一种在炎性环境中稳定性和抑制功能提高的诱导性调节型T细胞及其制备方法与应用

本发明属于生物，涉及一种在炎性环境中稳定性和抑制功能提高的诱导性调节型t细胞及其制备方法与应用。

背景技术：

1、调节型t细胞（regulatory t cells, tregs）是维持机体免疫稳态的关键细胞亚群，其特征性表达转录因子foxp3（forkhead box p3）。treg细胞可通过接触依赖性机制（如ctla-4、lag-3）和分泌抑制性细胞因子（如il-10、tgfβ）等方式来抑制效应t细胞（teff）的活化与增殖，从而防止自身免疫反应的发生。因此，基于treg细胞的过继性免疫治疗（adoptive cell therapy, act）被认为是治疗自身免疫性疾病和移植物抗宿主疾病（gvhd）的最具前景的策略之一。根据来源不同，treg主要可分为胸腺来源的天然调节性t细胞（ntregs）和外周/体外诱导产生的调节性t细胞（induced regulatory t cell，itregs）。虽然ntreg稳定性较好，但在人外周血中丰度极低（仅占cd4+ t细胞的5%-10%），且难以分离获得高纯度的抗原特异性群体，体外扩增倍数有限，这极大地限制了其临床应用的可及性。

2、相比之下，itreg是指在体外通过抗原刺激，并在tgf β和il-2等细胞因子存在的条件下，由初始cd4+ t细胞（naïve cd4+ t cells）分化诱导而来的treg细胞。itreg具有巨大的临床应用潜力：即来源丰富，初始t细胞易于从患者或供者外周血中大量获取；然而，尽管itreg在制备工艺上具有优势，但其在临床转化中面临着一个致命的瓶颈--表型不稳定性（instability）与功能可塑性（plasticity）。

3、研究表明，foxp3作为treg细胞的“主调节因子”，其持续表达是维持treg功能的必要条件。与ntreg不同，体外诱导的itreg其foxp3基因保守非编码序列2（cns2/tsdr）区域往往处于高度甲基化状态，这意味着其foxp3的表达在表观遗传学层面是不稳定的。

4、自身免疫性疾病的病灶组织通常处于强烈的炎症环境（inflammatory milieu），富含着il-6、il-1β、il-21和tnf-α等促炎细胞因子。大量研究证实，促炎细胞因子是破坏itreg稳定性的关键因子。在促炎细胞因子存在的条件下，stat3信号通路被过度激活，这不仅会直接抑制foxp3的表达，还会诱导th17细胞的关键转录因子rorγt（retinoic acidreceptor-related orphan receptor gamma t）的表达。这种转录因子的失衡会导致itreg发生“转分化”（trans-differentiation），即原本具有免疫抑制功能的treg细胞丢失foxp3，转变为分泌il-17等致炎因子的th17样细胞（ex-tregs）。这种转化导致回输的itreg在失去治疗作用的同时，反而有可能变为促炎型免疫细胞，加剧了局部的炎症反应。因此，如何使itreg在强炎症微环境中长期稳定地维持foxp3表达及其抑制功能，是本领域亟待解决的关键技术难题。

5、针对itreg体外培养的不稳定性问题，现有技术主要尝试了以下几种策略，但均存在一定局限性：（1）药物辅助诱导策略：在培养基中添加雷帕霉素（rapamycin）、全反式维甲酸（atra）或维生素c等小分子化合物。虽然这些药物能在一定程度上通过调节mtor通路或tet酶活性来促进foxp3表达，但这种作用通常是暂时且可逆的。一旦细胞脱离体外培养体系进入体内复杂的炎症环境，药物效应迅速消退，itreg仍面临转化风险；（2）表观遗传修饰策略：使用dna甲基转移酶抑制剂（如5-氮杂胞苷）处理细胞，试图模拟ntreg的tsdr去甲基化状态。然而，这类药物具有普遍的非特异性作用，会导致全基因组范围内的低甲基化，引发基因组不稳定，具有潜在的致瘤风险和细胞毒性等安全性问题；（3）基因敲除策略：利用crispr/cas9技术敲除某些负向调控因子。虽然敲除某些基因可以提升稳定性，但也可能破坏t细胞正常的生理代谢或增殖能力，导致细胞在体内的存活时间缩短（persistence降低）；（4）基因稳定表达策略：通过在itreg中强制表达特定的“稳定因子”或“转录调控因子”，以期在细胞内部建立抗炎性信号干扰的强健网络。目前最直接的做法是稳定表达foxp3本身。然而，研究表明该策略并未解决itreg对tgf-β外源供给的依赖性，细胞一旦脱离含tgf-β的培养环境，foxp3的表达水平会随时间迅速衰减。

6、鉴于上述现有技术存在的局限性，特别是以foxp3为代表的稳定表达策略在长期稳定性、炎症环境耐受性及外源tgf-β依赖性等方面的不足，本领域亟需开发一种不依赖外源tgf-β，能够在炎性环境中长期稳定维持itreg谱系特征的工程化改造方案。

技术实现思路

1、本发明的目的就是为了克服现有技术无法使itreg在炎性环境中长期稳定地维持foxp3表达及其抑制功能，从而提供一种在炎性环境中稳定性和抑制功能提高的调节型t细胞及其制备方法与应用。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、本发明的技术方案之一为提供一种表达组成型激活转化生长因子β受体1（catgfbr1）的诱导性调节型t细胞，所述表达组成型激活转化生长因子β受体1的诱导性调节型t细胞可提高其在炎性环境中的稳定性和抑制功能。

