一种磁性壳聚糖固定化木聚糖酶及其在纸浆打浆中的应用

本发明涉及造纸生物，特别涉及一种磁性壳聚糖固定化木聚糖酶及其在纸浆打浆中的应用。

背景技术：

1、纸浆机械打浆通过纤维润胀、分丝帚化、切断及细小纤维形成，用来提高纤维间结合面积和成纸强度，但机械打浆耗能较高。木聚糖酶能够选择性水解纸浆纤维表面的部分木聚糖，改善纤维润胀和后续打浆适应性，因此被用于纸浆预处理或生物助磨。

2、现有技术已经公开了利用戊二醛在磁性壳聚糖微球表面固定木聚糖酶或含木聚糖酶的酶制剂，并用于纸浆预处理后再进行pfi打浆，也公开了利用磁场作用将磁性固定化木聚糖酶从混合产物中回收。这说明木聚糖酶助磨、磁性载体固定化和磁分离回收分别具有可行性。

3、然而，磁性固定化木聚糖酶在纸浆中面临相反的界面需求：打浆时需要接近纤维表面，以便木聚糖酶接触并水解纤维表面的木聚糖；打浆结束后又需要尽快脱离纤维，以便磁回收。若固定化酶与纤维的亲和作用在回收阶段仍然较强，固定化酶就容易被纤维吸附或被纤维网络夹带。即使其中含有fe3o4，外加磁场仍需同时克服界面吸附和机械夹带，可能造成固定化酶回收率降低、纸页铁含量增加以及跨批助磨效果衰减。因此，需要一种能够在打浆和回收两个阶段切换界面状态的方法，在提高固定化木聚糖酶与纤维有效接触的同时，降低打浆后的载体回收阻力。

技术实现思路

1、本发明提供了一种磁性壳聚糖固定化木聚糖酶及其在纸浆打浆中的应用，利用“亲纤维催化-电荷反转脱纤维-磁分离”的时序界面切换方法，使磁性固定化木聚糖酶在打浆过程中尽可能接近纤维表面，以最大程度发挥催化水解作用，在打浆结束后主动脱离纤维并被磁回收，从而实现磁性壳聚糖固定化木聚糖酶的高效催化和回收，并保证回收后的酶活。本发明具体通过以下技术实现。

2、本发明提供了一种利用磁性壳聚糖固定化木聚糖酶进行纸浆打浆的方法，包括以下步骤：

3、将磁性固定化木聚糖酶加入纸浆中，调节磁性固定化木聚糖酶的表面电位为正值，进行打浆，直至达到目标打浆度；

4、打浆结束后，调节磁性固定化木聚糖酶的表面电位为负值，施加磁场，分离所述磁性固定化木聚糖酶；

5、所述磁性固定化木聚糖酶由内至外依次包括磁性内核和壳聚糖层，还包括结合在所述壳聚糖层表面的木聚糖酶；

6、所述壳聚糖层所用的壳聚糖具有用于发生质子化和去质子化的氨基，以及发生电离的羧甲基。

7、普通的壳聚糖在酸性或弱酸性条件下带正电，容易与带负电的纸浆纤维发生静电吸附。现有的磁性固定化酶技术通常通过提高载体的磁化强度，或增加外加磁场强度来改善回收，尚未发现有针对“在催化阶段需要磁性固定化木聚糖酶亲纤维、回收阶段需要磁性固定化木聚糖酶脱纤维”，主动改变磁性固定化木聚糖酶-纤维界面状态的现有技术。

8、本发明基于纸浆纤维表面电位为负值的现象，采用的具有氨基（用于发生质子化和去质子化）和羧甲基（用于发生电离）的壳聚糖，通过调节磁性固定化木聚糖酶在不同阶段的表面电位，实现其与纸浆纤维的接近和远离。在打浆阶段，磁性固定化木聚糖酶的表面电位为正值，壳聚糖层中的部分氨基“质子化”，使磁性固定化木聚糖酶和纸浆纤维异号电荷相吸，促进磁性固定化木聚糖酶接近“纤维-水”界面，在机械作用下持续暴露新的纤维表面和木聚糖位点，并更新磁性固定化木聚糖酶外部液膜，最终提升磁性固定化木聚糖酶对机械打浆的助磨效果。

