设为100%），对涂层后培养容器进行可见光范围内的透光率检测，要求培养容器透光率相对于对照组≥95%，确保了培养容器在高倍显微成像、动态实时观测及定量分析场景下的光学适用性，相对于细胞超低吸附性能检测方面，本发明以需要培养的细胞以其适应的密度接种于带涂层的培养容器内部并进行培养，通过观察细胞形态判断涂层的超低吸附性能——若细胞在培养容器内呈悬浮的紧密球状聚集则判定吸附性合格，反之若细胞贴壁伸展或松散聚集则判定吸附性差，本技术的培养容器包括安装盒体及密封盖板，安装盒体内沿长度方向均匀设有若干培养腔室，各培养腔室底部设有若干微腔，细胞自然沉降并聚集于微腔内形成球体，三重质控体系与容器微腔结构的协同作用，确保了每一批次产品在表面平整度、透光率、细胞超低吸附性能三大核心指标上均达到预设标准，为3d细胞球体的均一性形成、高清晰成像和实验数据的高度可重复性提供了全流程的质量保障。

38、5、再者，为了进一步提高细胞在培养容器内的聚合性以及可观测性，需要保证培养容器在涂覆有涂层液后，其表面平整，防止出现凹陷的裂纹或凸起的颗粒使得培养的细胞附着在裂纹或凸起表面难以聚合形成球体，从而影响观测的效果，因此，在涂层液浸涂完成后，需要保证培养容器表面的平整度，通过沿培养容器的待检测表面设置的投射光路对表面凸起进行检测，所述投射光路通过出光口生成，且出光口的设置轨迹与培养容器待检测表面的截面轨迹相匹配，投射光路朝培养容器的待检测表面移动，若培养容器的待检测表面存在凸起，则在投射光路移动的过程中，该凸起位置对应的投射光路会预先被阻挡并被信号接收端口检测，从而判断当前位置存在凸起颗粒，反之，若各个所述信号接收端口同时丢失信号，则判断出光口被培养容器阻挡，当前培养容器表面不存在凸起，同样的，通过在与培养容器的待检测表面设置有出光口，出光口垂直的投射网状检测光线至培养容器的待检测表面，若表面存在凹陷裂纹，则投射于裂纹处的光线会出现扭曲偏折，通过设置有图像采集装置对网状检测光线进行采集与检测，能够方便获取培养容器表面的平整度数据，防止培养容器表面的凹陷与凸起影响细胞培养的效果。