4、在一些具体实施方式中，所述组成型激活转化生长因子β受体1的氨基酸序列如seq id no.1所示，其编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

5、在一些具体实施方式中，所述表达组成型激活转化生长因子β受体1的诱导性调节型t细胞还过表达一种或多种细胞因子、转录因子与表面分子、归巢分子、识别疾病部位或移植器官特异性靶标的靶向分子，

6、所述细胞因子选自il-2、il-10和il-35中的任意一种或多种；

7、所述转录因子与表面标记分子选自foxp3、cd25、cd39、pd-l1和ctla-4中的任意一种或多种；

8、所述归巢分子选自ccr1、ccr2、ccr3、ccr4、ccr5、ccr6、ccr7、ccr8、ccr9、ccr10、cxcr1、cxcr2、cxcr3、cxcr4、cxcr5、cxcr6和cx3cr1中的任意一种或多种；

9、所述靶向分子选自嵌合抗原受体分子或组织特异性受体的配体。

10、在本发明中，所述归巢分子为促进treg在体内向疾病部位趋化，提升效果。

11、本发明为提供了一种基于组成型激活转化生长因子-βⅰ型受体（catgfbr1）稳定表达的itreg细胞稳定性调控策略。该策略通过在itreg细胞内建立不依赖外源配体的持续性tgf-β信号传导，激活foxp3上游的tgf-β/smad信号轴，从而在转录层面维持foxp3的稳定表达，而非采用传统途径直接过表达foxp3蛋白。

12、本发明的技术方案之二为提供一种如上述技术方案之一所述的表达组成型激活转化生长因子β受体1（catgfbr1）的诱导性调节型t细胞的制备方法，通过病毒转染法将组成型激活转化生长因子β受体1的编码基因转染至诱导性调节型t细胞中得到。

13、在一些具体实施方式中，所述病毒转染法包括如下步骤：

14、s1、将如seq id no.2所示的组成型激活转化生长因子β受体1的编码基因与病毒载体重组连接，得到病毒重组质粒；

15、s2、将s1步骤得到的病毒重组质粒转染至hek293t细胞中，收集含有病毒的上清液；

16、s3、将s2步骤得到的含有病毒的上清液、诱导性调节型t细胞、诱导培养基共培养，使得诱导性调节型t细胞表达组成型激活转化生长因子β受体1。

17、在一些具体实施方式中，s1步骤，所述病毒载体选自慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、rna病毒载体、eb病毒载体、杆状病毒载体、噬菌体载体和动物病毒载体中的任意一种。

18、在一些具体实施方式中，s3步骤，所述诱导培养基包括il-2、雷帕霉素、tgfβ；

19、在共培养的72 h后，移除所述诱导培养基中的tgfβ继续培养。

20、本发明的技术方案之三为提供一种如上述技术方案之一所述的表达组成型激活转化生长因子β受体1的诱导性调节型t细胞在制备自身免疫性疾病的治疗和/或器官移植抗排斥治疗和/或细胞移植抗排斥治疗的药物中的应用。

21、在一些具体实施方式中，所述的自身免疫病包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力、炎症性肠病、i型糖尿病、自身免疫性肝炎、多发性神经炎、原发性血小板紫癜、自身免疫性溶血性贫血等。

22、本发明的技术方案之四为提供一种用于自身免疫性疾病的治疗和/或器官移植抗排斥治疗和/或细胞移植抗排斥治疗的药物，包括如上述技术方案之一所述的表达组成型激活转化生长因子β受体1的诱导性调节型t细胞。

23、在一些具体实施方式中，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂和/或佐剂。

24、本发明药物可单独或与其他药物组合使用。

25、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

26、（1）本发明将表达catgfbr1的naive cd4+ t诱导itreg，很好的维持了诱导后的catgfbr1-itreg细胞（简称“cat-itreg”）脱离培养体系后的表型及功能的稳定性，诱导出的cat-itreg相比较传统诱导的itreg有更强的体内免疫抑制功能。

27、（2）本发明通过使诱导型调节性t细胞（itreg）稳定表达catgfbr1，实现不依赖外源tgf-β的持续性信号传导，在itreg中维持tgf-β信号通路的激活。能在体内外缺乏tgf-β的炎性环境中长期维持itreg特征性转录因子foxp3的表达，显著提高其表型与功能稳定性，同时大幅降低体外扩增成本。

28、（3）本发明构建的稳定表达cat-itreg，与传统的foxp3稳定表达策略相比，catgfbr1稳定表达策略显著提升itreg细胞foxp3谱系稳定性与持久性，体现在细胞培养时，在完全撤除外源tgf-β的条件下，catgfbr1稳定表达的itreg细胞经28天扩增后，foxp3阳性率仍稳定维持在60%以上；而foxp3稳定表达对照组在相同条件下，foxp3阳性率已降至初始水平的约20%。

29、（3）本发明有效解决了itreg在炎性环境中易转分化、功能不稳定的技术难题，为自身免疫性疾病治疗及器官移植抗排斥治疗提供了一种更可靠的细胞制备方案，具有突出的技术先进性和临床转化价值。

30、（4）本发明的方法为通过病毒转染细胞因子编码基因，在宿主中进行外源表达，节省了诱导培养体系中昂贵的细胞因子使用量，最大程度降低了培养的成本。