一种检测碳青霉烯酶耐药基因的试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及生物检测，尤其涉及一种检测碳青霉烯酶耐药基因的试剂盒及其应用。

背景技术：

1、碳青霉烯类抗菌药物是治疗多重耐药革兰阴性菌感染的重要药物之一。随着碳青霉烯类抗菌药物在临床中的广泛应用，碳青霉烯耐药肠杆菌目细菌、铜绿假单胞菌及鲍曼不动杆菌等不断出现并传播，严重威胁临床抗感染治疗效果，并增加医院感染防控难度。现有研究及临床检测实践表明，碳青霉烯耐药的重要分子机制之一是细菌携带碳青霉烯酶基因，常见类型主要包括blakpc、blandm、blavim、blaimp以及blaoxa-48-like等。因此，建立针对上述靶标的快速、准确检测方法，对于耐药机制识别、抗菌药物合理使用以及院感监测具有重要意义。

2、目前，针对碳青霉烯酶的检测方法主要包括表型检测方法和分子生物学检测方法。表型方法如mcim/ecim、carba np试验等，虽然在临床中具有一定应用基础，但普遍存在检测周期较长、不能直接明确具体基因型、结果解释受操作经验影响等不足。而免疫层析法虽检测便捷，但存在成本高、对部分碳青霉烯酶变体容易漏检等缺点。相比之下，多重实时pcr具有检测速度快、灵敏度较高、可同时识别多个耐药基因靶标等优势，因此已成为碳青霉烯酶基因快速检测的重要技术路线。

3、现有技术中已经出现商业化的碳青霉烯酶基因多重实时荧光pcr检测试剂盒，以及实验室自建的多靶标pcr检测体系。该类技术通常是在同一反应体系或固定检测流程中设置多组引物和探针，对多种碳青霉烯酶基因进行同步扩增和检测，以提高检测效率并缩短报告时间。例如，xpert carba-r可检测blakpc、blandm、blavim、blaimp和blaoxa-48-like等目标基因，并设置内部控制及探针检查控制，用于保证检测过程质量。尽管上述现有技术已经能够满足常见碳青霉烯酶主酶型的快速筛查需求，但在具体临床实验室应用中仍存在以下不足：其一，现有技术多强调对碳青霉烯酶主基因家族的通用性覆盖，但对本地流行优势亚型的针对性优化不足。尤其是blaimp家族内部亚型差异较大，若仅按家族通用思路设计，可能难以兼顾特定地区或特定实验室常见优势亚型的检测适配性。blaimp-4是亚洲地区报道较多、流行范围较广的重要blaimp亚型之一，已有研究报道其可在特定人群或医疗机构中出现聚集传播。然而，现有通用型检测体系通常缺乏围绕blaimp-4这一优势亚型的重点优化设计。其二，现有技术主要停留于碳青霉烯酶主基因家族的常规识别，通常只能提示样本中是否存在blakpc、blandm、blavim、blaimp及blaoxa-48-like等基因类别，难以进一步区分具有特殊临床意义的关键变体。近年研究显示，部分kpc变体可能与特定β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复方药物的敏感性变化或耐药表型相关，常规主酶型检测体系难以识别此类具有治疗决策参考价值的变体。其中，kpc-33属于具有潜在治疗相关意义的kpc变体之一，现有常规检测体系通常缺乏针对该类关键变体的专门检测设计。其三，现有技术多采用固定靶标组合和固定检测流程，灵活性不足。对于临床常见的五通道或六通道实时荧光pcr仪器而言，如何在有限荧光通道条件下兼顾多个核心靶标、本地优势亚型及关键变体，是检测体系设计中的实际问题。现有体系通常难以根据本地流行病学特征、实验室检测资源以及药敏检测结果灵活配置靶标组合，也难以形成模块化、分步式的检测策略。因此，在实际临床应用中，仍需要一种既能覆盖blakpc、blandm、blaoxa-48-like等全球主流碳青霉烯酶基因型，又能针对blaimp-4及kpc-33等具有区域流行或治疗相关意义靶标进行优化，同时适配常见实时荧光pcr平台的模块化检测体系，以在保证检测准确性的基础上提高检测效率并节约检测资源。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种检测碳青霉烯酶耐药基因的试剂盒。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、第一方面，本发明提供了一种检测碳青霉烯酶耐药基因的试剂盒，所述试剂盒包括基础检测体系a、扩展检测体系b；

