一种三亚乙基二胺双阳离子嵌入的混合模式色谱固定相及其制备方法

本发明属于液相色谱分离材料及固定相，具体涉及一种三亚乙基二胺双阳离子嵌入的混合模式色谱固定相及其制备方法。

背景技术：

1、混合模式色谱(mixed-mode chromatography, mmc)是集多种分离机理于一体的色谱分离技术，可在一根色谱柱上同时实现两种或多种分离模式，能够有效适配复杂样品体系的分离分析需求，现已成为复杂体系精准分离分析的核心技术手段。随着待分析样品（如药物代谢物、环境污染物、复杂中药提取物及蛋白质组学样品等）日益复杂，对具有多重作用机理、高选择性及高稳定性的新型固定相的需求愈发迫切。

2、现阶段商品化主流色谱固定相多为单一分离模式结构，应用局限性较为突出。。常规反相色谱固定相（如c18）主要依靠疏水相互作用，对强极性或离子型化合物的保留较弱，常需添加离子对试剂，易造成系统污染；而亲水相互作用色谱（hilic）固定相表面化学性质相对单一，对多组分、多性质复杂样品的选择性调控能力不足，难以满足复杂体系的高效分离需求。

3、据此，含有季铵盐结构的固定相在混合模式设计中展现出独特优势，其表面带正电的季铵阳离子可提供稳定的离子交换和静电作用，能够有效弥补单一疏水、亲水分离模式的缺陷。三亚乙基二胺（以下简称dc）作为一种对称的叔胺结构，具有空间饱满、形成季铵盐后电荷分布均匀等特点，在多功能色谱固定相改性领域具备显著应用优势。目前，尚无技术可通过精准分子设计，将三亚乙基二胺双阳离子的极性/静电作用、长链烷基的疏水作用、苯环的π-π堆叠作用以及五氟苯基的偶极作用、氢键受体特性有机整合，开发出多机理互补，兼顾极性、非极性、芳香族氟等不同类型化合物的高效分离的混合模式固定相。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是：针对现有商品化色谱固定相表面化学性质相对单一导致的对多组分、多性质复杂样品的选择性调控能力不足，难以满足复杂体系高效分离需求的问题，本发明提供一种三亚乙基二胺双阳离子嵌入的混合模式色谱固定相的制备方法，通过本发明制备方法得到的混合模式色谱固定相能够实现对烷基苯类化合物、多环芳烃类化合物、取代苯类化合物及难分离位置异构体的差异化选择性分离，从而满足复杂体系高效分离的需求。

2、为了解决上述问题，本发明采取以下技术方案：

3、一方面，本发明提供一种三亚乙基二胺双阳离子嵌入的混合模式色谱固定相，所述混合模式色谱固定相以球形硅胶为基体，通过共价键合方式将三亚乙基二胺双阳离子中心以及疏水/芳香族功能单元固定于硅胶表面；所述混合模式色谱固定相结构通式如下：

4、

5、其中，silica gel为微球形硅胶，r为十八烷基-c18h37、苯甲基-ch2c6h5或五氟苯甲基-ch2c6f5。

6、根据上述的三亚乙基二胺双阳离子嵌入的混合模式色谱固定相，所述混合模式色谱固定相中含有碳元素质量百分比为4.0～12.0%、氮元素质量百分比为0.5～1.5%。

7、另一方面，本发明提供一种上述三亚乙基二胺双阳离子嵌入的混合模式色谱固定相的制备方法，包括以下步骤：

8、1）单季铵盐化合物a的制备：将三亚乙基二胺与带有疏水/芳香族功能基团r的卤代烃在极性非质子有机溶剂中进行反应，得到单季铵盐化合物a；

9、2）氯丙基键合硅胶的制备：将真空干燥后的微球形硅胶与硅烷偶联剂加入有机溶剂中进行加热反应，得到氯丙基键合硅胶；

10、3）混合模式色谱固定相的制备：将步骤2）所得氯丙基键合硅胶分散于有机溶剂中，然后加入步骤1）所得单季铵盐化合物a和催化剂，在氮气气氛下进行加热回流反应，得到嵌入三亚乙基二胺双阳离子的混合模式色谱固定相。

