一种适用于植物组织的染色质免疫共沉淀优化方法与流程

本发明涉及植物分子生物学领域，具体为一种适用于植物组织的染色质免疫共沉淀优化方法。

背景技术：

1、染色质免疫共沉淀技术（chip）是研究植物体内蛋白质与 dna 相互作用的核心实验手段，广泛应用于基因表达调控、表观遗传修饰等研究领域。 传统植物组织 chip 方法存在诸多缺陷：第一，实验流程分多管操作，植物样品在转移、洗涤过程中损耗量大，样品均一性差；第二，染色质超声参数设置不合理，易造成片段过大或过度破碎，片段分布不均，直接影响后续富集效果；第三，非特异性结合问题突出，实验背景噪音高，导致 qpcr 富集倍数偏低、高通量测序信噪比差；第四，传统 dna 纯化多依赖高毒性酚 - 氯仿操作，实验安全性差，且难以适配高通量实验需求；第五，各类缓冲液体系、操作参数无统一标准，不同实验人员、不同实验室之间实验重复性差。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种适用于植物组织的染色质免疫共沉淀优化方法，简化操作流程，降低材料损失，提高交联均一性。优化超声策略，获得稳定均匀的染色质片段。降低非特异性结合，显著降低背景噪音。实现无毒、快速、高通量dna纯化。建立标准化、可重复、可专利保护的完整体系。

2、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种适用于植物组织的染色质免疫共沉淀优化方法包括以下步骤：

3、s1 甲醛交联处理：取 2～5 g 新鲜植物组织，经去离子水洗净、剪碎后，置于 30～40 ml 预冷一号缓冲液中，加入体积分数 1% 甲醛混匀；室温抽真空交联 4～10 min，期间轻摇混匀，重复 2～3 次；加入终浓度 125 mm 甘氨酸终止交联，继续真空处理 2～5min；采用冰无菌水洗涤 2～4 次，吸干水分后液氮速冻，置于 - 80℃环境保存；

4、s2 细胞核提取：将冷冻植物组织置于液氮环境中研磨成细粉，每 2～3 g 粉末加入 30～40 ml 预冷一号缓冲液，4℃条件下旋转处理 30 min，随后以 4000 g、4℃离心 20min 并弃上清；沉淀采用二号缓冲液重悬后进行超声处理，超声完成后以 10000 rpm、4℃离心 2 min，收集上清得到粗细胞核；

5、s3 染色质超声片段化：将粗细胞核采用 500～800 μl 超声缓冲液轻柔重悬，冰上静置 15～20 min 完成裂解；设置超声输出功率为 10%～20%，单次超声 30 s、间隔暂停30 s，循环总时长 25 min；超声结束后以 12000 g、4℃离心 15 min，取上清得到染色质溶液；取少量染色质样品混合 5% 甘油，采用 2% 琼脂糖电泳检测，片段集中在 200～600bp为合格；

6、s4 免疫结合处理：采用稀释缓冲液将染色质溶液稀释至 sds 终浓度小于 0.1%，加入 50 μl protein a/g 磁珠，4℃旋转 1～2 h 去除非特异性结合；通过磁力架分离磁珠，吸取上清并加入体积比 5～7 μl/ml 的特异性抗体，4℃旋转孵育过夜，同时设置不加抗体的阴性对照组；再加入洗涤后的 protein a/g 磁珠，4℃孵育 2～4 h，捕获免疫复合物；

7、s5 特异染色质提取：利用磁力架分离磁珠，依次采用低盐洗涤液、高盐洗涤液、氯化锂洗涤液、te 缓冲液在 4℃下各旋转洗涤 10 min，每次洗涤后通过磁力架吸附磁珠并去除上清；随后加入 200～250 μl 洗脱液，65℃孵育 15 min 进行洗脱，重复洗脱 1 次并合并洗脱液；向洗脱液中加入 200 mm 氯化钠与 20 μg/ml 蛋白酶 k，65℃震荡解交联 6～12 h； s6 dna 纯化回收：依次加入 0.5 m edta、1 m tris-hcl 与蛋白酶 k 溶液，混匀后 45℃震荡孵育 2～3 h；再加入 rnase a，37℃、350 rpm 反应 30 min；采用酚 - 氯仿体系抽提上清，加入无水乙醇、醋酸钠与糖原，-20℃条件下沉淀过夜；经 75% 乙醇洗涤、晾干后，采用 te 缓冲液溶解 dna，采用荧光定量法检测，浓度≥10 ng/μl 即可用于后续pcr 或建库测序。