4、所述基础检测体系a包括用于检测blakpc基因的引物对和探针、用于检测blandm基因的引物对和探针、用于检测blaoxa-48-like基因的引物对和探针，以及用于检测16srrna内参基因的引物对和探针；

5、所述扩展检测体系b选自以下模块中的至少一种：

6、（1）b1金属酶型扩展模块，包括用于检测blandm基因的引物对和探针、用于检测blavim基因的引物对和探针、用于检测blaimp亚型的引物对和探针，以及用于检测16srrna内参基因的引物对和探针；

7、（2）b2 kpc关键变体扩展模块，包括用于检测blakpc-33的引物对和探针，以及用于检测16s rrna内参基因的引物对和探针。

8、本发明提供一种基于实时荧光探针信号判读的模块化双体系多重pcr检测体系，本发明采用“基础筛查+表型导向扩展”的模块化检测流程（图1）。体系a用于常规筛查全球及国内常见主要碳青霉烯酶基因；体系b根据检测目的进一步分为b1金属酶型扩展模块和b2 kpc关键变体扩展模块。对于未知纯培养分离菌株，可根据实验室成本、通道资源和临床需求选择仅运行体系a，也可同时运行体系a和相应体系b；当体系a结果阴性但耐药表型高度提示产碳青霉烯酶，尤其提示金属β-内酰胺酶可能性较高时，可运行体系b1；当体系a提示blakpc阳性且需进一步识别kpc关键变体时，可运行体系b2。

9、体系a为基础筛查体系，优选包括blakpc检测模块、blandm检测模块、blaoxa-48-like检测模块及16s rrna内参检测模块。上述靶标是临床实践中最常见、最具筛查价值的碳青霉烯酶基因家族组合，适合作为实验室常规快速筛查模块。

10、扩展检测体系b为扩展检测体系，不限定为单一固定组合，而是根据耐药表型、体系a筛查结果及区域流行病学特征配置为至少两种优选模块。b1金属酶型扩展模块优选包括blandm、blavim、针对blaimp-4优化设计的blaimp检测模块以及16s rrna内参，用于金属β-内酰胺酶疑似菌株的进一步检测。b2 kpc关键变体扩展模块优选包括blakpc-33扩展模块及16s rrna内参，用于常规kpc阳性菌株的关键变体分型。在b2模块中，blakpc-33扩展模块用于识别kpc-33关键变体。若基础检测体系a中的kpc常规模块检测为阳性且扩展检测体系b中的kpc-33模块检测为阳性，判定为kpc-33阳性；若基础检测体系a中的kpc常规模块检测为阳性但扩展检测体系b中的kpc-33模块检测为阴性，判定为非kpc-33型kpc阳性，优选为kpc-2或其他常见kpc型别。

11、由于blaimp家族内部亚型序列差异较大，本发明并未简单采用泛化的imp家族通用检测方案，而是结合本实验室菌株资源及流行情况，对blaimp-4进行重点优化设计。现阶段验证结果显示，该模块可在blaimp-4阳性菌株和blaimp-26阳性菌株中获得扩增信号。因此，本发明中的blaimp检测模块适用于blaimp-4及部分近缘亚型的检测；对于其他blaimp亚型的适用范围，可根据后续验证结果进一步扩展。

12、本发明在常规blakpc检测基础上进一步设置了blakpc关键变体扩展模块。该扩展模块包括针对blakpc-33设计的引物和/或荧光探针，用于在常规blakpc检测之外进一步识别特定的kpc关键变体，并已通过经测序确认的kpc-33临床分离株验证其与kpc-2的区分能力。