9、在打浆结束后，调节磁性固定化木聚糖酶表面电位从正值转变成负值，壳聚糖层中的部分氨基“去质子化”，且羧甲基进一步电离，使磁性固定化木聚糖酶和仍呈负电的纸浆纤维从异号电荷相吸转变成同号电荷相斥。磁性固定化木聚糖酶从纸浆纤维表面解吸或松脱。施加外磁场或高梯度磁场后，已经脱离纸浆纤维的磁性固定化木聚糖酶就能被轻松捕集，从而提高磁性固定化木聚糖酶的质量回收率和酶活力回收率，降低纸浆产物中的纸页总铁含量及磁性固定化木聚糖酶来源净增铁量。

10、通过上述方法回收的磁性固定化木聚糖酶可用于下一批纸浆打浆。具体而言，捕集获得的磁性固定化木聚糖酶可以先在第二ph值的水相中洗涤，再用缓冲液（例如取10ml，ph 5.4，20 mmol/l的乙酸钠缓冲液）平衡恢复（例如25℃、100 rpm恢复10 min）至第一ph值，使磁性固定化木聚糖酶的表面电位为正值，然后用于下一批纸浆的同程机械打浆。

11、本发明提供的上述纸浆打浆的方法，在打浆前不需要设置独立的酶预处理步骤及预处理后的洗涤步骤。磁性固定化木聚糖酶自打浆开始，直至达到目标打浆度的全过程均留在浆料中。整个打浆过程无需额外加入纤维素酶，其目的在于利用木聚糖酶对纤维表面木聚糖的选择性作用获得助磨效果，同时降低纤维素主链水解和纤维强度损失风险。回收的磁性固定化木聚糖酶在不补加新磁性固定化木聚糖酶的条件下，可以连续用于至少5批纸浆。

12、进一步地，调节所述磁性固定化木聚糖酶的表面电位为+5～+17 mv，打浆结束后调节所述磁性固定化木聚糖酶的表面电位为-29～-13 mv。

13、ph调节是改变磁性固定化木聚糖酶表面电位正负值的具体手段。表面电位的正负值状态是控制其亲纤维或脱纤维界面行为的功能参数。更进一步地，通过调节纸浆体系至第一ph值使所述磁性固定化木聚糖酶的表面电位为正值，打浆结束后通过调节纸浆体系至第二ph值使所述磁性固定化木聚糖酶的表面电位为负值。

14、具体地，所述第一ph值为5.2-5.7，所述第二ph值比所述第一ph值高至少2.4个ph单位。例如，所述第二ph值为8.1-8.7。

15、进一步地，所述磁性固定化木聚糖酶的粒径d50为70-80 μm，饱和磁化强度为19.0-24.5 emu/g。可选地，磁性固定化木聚糖酶采用63-100 μm筛分级分筛选获得。

