高保真限制性内切核酸酶及其用途的制作方法

本公开涉及生物。具体而言，本公开涉及一种星号活性降低的限制性内切核酸酶。更具体地，本公开包括该限制性内切核酸酶的表达、诱变、纯化及应用。

背景技术：

1、据报道，在某些条件下，一些限制性酶会切割与其定义的识别序列相似但不完全相同的序列。这种改变的特异性被称为星号活性（star activity）[1,2]。星号活性是限制性内切核酸酶的一种普遍属性。它可能在dna中引入非预期的切割，增加凝胶回收的难度，并导致正确连接产物的得率降低。在特定条件下，限制性内切核酸酶可能表现出更高的星号活性，进而产生更多副产物。有研究表明，某些条件可能会增加星号活性，例如：高的限制性内切核酸酶/dna比例、高的甘油浓度（>5% v/v）、有机溶剂的存在、低离子强度（盐浓度<25 mm）以及高的ph值（>8.0）[3,4,5]。保真度指数（fidelity index, fi）提供了一种定量评估限制性内切核酸酶的星号活性强弱的指标，其定义为：不显示星号活性的最高酶量与完全切割同源位点所需的最低酶量的比值[6]。降低限制性内切核酸酶的星号活性，换言之，使其具有相对较高的fi值，对于限制性内切核酸酶的应用至关重要。

2、bsiwi及其同源酶特异性识别dna序列中的5’-cgtacg-3’基序，是广泛用于分子克隆及其他目的限制性内切核酸酶。然而，这些酶在长时间孵育后表现出强的星号活性。因此，需要通过蛋白质工程改造手段来降低该酶的星号活性，以利于其更多方面的应用。

技术实现思路

1、本申请提供了一种修饰的酶，更具体地，一种bsiwi酶变体，其表现出与野生型bsiwi相当的切割活性，同时具有更低的星号活性。野生型bsiwi在特定反应条件下具有星号活性，尽管该星号活性通常较弱，但在大多数应用中是不利的。本文公开的bsiwi酶变体与野生型bsiwi相比表现出改善的序列识别特异性，并且适用于多种应用场景。

2、在一个方面，本公开提供了一种蛋白（或在本文中称为修饰的酶或限制性内切核酸酶变体），其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与包含seq id no:2的氨基酸序列的野生型bsiwi限制性内切核酸酶相比具有一个或多个氨基酸突变（例如取代、插入或缺失），其中，所述蛋白与所述野生型bsiwi限制性内切核酸酶相比具有降低的星号活性和相当的切割活性。在一些实施方案中，所述蛋白包含与野生型bsiwi限制性内切核酸酶相比具有一个或多个氨基酸取代的氨基酸序列，并且所述蛋白与野生型bsiwi限制性内切核酸酶相比具有降低的星号活性和相当的切割活性。

3、在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代选自根据seq id no:2的编号的t130a、n38a、s41a、q42a、e44a、s98a、s159a和n163a；优选地，所述取代为t130a。在一些实施方案中，所述蛋白包含与seq id no:6的氨基酸序列具有至少95%（例如95%、96%、97%、98%、99%或99.5%）同一性的氨基酸序列。

4、在一些实施方案中，与野生型bsiwi限制性内切核酸酶相比，所述蛋白的保真度提升系数为至少2或更高，优选地，所述蛋白的保真度提升系数为至少4或更高、至少8或更高、至少16或更高、至少32或更高、至少64或更高、至少128或更高，或更优选地，所述蛋白的保真度提升系数为至少256或更高。所述保真度提升系数由所述蛋白的保真度指数与野生型bsiwi限制性内切核酸酶的保真度指数的比值确定。

5、在一个方面，本公开提供了一种核酸分子，其包含编码本文公开的蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核酸分子包含如seq id no:5所示的核苷酸序列。

6、在一个方面，本公开提供了一种载体，其包含本文公开的核酸分子。在一些实施方案中，所述载体是质粒、黏粒或病毒。优选地，所述载体不具有bsiwi限制性内切核酸酶的限制性识别序列。在一些实施方案中，该病毒选自逆转录病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒（如单纯疱疹病毒）、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒（如sv40）。在一些实施方案中，所述载体衍生自质粒，所述质粒选自pdest-hismbp、pdest-perihismbp、pgtvl1-sgc、pnh-trxt、pbad系列质粒、pet系列质粒和pet15-mhl，优选地，所述载体衍生自pbad/his a或pet28a(+)。