13、本发明设置16s rrna内参检测模块，用于监测样本核酸提取、扩增过程及结果有效性。由于内参检测亦占用荧光通道，在目标靶标较多时，本发明允许根据检测目的采用不同引物探针组合方案，或采用两个反应体系分别完成检测。

14、本发明的技术构思并不限定于单一固定靶标组合，而是通过模块化组合方式，在有限荧光通道条件下兼顾常见碳青霉烯酶基因筛查、金属酶型别确认、本地优势imp亚型检测以及kpc关键变体识别。

15、本发明所述模块化双体系可采用以下任一方式实施：体系a与体系b1联合用于金属酶疑似菌株检测；体系b2联合用于kpc关键变体识别；或者在需要全面解析碳青霉烯酶基因型及治疗相关变体的场景中联合使用体系a、体系b1和体系b2。

16、优选地，所述用于检测blakpc基因的引物对的核苷酸序列如seq id no.1-2所示，探针的核苷酸序列如seq id no.3所示；

17、所述用于检测blandm基因的引物对的核苷酸序列如seq id no.4-5所示，探针的核苷酸序列如seq id no.6所示；

18、所述用于检测blaoxa-48-like基因的引物对的核苷酸序列如seq id no.7-8所示，探针的核苷酸序列如seq id no.9所示；

19、所述用于检测16s rrna内参基因的引物对的核苷酸序列如seq id no.10-11所示，探针的核苷酸序列如seq id no.12所示；

20、所述用于检测blaimp亚型的引物对的核苷酸序列如seq id no.13-14所示，探针的核苷酸序列如seq id no.15所示；

21、所述用于检测blavim基因的引物对的核苷酸序列如seq id no.16-17所示，探针的核苷酸序列如seq id no.18所示；

22、所述用于检测blakpc-33基因的引物对的核苷酸序列如seq id no.19-20所示，探针的核苷酸序列如seq id no.21所示。

23、优选地，所述用于检测blakpc、blaimp亚型、blavim的探针3'端淬灭基团为bhq1；所述用于检测blandm的探针3'端淬灭基团为bhq2；所述用于检测blaoxa-48-like、blakpc-33的探针3'端淬灭基团为mgb；所述用于检测16s rrna的探针淬灭基团为bhq2。

24、本发明设计了一组用于检测上述目标基因的引物和荧光探针组合物。体系a、体系b1和体系b2分别具有对应的引物和荧光探针组合物；各体系可分别独立使用，也可联合使用；可根据本地流行病学特征、仪器通道配置及临床检测目的，对扩展检测体系中的靶标进行增减或替换。

25、优选地，所述基础检测体系a用于常见碳青霉烯酶基因的基础筛查；所述扩展检测体系b根据耐药表型、基础检测体系a的筛查结果及区域流行病学特征配置为b1金属酶型扩展模块或b2 kpc关键变体扩展模块。

26、优选地，所述试剂盒检测的对象为临床分离菌株。

27、优选地，所述试剂盒还包括dna聚合酶、dntp、缓冲液、mg2+、阳性质控品、阴性质控品。

28、第二方面，本发明提供了所述的试剂盒在制备用于检测碳青霉烯酶耐药基因的产品中的应用。

29、本发明优选以纯培养临床分离菌株为检测对象，采用“基础检测体系a+扩展检测体系b”的模块化双体系设计。体系a用于常见碳青霉烯酶基因的基础筛查，优选包括blakpc、blandm、blaoxa-48-like及16s rrna内参。体系b为扩展检测体系，可根据耐药表型、体系a筛查结果及区域流行病学特征进一步配置为b1金属酶型扩展模块或b2 kpc关键变体扩展模块。

30、在一种优选实施方式中，当临床分离菌株药敏表型、mcim/ecim、edta协同试验、药物敏感性谱或区域流行病学资料提示金属β-内酰胺酶可能性较高时，扩展检测体系b配置为b1金属酶型模块，优选包括blandm、blavim、blaimp优化模块及16s rrna内参。

