用于侧流免疫层析的Cu-TCPP/Au/Pt纳米酶及其制备方法和应用

本发明属于侧流免疫层析检测，具体涉及一种cu-tcpp/au/pt纳米酶及其制备方法和在侧流免疫层析中的应用。

背景技术：

1、甲胎蛋白（afp）是原发性肝癌最常用的血清肿瘤标志物，其高灵敏、快速检测对肝癌的早期筛查、疗效评估和复发监测具有重要临床价值。侧流免疫层析（lfia）因其操作简便、检测快速、成本低廉且无需复杂仪器，已成为即时检测（poct）的主流技术。然而，传统以胶体金纳米粒子（aunps）为信号标签的lfia灵敏度较低，且浓度信号响应差，容易造成假阴性或漏诊，难以进行afp的浓度监测。

2、为提高lfia灵敏度，研究者发展了具有类过氧化物酶活性的纳米酶作为信号标签。其中，贵金属粒子具有良好的酶活性，但是容易聚集，导致催化活性降低。金属有机框架（mof）因其高比表面积、易于功能化的优点，成为负载贵金属纳米粒子的理想载体。因此，开发一种mof负载的双金属纳米酶，利用其酶活性放大检测信号，并将其用于构建高灵敏lfia平台，具有重要的研究价值和临床应用前景。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种灵敏度高、操作方便的mof负载双金属纳米酶cu-tcpp/au/pt及其制备方法和在侧流免疫层析检测中的应用。

2、本发明首先提供用于侧流免疫层析的cu-tcpp/au/pt纳米酶制备方法，由二维cu-tcpp金属有机框架（mof）纳米片依次原位还原负载金和铂纳米粒子得到cu-tcpp/au/pt纳米酶，具体步骤如下：

3、（1）将铜源、中-四(4-羧基苯基)卟吩（tcpp）和表面活性剂在溶剂中混合，经溶剂热反应得到cu-tcpp纳米片；

4、（2）在此基础上，分步先后依次加入haucl4·3h2o和h2ptcl6·6h2o进行原位还原反应，得到所述cu-tcpp/au/pt纳米酶。

5、进一步地：

6、步骤（1）中，所述铜源为硝酸铜，所述表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮，所述溶剂为乙醇和n,n-二甲基甲酰胺的混合溶剂。

7、所述铜源与中-四(4-羧基苯基)卟吩（tcpp）的质量比为0.8:1~1:1（（0.8~1）:1），所述铜源与聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1:2.6~1:2.9（1: （2.6~2.9）），所述tcpp与聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1:2.4~1:2.6（1:（2.4~2.6））。

8、所述溶剂热反应的温度为70~80℃，时间为3~5小时。

9、步骤（2）中，所述原位还原反应使用的还原剂为硼氢化钠。所述haucl4·3h2o与铜源的摩尔量比为1.6:1～1.8:1（（1.6～1.8）:1），所述h2ptcl6·6h2o与铜源的摩尔量比为0.6:1～0.8:1（（0.6～0.8）:1）。

10、本发明制备的cu-tcpp mof纳米酶，其表面原位负载金纳米粒子和铂纳米粒子。该纳米酶具有优异的类过氧化物酶活性，将其作为信号标签用于侧流免疫层析试纸条检测afp，通过催化h2o2氧化aec底物产生红褐色氧化产物，实现对检测线信号的显著放大。于是：

11、本发明还提供上述cu-tcpp/au/pt纳米酶在侧流免疫层析检测中的应用。

12、具体地，提供一种用于侧流免疫层析的试纸条，该侧流免疫层析试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和pvc衬板；其中所述硝酸纤维素膜上沿层析方向依次设置有检测线和质控线；所述检测线包被有anti-afp mab2，所述质控线包被有羊抗鼠igg抗体。

13、上述侧流免疫层析试纸条由如下方法制备得到：

14、（1）将cu-tcpp/au/pt纳米酶分散液用1~3 mm碳酸钾调节ph至适宜范围，加入2~4μg anti-afp mab1，室温孵育0.5~2小时，通过静电吸附使mab1抗体偶联至纳米酶表面；加入bsa封闭未结合的活性位点0.5~2 小时，离心洗涤后，得到cu-tcpp/au/pt-mab1探针，将其重悬于保存缓冲液中，所述保存缓冲液包含5%蔗糖、1.5% bsa、1%海藻糖和0.5%吐温-20。