11、根据上述三亚乙基二胺双阳离子嵌入的混合模式色谱固定相的制备方法，步骤1）中极性非质子有机溶剂为乙腈、无水乙醇、乙酸乙酯、丙酮和n,n-二甲基甲酰胺中的至少一种；所述带有疏水/芳香族功能基团r的卤代烃试剂为1-溴十八烷、溴化苄或五氟溴苄。

12、根据上述三亚乙基二胺双阳离子嵌入的混合模式色谱固定相的制备方法，所述三亚乙基二胺与卤代烃试剂二者加入的摩尔比为 1：1；所述极性非质子有机溶剂的用量为每g反应原料加入5～20ml有机溶剂。

13、根据上述三亚乙基二胺双阳离子嵌入的混合模式色谱固定相的制备方法，其特征在于：步骤1）中所述反应时控制反应温度为10～80℃、反应时间为12～24h。

14、根据上述三亚乙基二胺双阳离子嵌入的混合模式色谱固定相的制备方法，步骤2）中所述微球形硅胶的粒径为3～10μm、孔径为8～30 nm；所述硅烷偶联剂为3-氯丙基三甲氧基硅烷或3-氯丙基三乙氧基硅烷；所述有机溶剂为无水甲苯、无水二甲苯和无水正己烷中的至少一种。

15、根据上述三亚乙基二胺双阳离子嵌入的混合模式色谱固定相的制备方法，所述微球形硅胶与硅烷偶联剂之间加入的质量比为1：0.3～1.0；所述微球形硅胶与有机溶剂之间的料液比为1g：10～20ml；

16、所述真空干燥时温度为60～100℃、时间为4～12h；所述反应时温度为80～120℃、反应时间为6～12h。

17、根据上述三亚乙基二胺双阳离子嵌入的混合模式色谱固定相的制备方法，步骤3）中所述有机溶剂为无水乙腈、无水甲苯和无水乙醇中的至少一种；所述催化剂为碘化钾或碘化钠。

18、根据上述三亚乙基二胺双阳离子嵌入的混合模式色谱固定相的制备方法，步骤3）中所述氯丙基键合硅胶与有机溶剂之间的料液比为1g：12～20ml；所述氯丙基键合硅胶与单季铵盐化合物a之间的质量比为1：0.2～0.6；所述氯丙基键合硅胶与催化剂之间的质量比为1：0.002～0.006；

19、所述加热回流反应时温度为70～90℃、反应时间为24～72h。

20、本发明三亚乙基二胺双阳离子嵌入的混合模式色谱固定相在色谱分离中的应用。

21、本发明混合模式色谱固定相可广泛应用于液相色谱分离检测领域，实现多类复杂样品的高效分离分析。

22、本发明三亚乙基二胺双阳离子嵌入的混合模式色谱固定相，可适配多种色谱分离模式，具体包括反相色谱分离模式、亲水相互作用色谱分离模式及离子交换色谱分离模式，多机理协同作用，大幅拓宽了样品适用范围。

23、其中，在亲水作用色谱模式下，依靠三亚乙基二胺双阳离子的强极性、静电作用及氢键作用，实现对核苷碱基类强极性化合物的高效保留与分离；在反相色谱模式下，依靠十八烷基疏水骨架、苯甲基/五氟苯甲基的疏水作用、π-π堆叠作用、偶极作用，实现对烷基苯类化合物、多环芳烃类化合物、取代苯类化合物及难分离位置异构体的差异化选择性分离。