8、优选的，所述一号缓冲液组分：10 mm tris-hcl、10 mm mgcl2、400 mm 蔗糖，ph=8.0。

9、优选的，所述二号缓冲液组分：10 mm tris-hcl、10 mm mgcl2、200 mm 蔗糖，ph=8.0；细胞核提取步骤中超声输出功率为 10%，单次超声 30 s、暂停 30 s，循环总时长 10min。

10、优选的，所述超声缓冲液组分：10 mm tris-hcl、10 mm mgcl2、2 m 蔗糖、体积分数 0.3% sds，ph=8.0。

11、优选的，所述稀释缓冲液组分：10 mm tris-hcl、10 mm edta、150 mm nacl、体积分数 1% tritonx-100，ph=8.0。

12、优选的，所述低盐洗涤液组分：20 mm tris-hcl、2 mm edta、150 mm nacl、体积分数 0.1% sds、体积分数 1% triton x-100，ph=8.0。

13、优选的，所述高盐洗涤液组分：20 mm tris-hcl、2 mm edta、450 mm nacl、体积分数 0.1% sds、体积分数 1% triton x-100，ph=8.0。

14、优选的，所述氯化锂洗涤液组分：10 mm tris-hcl、1 mm edta、250 mm 氯化锂、体积分数 1% 脱氧胆酸钠、体积分数 1% np-40，ph=8.0。

15、优选的，所述 te 缓冲液组分：10 mm tris-hcl、1 mm edta，ph=8.0。

16、本发明提供了一种适用于植物组织的染色质免疫共沉淀优化方法。具备以下有益效果：

17、（1）流程优化，降低样品损耗：整合交联、洗涤操作，减少样品多次转移，提升植物组织样品利用率与实验均一性。（2）超声参数标准化：限定超声功率与循环时长，染色质片段稳定集中在 200～600bp，片段均一性大幅提升； （3）有效降低背景噪音：增设磁珠预清除步骤，搭配梯度盐溶液洗涤体系，显著减少非特异性结合，提高实验信噪比； （4）体系标准化：统一各类缓冲液配方与操作参数，实验室间、人员间实验重复性显著增强； （5）适用性广：纯化方案兼顾常规分子实验与高通量测序，dna 得率高，最低浓度可达 10 ng/μl，满足下游多种实验要求。

18、图1为本发明工作流程图。

1.一种适用于植物组织的染色质免疫共沉淀优化方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求 1 所述的适用于植物组织的染色质免疫共沉淀优化方法，其特征在于，所述一号缓冲液组分：10 mm tris-hcl、10 mm mgcl2、400 mm 蔗糖，ph=8.0。

3.根据权利要求 1 所述的适用于植物组织的染色质免疫共沉淀优化方法，其特征在于，所述二号缓冲液组分：10 mm tris-hcl、10 mm mgcl2、200 mm 蔗糖，ph=8.0；细胞核提取步骤中超声输出功率为 10%，单次超声 30 s、暂停 30 s，循环总时长 10 min。

4.根据权利要求 1 所述的适用于植物组织的染色质免疫共沉淀优化方法，其特征在于，所述超声缓冲液组分：10 mm tris-hcl、10 mm mgcl2、2 m 蔗糖、体积分数 0.3% sds，ph=8.0。

5.根据权利要求 1 所述的适用于植物组织的染色质免疫共沉淀优化方法，其特征在于，所述稀释缓冲液组分：10 mm tris-hcl、10 mm edta、150 mm nacl、体积分数 1%tritonx-100，ph=8.0。

6.根据权利要求 1 所述的适用于植物组织的染色质免疫共沉淀优化方法，其特征在于，所述低盐洗涤液组分：20 mm tris-hcl、2 mm edta、150 mm nacl、体积分数 0.1% sds、体积分数 1% triton x-100，ph=8.0。

7.根据权利要求 1 所述的适用于植物组织的染色质免疫共沉淀优化方法，其特征在于，所述高盐洗涤液组分：20 mm tris-hcl、2 mm edta、450 mm nacl、体积分数 0.1% sds、体积分数 1% triton x-100，ph=8.0。

8.根据权利要求 1 所述的适用于植物组织的染色质免疫共沉淀优化方法，其特征在于，所述氯化锂洗涤液组分：10 mm tris-hcl、1 mm edta、250 mm 氯化锂、体积分数 1% 脱氧胆酸钠、体积分数 1% np-40，ph=8.0。

9.根据权利要求 1 所述的适用于植物组织的染色质免疫共沉淀优化方法，其特征在于，所述 te 缓冲液组分：10 mm tris-hcl、1 mm edta，ph=8.0。