一种基于多孔碳材料负载的固定化酶及其在造纸黑液活化中的应用

本发明涉及生物酶固定，具体涉及一种基于多孔碳材料负载的固定化酶及其在造纸黑液活化中的应用。

背景技术：

1、造纸黑液是亚硫酸铵法制浆的主要副产物，富含木质素磺酸盐、半纤维素降解产物及残余铵盐等有机组分，具有较高的资源化利用潜力。然而，未经处理的造纸黑液中木质素磺酸盐通常具有较宽的分子量分布，其分子量主要集中于2000～20000 da。木质素磺酸盐的分子量及含氧官能团含量与其生理活性密切相关，研究表明，当其分子量降低至约1000 da时，可表现出较高的生理活性。与此同时，现有造纸黑液中木质素组分的羧基含量通常仅约为1.0～2.0mmol/g干固形物。较高的分子量以及相对较低的羧基含量限制了木质素磺酸盐与植物根系、土壤矿质组分及其他活性物质之间的相互作用，使未经活化的造纸黑液直接用于农业时，其生理活性和利用效率仍有进一步提升的空间。因此，通过对黑液中高分子木质素磺酸盐进行可控降解，使其向较低分子量组分转化，并在降解过程中提高羧基等活性官能团含量，是提高造纸黑液生物活性和资源化利用价值的重要技术途径。

2、目前木质素类物质的降解和活化方法主要包括化学氧化、物理化学处理以及生物催化处理等。其中，酶催化具有反应条件温和、催化选择性较高以及环境友好等特点，利用能够作用于木质素芳香结构及其降解中间体的氧化酶催化木质素磺酸盐转化，为造纸黑液的温和活化提供了新的技术途径。但是，直接采用游离酶处理造纸黑液仍存在明显局限。一方面，造纸黑液属于组成复杂的液相体系，其中含有木质素磺酸盐、无机盐及多种低分子有机物，其ph、离子强度及底物组成均可能影响酶蛋白的空间构象和催化活性，导致游离酶在连续或长时间反应过程中发生失活；另一方面，游离酶分散于黑液后难以从反应体系中有效分离和回收，通常只能一次性使用，造成酶制剂利用率较低和处理成本增加。此外，木质素磺酸盐具有分子量分布宽、空间结构复杂等特点，仅依赖单一酶催化时，往往难以兼顾高分子结构氧化裂解以及后续低分子芳香中间体的进一步转化，制约了黑液中木质素分子量降低和羧基含量提高的程度。

3、酶固定化技术通过将酶吸附、包埋或共价固定于固体载体，可以在一定程度上限制酶分子的构象变化，改善酶在复杂反应环境中的稳定性；同时为酶的重复利用提供条件。现有技术已经尝试将漆酶固定于多孔载体，用于造纸黑液的脱色、去除或污染治理。然而，现有固定化漆酶体系主要关注黑液污染物去除以及木质素的氧化改性，且单独漆酶作用于木质素磺酸盐还可能诱导自由基偶联而产生聚合。对于如何利用固定化多酶协同催化实现黑液中木质素磺酸盐的定向解聚，并在降低分子量的同时提高羧基等活性官能团含量，从而获得具有较高生理活性的活化黑液，现有技术仍缺乏有效解决方案。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种基于多孔碳材料负载的固定化酶及其在造纸黑液活化中的应用。

2、具体的，本发明涉及以下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供一种基于多孔碳材料负载的固定化酶，由如下方法制备而成：

4、（1）将漆酶和原儿茶酸3,4-双加氧酶共同溶于ph 6.0~7.0的磷酸盐缓冲液中，得双酶混合液；向双酶混合液中加入甲氧基聚乙二醇-n-羟基琥珀酰亚胺酯（mpeg-nhs），振荡1~3h，再加入稳定剂，孵育1~3h，得到热稳定改性漆酶-双加氧酶复合物；

5、（2）将多孔碳材料分散于ph 6.5~7.0的磷酸盐缓冲液中，加入步骤（1）制备的热稳定改性漆酶-双加氧酶复合物，在4~10℃下温和振荡12~24 h；随后向体系中加入交联剂；负载完成后过滤收集固体，洗涤去除未反应的交联剂及游离酶，制备得到基于多孔碳材料负载的固定化酶。