7、在一个方面，本公开提供了一种宿主细胞，其包含本文公开的载体或核酸分子。

8、在一个方面，本公开提供了一种生产本文公开的蛋白的方法，其包括以下步骤：(a) 培养包含本文公开的载体或核酸分子的宿主细胞以表达所述蛋白；和(b) 从步骤(a)的培养物中分离或纯化所述蛋白。

9、在一个方面，本公开提供了一种切割核酸分子的方法，包括使核酸分子与本文公开的蛋白接触，其中所述核酸分子含有5’-cgtacg-3’基序；优选地，所述核酸分子为双链dna。

10、在一个方面，本公开提供了一种鉴定本文公开的蛋白的方法，包括：在合适的条件下使所述蛋白与底物dna接触，其中所述底物dna包含5’-cgtacg-3’ 识别序列；和分析反应产物以确定不显示星号活性的最高蛋白量和完全切割底物dna所需的最低蛋白量，从而确定所述蛋白的保真度指数。

11、在一些实施方案中，所述方法进一步包括计算所述蛋白的保真度提升系数的步骤。在一些实施方案中，与野生型bsiwi限制性内切核酸酶相比，所述蛋白的保真度提升系数为至少2或更高，优选地，至少4或更高、至少8或更高、至少16或更高、至少32或更高、至少64或更高、至少128或更高，或更优选地，至少256或更高的保真度提升系数。

12、在一个方面，本公开进一步提供了一种限制-修饰系统，其包含本文公开的蛋白和甲基转移酶，任选地，所述甲基转移酶包含如seq id no:4所示的氨基酸序列。

13、在一个方面，本公开还提供了一种包含本文公开的蛋白或本文公开的限制-修饰系统的试剂盒。

14、本文还提供了一种包含编码所述甲基转移酶的核酸序列的载体。所述载体可以是质粒、黏粒或病毒。在一些实施方案中，所述载体是pbad/his a质粒。

1.一种蛋白，其包含与野生型bsiwi限制性内切核酸酶相比具有一个或多个氨基酸取代的氨基酸序列，所述野生型bsiwi限制性内切核酸酶包含seq id no:2的氨基酸序列，

2.权利要求1所述的蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包含在根据seq id no:2的编号的t130处的取代；

3.权利要求2所述的蛋白，其中所述蛋白包含与seq id no:6的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。

4.权利要求1-3中任一项所述的蛋白，其中与野生型bsiwi限制性内切核酸酶相比，所述蛋白具有至少2或更高的保真度提升系数，优选地，至少4或更高、至少8或更高、至少16或更高、至少32或更高、至少64或更高、至少128或更高，或更优选地，至少256或更高的保真度提升系数。

5.一种核酸分子，其包含编码权利要求1-4中任一项所述的蛋白的核苷酸序列。

6.权利要求5所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列如seq id no:5所示。

7.一种载体，其包含权利要求5-6中任一项所述的核酸分子。

8.权利要求7所述的载体，其中所述载体是质粒、黏粒或病毒。

9.权利要求7或8所述的载体，其中所述载体来源于原核表达载体质粒、真核表达质粒或病毒。

10.权利要求9所述的载体，其中所述病毒选自逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒和疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)。

11.一种宿主细胞，其包含权利要求7-9中任一项所述的载体或权利要求5或6所述的核酸分子。

12.一种产生权利要求1-4中任一项所述的蛋白的方法，包括以下步骤：

13.一种切割核酸分子的方法，包括使所述核酸分子与权利要求1-4中任一项所述的蛋白接触，其中所述核酸分子含有5’-cgtacg-3’基序；

14.一种鉴定权利要求1-4中任一项所述的蛋白的方法，包括：

15.权利要求14所述的方法，进一步包括计算所述蛋白的保真度提升系数的步骤。

16.权利要求14或权利要求15所述的方法，其中与野生型bsiwi限制性内切核酸酶相比，所述蛋白具有至少2或更高的保真度提升系数，优选地，至少4或更高、至少8或更高、至少16或更高、至少32或更高、至少64或更高、至少128或更高，或更优选地，至少256或更高的保真度提升系数。

17.一种限制-修饰系统，其包含权利要求1-4中任一项所述的蛋白和甲基转移酶，任选地，所述甲基转移酶包含seq id no:4的氨基酸序列。

18.一种试剂盒，其包含权利要求1-4中任一项所述的蛋白或权利要求17所述的限制-修饰系统。