一种温郁金来源的柯巴基焦磷酸合酶以及编码基因和应用

本发明涉及生物工程，具体涉及一种温郁金来源的柯巴基焦磷酸合酶以及编码基因和应用。

背景技术：

1、温郁金（

curcuma wenyujiny.h.chen et c. ling）系姜科姜黄属多年生草本植物，以浙江省瑞安市为核心道地产区，位列"浙八味"传统中药材之一。其根茎具有消瘀散结、行气活血、清心解郁等功效，现代药理学研究进一步揭示其抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗血栓及保肝等多重活性。化学成分研究显示，温郁金主要含倍半萜、单萜、二萜及姜黄素类化合物，其中已鉴定的9种二萜类化合物因显著的抗肿瘤活性与细胞毒性作用，展现出重要药用开发潜力（李星辰等. 温郁金化学成分、药理作用、临床应用的研究进展及其质量标志物的预测分析. 中国中药杂志, 2023, 48(20): 5419-37.）。然而，传统提取方法效率低、成本高等瓶颈，严重制约了温郁金二萜类成分的深度开发。

2、近年来，合成生物学技术为中药活性成分的高效获取提供了新路径，而功能基因元件的挖掘是构建生物合成体系的核心基础。根据结构推测，温郁金中具有显著细胞活性的二萜化合物curcumrinol c/d/e可能是以normal 构型的柯巴基焦磷酸（

nor-copalyldiphosphate，nor-cpp）为前体进一步反应获得的（ jin h f,

et al. curcuma wenyujinditerpenoid compound c fought against gastric cancer: an experimentalstudy.

zhongguo zhong xi yi jie he za zhi, 2015, 35(2): 216-221.；zhang p,

et

al. cytotoxic diterpenes from the radix of curcuma wenyujin.

phytochemistry

letters, 2008, 1(2): 103-106.），因此nor-cpp为温郁金中重要二萜产物的关键中间体。此外，自然界中nor-cpp构型衍生的二萜化合物普遍具有昆虫拒食、细胞毒性等生物活性，具有重要的研究价值。因此，揭示温郁金中nor-cpp的生物合成分子机制具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于从温郁金中克隆得到参与normal 构型的柯巴基焦磷酸（nor-cpp）生物合成的编码基因，用于二萜化合物关键中间体nor-cpp的生物合成。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明首次从温郁金中成功克隆获得一条新的柯巴基焦磷酸二萜合酶（copalyldiphosphate synthase，cps）基因，其开放阅读框序列如seq id no.1所示，将其命名为

cwditps1。该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。通过体外酶促实验和酿酒酵母体内实验，证实该酶能够催化二萜前体牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（geranylgeranylpyrophosphat，ggpp）生成产物normal 构型的柯巴基焦磷酸（nor-cpp），nor-cpp为温郁金中具有细胞活性的二萜化合物的前体物质。

4、因此，本发明提供了一种温郁金来源的柯巴基焦磷酸合酶，其氨基酸序列如seqid no.2所示。利用该柯巴基焦磷酸合酶可以催化ggpp合成nor-cpp。

5、本发明还提供了编码所述柯巴基焦磷酸合酶的编码基因。具体的，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

6、本发明还提供了一种包含所述柯巴基焦磷酸合酶编码基因的重组质粒。所述重组质粒的原始载体可以采用原核表达载体，也可以采用真核表达载体。作为优选，所述重组质粒的原始载体为pyes2载体或pmal载体。

7、本发明还提供了一种包含所述重组质粒的重组基因工程菌。所述重组质粒转化宿主细胞获得重组基因工程菌，所述宿主细胞可以为本领域的各种常规宿主细胞，作为优选，宿主菌为酵母或大肠杆菌。

8、本发明可以利用重组基因工程菌过表达生产柯巴基焦磷酸合酶，也可以在宿主菌中引入柯巴基焦磷酸合酶编码基因以及其他参与二萜化合物生物合成代谢途径酶的编码基因构建基因工程菌，通过体内代谢生产具有生物活性的二萜化合物。