24、本发明的积极有益效果：

25、1、针对现有商品化色谱固定相分子设计单一、功能修饰基团匮乏，仅具备单一分离作用机理，无法实现疏水作用、π-π作用、静电离子作用、偶极作用及氢键作用的多机理互补协同，难以同时适配极性、非极性、芳香族及异构化合物的高效分离；同时传统单一模式固定相存在极性物质保留弱、异构体选择性差、需添加离子对试剂、色谱体系污染风险高、稳定性欠佳的技术缺陷。本发明通过分子结构的精准设计，以高稳定性球形硅胶为基体，在硅胶表面共价键合三亚乙基二胺双阳离子功能中心，并连接十八烷基、苯甲基、五氟苯甲基三类疏水/芳香功能单元，构建了一类嵌入双阳离子基团的反相/混合模式色谱固定相，即开发出了一种多机理互补，兼顾极性、非极性、芳香族氟等不同类型化合物的高效分离的混合模式固定相，从而实现了多分离机理的互补协同。因此，本发明解决了现有色谱固定相表面化学性质相对单一导致的对多组分、多性质复杂样品的选择性调控能力不足，难以满足复杂体系高效分离需求的问题。

26、2、本发明先通过三亚乙基二胺与对应卤代烃试剂发生季铵化反应制备单季铵盐中间体；再对球形硅胶进行氯丙基硅烷化改性得到功能化键合基底；最后通过固液界面亲核取代反应，将单季铵盐中间体共价接枝于改性硅胶表面，精准调控固定相碳、氮元素含量，获得结构稳定、功能可控的双阳离子嵌入型混合模式色谱固定相。由此，本发明构建了一类嵌入双阳离子基团的反相/混合模式色谱固定相，实现了多分离机理的互补协同；本发明混合模式色谱固定相可广泛应用于液相色谱分离检测领域，实现多类复杂样品的高效分离分析。

27、3、本发明技术方案中，双阳离子结合可调控的反相分离基团复合结构设计，实现了多分离机理互补协同。本发明突破了传统反相液相色谱固定相功能单一的局限，在硅胶表面同时引入三亚乙基二胺双阳离子中心与三类疏水/芳香功能单元：双阳离子中心可提供稳定的静电离子交换作用与亲水氢键作用；长链十八烷基提供强疏水相互作用；苯甲基提供π-π堆叠特异性识别作用；五氟苯甲基提供独特的偶极相互作用、氟-氟相互作用及氢键受体作用。多种作用机理相互协同、互为补充，打破了单一反相、亲水或离子交换固定相的应用局限，可同时适配极性、非极性、芳香族、含氟及异构化合物的分离，因此适用范围大幅提升。

28、4、本发明技术方案工艺参数精准可控，产物结构均匀稳定、耐受性优异，可批量制备。

29、本发明通过系统性工艺优化，精准限定固定相碳元素质量百分比，可稳定调控功能基团接枝密度，使功能位点分布均匀适中。同时本发明采用硅烷化共价键合方式完成功能分子与硅胶基体的接枝改性，避免功能基团脱落、流失问题，大幅提升材料化学稳定性与溶剂耐受性。经实验验证，利用本发明混合模式色谱固定相制备的固定相色谱柱可耐受连续30h流动相持续冲洗，目标分析物保留无明显漂移、峰形良好、分离性能无衰减，使用寿命显著优于常规改性固定相。此外，本发明所采用的季铵化反应、硅烷化键合反应工艺成熟、反应条件温和、原料易得、无高危复杂工序，整体制备过程参数可控、批次稳定性好，可稳定复刻高性能固定相填料，具备良好的工业化生产与规模化推广前景。

30、5、对复杂难分离样品具有优异的选择性与分离效果：

31、依托多重特异性相互作用，本发明固定相对各类复杂样品展现出极佳的分离性能，可高效保留并分离核苷碱基类强极性小分子化合物，解决了传统c18固定相对极性物质保留弱、需添加离子对试剂的行业痛点；同时对烷基苯、多环芳烃等疏水化合物具有良好的疏水保留能力，尤其对常规色谱难以分离的芳香族位置异构体，可依靠π-π作用、偶极差异实现高效差异化分离，分离分辨率显著提升。