6、优选的，步骤（1）中，所述漆酶和原儿茶酸3,4-双加氧酶按质量比1:1共同溶于磷酸盐缓冲液中。

7、本发明将漆酶与原儿茶酸3,4-双加氧酶按质量比1:1共同固定于同一多孔载体，使两种酶在空间上相互邻近，有利于漆酶氧化产生的低分子芳香中间体快速传递至原儿茶酸3,4-双加氧酶的催化区域，缩短级联反应中的中间产物扩散路径，促进木质素磺酸盐由初步氧化向进一步芳环开裂和增羧反应连续进行；同时，共同固定能够实现两种酶的同步回收和重复利用，并有利于维持双酶体系的相对比例及局部催化环境，从而提高黑液活化过程的连续性和稳定性。

8、优选的，步骤（1）中，甲氧基聚乙二醇-n-羟基琥珀酰亚胺酯的加入量为漆酶和原儿茶酸3,4-双加氧酶总重量的20~50%；稳定剂的加入量为漆酶和原儿茶酸3,4-双加氧酶总重量的5~15%。

9、进一步的，所述稳定剂选自海藻糖、山梨醇或甘露醇中的一种或多种。

10、本发明利用甲氧基聚乙二醇-n-羟基琥珀酰亚胺酯和稳定剂对漆酶与原儿茶酸3,4-双加氧酶进行了热稳定改性：通过在酶分子表面共价引入聚乙二醇链，改善酶分子周围的水合微环境，降低外界温度及反应介质变化对酶蛋白活性构象的扰动，从而提高双酶体系的构象稳定性和热稳定性，并有利于维持其在弱碱性反应体系中的催化活性。进一步加入海藻糖、山梨醇或甘露醇作为糖类或糖醇类稳定剂，通过调节酶蛋白周围的水合状态以及氢键相互作用，降低酶蛋白发生构象展开和聚集的倾向，与聚乙二醇化改性共同提高双酶复合物在反应条件下的稳定性。

11、优选的，步骤（2）中，所述多孔碳材料由如下方法制备得到：

12、将木质素、锰源和含氮前驱体加入去离子水中，调节ph至10~12，于50~60℃搅拌反应2~4 h，形成锰-氮-碳复合前驱体悬浮液；随后加入海藻酸钠，搅拌后超声分散30~60min真空脱气得到均质粘稠液；将均质粘稠液滴加至0.5~1.0 m cacl2中，静置老化2~4 h，去离子水洗至中性，经梯度乙醇交换后冷冻干燥48~72 h，得到球形前驱体；将球形前驱体在氩气气氛下以2~5℃/min升温至300~400℃预碳化1~2 h，再以3~8℃/min升温至750~900℃碳化2~4 h；自然冷却后用0.3~0.8 m稀盐酸于60~80℃处理4~8 h，去离子水洗至中性，再用0.5~1.0 m过氧化氢于40~50℃处理2~4 h，以增加载体表面含氧官能团；干燥，制备得到多孔碳材料。

13、进一步的，所述木质素、锰源和含氮前驱体加入的重量比为100：（3-8）：（5-15）。

14、更优选的，所述木质素选自碱木质素、酶解木质素、有机溶剂木质素中的一种或多种；所述锰源选自乙酸锰、草酸锰或柠檬酸锰中的一种或多种；所述含氮前驱体选自双氰胺或三聚氰胺。

15、本发明先将木质素、锰源及含氮前驱体在碱性条件下预反应，使锰离子与含氮配体在木质素基质中分散并形成预配位结构；随后加入海藻酸钠，通过cacl2中ca2+离子交联凝胶化形成锰-氮-碳凝胶球；高温煅烧形成具有锰-氮-碳催化活性位点的分级孔隙结构三维多孔框架，同时形成微孔（0.5-2nm）-介孔（5-20 nm）-大孔（50-200μm）三级分级连通孔隙结构，比表面积达500-800 m2/g，锰含量1.0-2.0 wt%，氮含量3.0-5.0 wt%。

16、需要说明的是，微孔（0.5-2 nm）主要提供高比表面积并吸附小分子底物或氧气，在酶分子周围形成局部富集效应；介孔（5-20 nm）中较大的介孔（10-20 nm）可作为酶分子的辅助固定位点及传质通道；大孔（50-200μm）是酶分子的主要负载空间。三级孔隙相互连通，使底物和产物在载体内部快速扩散，弥补了酶分子不能进入微孔和较小介孔的不足，从而整体提高催化效率。