9、本发明的另一个目的是提供所述的柯巴基焦磷酸合酶在催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸生产normal 构型的柯巴基焦磷酸中的应用。

10、作为本发明的一种具体实施方式，所述应用包括：以含有所述柯巴基焦磷酸合酶编码基因的工程菌经发酵培养后离心获得的湿菌体、湿菌体固定化细胞、湿菌体超声破碎后提取的酶或者固定化酶为催化剂，以牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸为底物，以ph为7.5±0.2的缓冲液为反应介质，在25-30℃、100-150 rpm条件下反应，反应结束后，将反应液分离纯化获得normal 构型的柯巴基焦磷酸。

11、本发明通过生物合成柯巴基焦磷酸合酶，作为催化剂在体外催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸生产柯巴基焦磷酸。柯巴基焦磷酸合酶可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，也可以是部分纯化或完全纯化的酶的形式使用，也可以利用本领域已知的固定化技术将所述柯巴基焦磷酸合酶制成固定化酶或固定化细胞形式的生物催化剂。

12、作为优选，所述工程菌的宿主细胞为大肠杆菌de3；工程菌内含有用于表达柯巴基焦磷酸合酶的重组质粒，所述重组质粒由pmal-c2x载体以及克隆于载体多克隆位点的柯巴基焦磷酸合酶编码基因组成。

13、作为本发明的另一种具体实施方式，所述应用包括：将所述柯巴基焦磷酸合酶的编码基因克隆到表达载体中构建重组质粒，然后将重组质粒转化至具有牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成途径的宿主细胞中构建重组工程菌，进行发酵培养，表达的柯巴基焦磷酸合酶对牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸催化反应。

14、作为优选，所述宿主细胞为酿酒酵母hz16。

15、本发明具备的有益效果：

16、本发明从温郁金中克隆得到一个新的柯巴基焦磷酸合酶基因

cwditps1，其编码的柯巴基焦磷酸合酶可以催化二萜前体牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸生成normal 构型的柯巴基焦磷酸。作为首例报道的温郁金来源class ⅱ二萜合酶，本发明不仅为探讨单子叶中二萜合酶的功能进化提供了新视角，更为解析温郁金中二萜化合物的生物合成途径奠定了基础。本发明提供的柯巴基焦磷酸合酶在生产具有生物活性的二萜化合物中具有良好的应用前景。

1.一种温郁金来源的柯巴基焦磷酸合酶，其特征在于，所述柯巴基焦磷酸合酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。

2.一种编码如权利要求1所述的柯巴基焦磷酸合酶的编码基因。

3.一种包含如权利要求2所述的编码基因的重组质粒。

4.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的原始载体为pyes2载体或pmal载体。

5.一种包含如权利要求3或4所述的重组质粒的重组基因工程菌。

6.如权利要求5所述的重组基因工程菌，其特征在于，所述重组基因工程菌的宿主菌为酵母或大肠杆菌。

7.如权利要求1所述的柯巴基焦磷酸合酶在催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸生产normal构型的柯巴基焦磷酸中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括：以含有所述柯巴基焦磷酸合酶编码基因的工程菌经发酵培养后离心获得的湿菌体、湿菌体固定化细胞、湿菌体超声破碎后提取的酶或者固定化酶为催化剂，以牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸为底物，以ph为7.5±0.2的缓冲液为反应介质，在25-30℃、100-150 rpm条件下反应，反应结束后，将反应液分离纯化获得normal 构型的柯巴基焦磷酸。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述工程菌的宿主细胞为大肠杆菌de3；工程菌内含有用于表达柯巴基焦磷酸合酶的重组质粒，所述重组质粒由pmal-c2x载体以及克隆于载体多克隆位点的柯巴基焦磷酸合酶编码基因组成。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述柯巴基焦磷酸合酶的编码基因克隆到表达载体中构建重组质粒，然后将重组质粒转化至具有牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成途径的宿主细胞中构建重组工程菌，进行发酵培养，表达的柯巴基焦磷酸合酶对牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸催化反应。