16、进一步地，以纸浆的绝干浆的质量计，所述磁性固定化木聚糖酶的加入量为17-23u/g。

17、更进一步地，所述纸浆的质量浓度为9%-11%。

18、进一步地，打浆的温度为48-56℃。

19、进一步地，所述目标打浆度为38-42°sr。

20、进一步地，施加磁场前，将打浆产物体系的质量浓度稀释至1.8%-2.4%。

21、进一步地，制备所述磁性固定化木聚糖酶时，磁性内核和壳聚糖的投料质量比为1:(1.65-2.05)。

22、更进一步地，所述磁性内核和壳聚糖的投料质量比为1:1.85。

23、进一步地，所述壳聚糖层所用的壳聚糖为n,o-羧甲基壳聚糖。

24、更进一步地，所述n,o-羧甲基壳聚糖的羧甲基取代度为0.50-0.68。

25、可选地，本发明选用的磁性固定化木聚糖酶中，磁性内核为fe3o4磁性内核；选用的木聚糖酶为内切-1,4-β-木聚糖酶。

26、本发明选用的磁性固定化木聚糖酶，采用本领域常规的技术手段即可制备而成，也可自行研究特殊的制备方法，只要实现本发明提供的上述磁性固定化木聚糖酶的具体结构即可。

27、例如，可以将fe3o4磁性内核分散在壳聚糖水相中包埋交联，再通过戊二醛将壳聚糖层与木聚糖酶共价结合后制备而成。具体制备方法可选择为：

28、（1）将fe3o4磁性内核分散于质量分数1%-3%的壳聚糖水相中；

29、（2）将所述水相体系加入含span-80的液体石蜡中，进行反相悬浮，以有效浓度0.5%-1.5%的戊二醛在20-30℃交联1.5-3 h，获得磁性壳聚糖微球；

30、（3）用质量分数0.5%-1.5%的戊二醛在20-30℃活化磁性壳聚糖微球1-3 h；

31、（4）将活化后的磁性壳聚糖微球与木聚糖酶在ph 4.6-5.0，20-30℃的条件下固定化反应4-8 h，得到磁性固定化木聚糖酶。

32、可选地，本发明选用的纸浆为漂白针叶木硫酸盐浆。

33、需要说明的是，本发明提供的纸浆打浆的方法并不限于漂白针叶木硫酸盐浆。漂白针叶木硫酸盐浆的纤维较长，对纸页强度的贡献相对更明显；其纤维表面通常带负电并含有可供木聚糖酶作用的木聚糖，适合作为实验室中用于验证亲纤维催化、电荷反转脱纤维和磁回收的纸浆体系。

34、纸浆所含的木聚糖含量、细小纤维含量、灰分及阴离子杂质会影响酶作用位点、固定化酶吸附和纤维网络夹带程度，因此更换浆种时应重新校准酶加入量、ph窗口及磁回收条件。但是在用于相同类型的纸浆打浆的前提下，采用本发明的方法能够获得更高的助磨效率，更高的磁性固定化木聚糖酶质量回收率和活力回收率。

35、可选地，施加磁场进行磁捕集的时间为1-5 min。

36、可选地，采用磁体或磁性不锈钢丝网组成的高梯度磁场，捕集磁性固定化木聚糖酶。

37、与现有技术相比，本发明的有益之处在于：

38、1、通过壳聚糖的羧甲基取代度、磁性固定化木聚糖酶表面电位，构成面向纸浆工况的界面参数窗口，而不是单纯提高磁化强度。在等初始酶活条件下，通过纸浆纤维表面定位及机械作用下的传质强化，使磁性固定化木聚糖酶超过游离木聚糖酶的实际助磨效率。

39、2、与采用相同的磁性固定化木聚糖酶但未调节磁性固定化木聚糖酶表面电位的方法相比，在对第一批纸浆的助磨效果基本相当的情况下，提高了打浆后磁性固定化木聚糖酶的质量回收率和活力回收率；质量回收率一般不低于83%。同一批磁性固定化木聚糖酶经过5批打浆后，第5批的助磨效果相对于第1批的保持率不低于65%。这显著降低了磁性固定化木聚糖酶被纸浆纤维夹带造成的纸页总铁含量及磁性固定化木聚糖酶来源净增铁量，使得最终纸页总铁含量一般不高于120 mg/kg（以绝干纸质量计），减缓了跨批使用过程中因磁性固定化木聚糖酶质量损失造成的助磨性能衰减。

40、3、整个打浆过程不加入纤维素酶，降低了因纤维素主链水解导致纤维强度损失的风险。