15、（2）将anti-afp mab2和羊抗鼠igg抗体，均为0.8~1.1 mg/ml，分别喷点于硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线，喷点量为0.8~1.2 μl/cm，于36~40℃干燥1~2小时。将样品垫用处理液浸泡后36~40℃干燥10~12小时，所述处理液为含有1.5% bsa和0.5% tetronic1307的pbs缓冲液（ph 7.4）。

16、（3）将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴于pvc衬板上，相邻部分重叠约2~3 mm，组装后切成宽度为3~4 mm的试纸条，干燥保存。

17、本发明提供的上述侧流免疫层析试纸条检测afp的操作流程如下：

18、（1）在以下比色检测条件下，将4~6 μl cu-tcpp/au/pt-mab1探针（1.68mg/ml）与94~96 μl待测样品溶液混合，滴加至试纸条的样品垫上，室温层析反应14~16分钟，观察检测线和质控线的显色情况，进行比色检测。

19、（2）为进一步提高灵敏度，比色检测后，在以下催化检测条件下，将6~8 μl催化反应溶液滴加至检测线和质控线区域，所述催化反应溶液由醋酸盐缓冲液（ph 3.5~4.5）、0.2~0.4 % h2o2和20 mm aec按体积比（6~8:（0.8~1.2）:1混合而成。室温反应2~4分钟后，再次观察检测线和质控线的显色情况，通过催化信号放大进行高灵敏检测。

20、与现有技术相比，本发明的技术特点和功能优势主要有：

21、本发明以二维cu-tcpp mof纳米片为载体，在其表面原位负载金纳米粒子和铂纳米粒子，制备得到cu-tcpp/au/pt纳米酶。该纳米酶具有优异的类过氧化物酶活性，将其作为信号标签用于侧流免疫层析试纸条检测afp，通过催化h2o2氧化aec底物产生红褐色氧化产物，实现对检测线信号的显著放大。本发明的试纸条兼具比色信号和催化信号两种信号输出方式，比色lfia下肉眼可视检出限为5 ng/ml，催化信号肉眼可视检出限低至0.5 ng/ml，催化lfia计算检出限为0.25 ng/ml，线性范围为0.5 ~ 500 ng/ml。本发明提供的检测方法具有操作简便、灵敏度高、成本低廉的优点，适用于临床即时诊断和基层医疗检测。

1.一种用于侧流免疫层析的cu-tcpp/au/pt纳米酶的制备方法，其特征在于，由二维cu-tcpp金属有机框架（mof）纳米片依次原位还原负载金和铂纳米粒子得到cu-tcpp/au/pt纳米酶，具体步骤如下：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述铜源为硝酸铜，所述表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮，所述溶剂为乙醇和n,n-二甲基甲酰胺的混合溶剂；所述溶剂热反应的温度为70~80℃，时间为3~5小时。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述铜源与中-四(4-羧基苯基)卟吩（tcpp）的质量比为0.8:1~1:1，所述铜源与聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1:2.6~1:2.9，所述tcpp与聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1:2.4~1:2.6。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述原位还原反应使用的还原剂为硼氢化钠。

5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述haucl4·3h2o与铜源的摩尔量比为1.6:1～1.8:1，所述h2ptcl6·6h2o与铜源的摩尔量比为0.6:1～0.8:1。

6.一种由权利要求1-5之一所述制备方法得到的cu-tcpp/au/pt纳米酶，其表面原位负载金纳米粒子和铂纳米粒子；该纳米酶具有优异的类过氧化物酶活性，将其作为信号标签用于侧流免疫层析试纸条检测甲胎蛋白（afp），通过催化h2o2氧化aec底物产生红褐色氧化产物，实现对检测线信号的显著放大。

7.如权利要求6所述的cu-tcpp/au/pt纳米酶在侧流免疫层析中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括制备一种基于cu-tcpp/au/pt纳米酶的侧流免疫层析试纸条，所述试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和pvc衬板；其中所述硝酸纤维素膜上沿层析方向依次设置有检测线和质控线；所述检测线包被有anti-afp mab2，所述质控线包被有羊抗鼠igg抗体。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述侧流免疫层析试纸条由如下方法制备得到：

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述侧流免疫层析试纸条检测afp的操作流程如下：