31、在另一种优选实施方式中，当体系a提示blakpc阳性，或临床用药背景提示需进一步识别kpc关键变体时，扩展检测体系b配置为b2 kpc关键变体模块，优选包括blakpc常规模块、blakpc-33关键变体模块及16s rrna内参。

32、第三方面，本发明提供了一种非诊断目的的碳青霉烯酶耐药基因检测方法，所述方法包括以下步骤：提取待测样本的核酸，采用所述的试剂盒进行实时荧光pcr检测，获取结果，进行结果判读，分析确定待测样品是否含有肠杆菌目细菌碳青霉烯耐药基因。

33、本发明所述检测体系优选建立于纯培养菌株基础之上，临床新鲜纯培养菌株可直接挑取菌落制备模板；方法建立或性能验证阶段保存的标准菌株或临床分离株，可经复苏纯化后制备模板。模板dna分别加入含有上述引物探针组合物的多重实时荧光探针pcr反应体系中进行扩增检测，在pcr扩增过程中实时采集各检测通道的荧光信号，并根据扩增曲线形态及循环阈值对目标基因进行判读。

34、优选地，根据各荧光通道的扩增曲线和ct值进行结果判读，当目标靶标对应通道出现典型s型扩增曲线且ct值不高于预设阈值时，判定为阳性；当无有效扩增曲线或ct值高于阴性判定阈值且16s rrna内参扩增正常时，判定为阴性；当内参、阳性质控或阴性质控不符合要求时，判定本次检测无效。

35、优选地，所述试剂盒中采用b2 kpc关键变体扩展模块检测时，结果判读方法为：当blakpc检测结果为阳性且blakpc-33检测结果为阳性时，判定为blakpc-33型；当blakpc检测结果为阳性而blakpc-33检测结果为阴性时，判定为非blakpc-33型kpc。

36、本发明的有益之处在于：

37、为解决现有固定靶标组合检测体系难以兼顾不同实验室仪器通道配置差异及本地流行病学特征差异的问题，本发明设计了“基础检测体系a+扩展检测体系b”的模块化双体系。体系a用于常见碳青霉烯酶基因的基础筛查，优选包括blakpc、blandm、blaoxa-48-like及16s rrna内参。体系b为扩展检测体系，可根据耐药表型、体系a筛查结果及区域流行病学特征进一步配置为b1金属酶型扩展模块或b2 kpc关键变体扩展模块。本发明的模块化双体系设计，能够适配目前实验室常用的五通道或六通道实时荧光pcr仪器，在有限通道条件下兼顾常见主靶标检测、关键变体检测及内参设置需求。

38、现有技术主要停留于主流碳青霉烯酶基因识别而缺乏关键变体检测，本发明针对blaimp-4进行重点优化设计，并已验证对blaimp-26具有扩增能力，较现有通用性设计更符合本地及区域优势亚型检测需求。本发明还进一步设置blakpc-33扩展模块，在常规碳青霉烯酶检测基础上增强了对kpc关键变体的识别能力，具有更好的临床扩展价值。本发明针对blaimp家族高度异质性，通过序列分析和区域优化，提高对imp-4优势亚型及近缘imp-26检测适配能力。针对blakpc-33与常见kpc型仅存在单个位点差异的特点，通过变异位点特异性设计，实现kpc家族检测基础上的关键变体分型。

39、本发明并非固定单一组合，而是可根据本地流行病学特征、实验室仪器通道配置、耐药表型提示和临床用药需求选择不同引物探针组合，更适合实际实验室应用。

40、本发明采用多重实时荧光探针pcr检测方式，可在封闭体系内通过扩增曲线、荧光信号和ct值直接判读结果，检测快速、操作简便、污染风险低。

41、本发明提供了便于进一步形成试剂盒产品的引物探针组合物、反应体系、荧光通道设置、模块组合方式及判读规则，使该技术既能满足当前实验室自建方法需求，也能为后续产品化提供基础。