17、优选的，步骤（2）中，所述交联剂选自戊二醛或京尼平。

18、本发明的多孔碳材料的分级孔隙结构提供物理空间，热稳定改性漆酶-双加氧酶复合物通过毛细作用进入多孔碳材料的孔道，并凭借聚乙二醇化酶氢键及弱静电作用吸附于介孔及大孔内壁，使两种酶能够顺利进入孔道并负载；戊二醛或京尼平引发孔道内相邻酶分子游离氨基的原位微交联，将双酶锁定于孔道内部，防止反应过程中溶出脱落。

19、本发明的第二方面，提供上述基于多孔碳材料负载的固定化酶在造纸黑液活化中的应用；所述造纸黑液活化为：降低造纸黑液中木质素磺酸盐的分子量、提高造纸黑液中的羧基含量。

20、上述应用中，活化造纸黑液的方法为：向造纸黑液中加入上述基于多孔碳材料负载的固定化酶和分散剂，在空气鼓泡并配合低速搅拌条件下，35~40℃反应8~12h；反应结束后离心回收基于多孔碳材料负载的固定化酶。

21、优选的，每1l的造纸黑液中加入1.0g基于多孔碳材料负载的固定化酶和3.0g分散剂。

22、优选的，所述分散剂选自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇或聚乙二醇中的一种或多种。

23、本发明的基于多孔碳材料负载的固定化酶活化造纸黑液的作用机理为：漆酶催化木质素磺酸盐中的酚性结构发生单电子氧化，形成酚氧自由基，并在所述反应体系中促进部分木质素结构发生氧化转化和键裂解，形成分子量较低的含邻二酚结构和/或芳香酸结构的中间产物；原儿茶酸3,4-双加氧酶进一步催化其中可识别的原儿茶酸类底物发生3,4位内裂解型芳环开环，生成富含羧基的开环产物，从而有利于提高体系中羧基含量。载体中的锰-氮配位结构有利于溶解氧在载体界面的吸附和活化，为氧化反应提供有利的界面微环境；聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇或聚乙二醇作为分散剂，通过在载体颗粒表面形成水合高分子链层，增加颗粒间的空间位阻，降低催化剂在黑液体系中的团聚和沉降倾向，从而促进催化剂与底物的充分接触。

24、本发明的有益效果：

25、（1）本发明在漆酶和原儿茶酸3,4-双加氧酶表面引入聚乙二醇链，并进一步加入海藻糖、山梨醇或甘露醇等稳定剂，有利于改善酶分子周围的水合微环境、降低反应介质及温度变化对酶蛋白活性构象的扰动；在此基础上再将双酶固定于多孔载体上，可进一步限制酶分子的过度构象变化和聚集，提高其操作稳定性。

26、漆酶主要作用于木质素磺酸盐中的酚性结构，促进其发生氧化转化并形成较低分子量的芳香中间产物；原儿茶酸3,4-双加氧酶能够进一步催化其中可识别的原儿茶酸类底物发生芳环开环，形成富含羧基的开环产物。将两种酶共同负载于同一载体，可使两种酶在空间上相互邻近，缩短级联反应过程中中间产物的扩散距离，有利于前一步氧化产物进一步向后续开环产物转化，从而兼顾木质素磺酸盐的低分子化和含氧官能团增加。与此同时，共同固定还便于两种酶作为一个整体同步回收，避免分别固定时两种催化剂回收程度和投加比例发生变化。

27、（2）本发明以木质素、锰源和氮源为前驱体，以海藻酸钠辅助成型，经ca2+离子交联凝胶化、冻干、预碳化和高温碳化等步骤制得三维多孔碳载体。所得载体具有微孔、介孔和大孔相结合的分级连通孔隙结构，其中较大介孔、大孔能够为酶分子的吸附和固定提供空间，同时较高比表面积及表面含氧、含氮官能结构有利于提高载体与酶分子之间的界面相互作用，从而为双酶的稳定负载提供结构基础。

28、（3）利用本发明的基于多孔碳材料负载的固定化酶对造纸黑液进行活化处理，无需采用高温、高压等剧烈处理条件，在空气鼓泡和低速搅拌条件下就能显著降低造纸黑液中木质素磺酸盐的分子量、提高造纸黑液中的羧基含量。

29、本发明在黑液活化体系中加入聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇或聚乙二醇等分散剂，通过在载体颗粒表面形成水合高分子链层并增加颗粒间空间位阻，降低催化剂颗粒发生团聚和沉降的倾向。

30、本发明的基于多孔碳材料负载的固定化酶还便于分离回收和重复利用，具有较好的重复使用性能和操作稳定性，降低了酶制剂的使用成本。