一种AM真菌诱导富集的文冠果根系皂苷的制备方法

本发明涉及文冠果栽培，具体涉及一种am真菌诱导富集的文冠果根系皂苷的制备方法。

背景技术：

1、文冠果（

xanthoceras sorbifolium）是我国特有的木本油料树种，广泛分布于华北、西北及东北地区。近年来研究发现，文冠果不同组织部位含有丰富的生物活性成分，其中三萜皂苷类化合物因其具有抗炎、抗肿瘤、神经保护、增强记忆力等多种药理活性而备受关注。

2、目前，文冠果皂苷的原料主要来源于文冠果的种皮、果壳或成年树的根皮和茎皮。然而，成年文冠果树生长周期长，通常需5~8年才能形成可采集的根系，且剥取根皮会严重损伤甚至毁坏树木，资源再生性差，而一年生或二年生幼苗根系生物量偏低，难以直接作为皂苷提取原料，导致原料可持续供给受限。现有技术中提升文冠果皂苷含量主要采取非生物胁迫诱导，通过对植株施加干旱、盐碱或重金属等环境胁迫，刺激文冠果启动防御性次生代谢，从而在一定程度上提高皂苷积累量。然而，非生物胁迫诱导的效果高度依赖胁迫强度与持续时间的精准把控，胁迫过轻则诱导效果不显著，过重则抑制植株生长甚至导致死亡，难以在保证生物量的同时实现皂苷含量的稳定提升。

技术实现思路

1、为解决现有文冠果皂苷原料供给周期长、胁迫诱导难以兼顾生物量与皂苷积累的问题，本发明提供了一种am真菌诱导富集的文冠果根系皂苷的制备方法。

2、本发明采取以下技术方案：

3、本发明提供了一种am真菌诱导富集的文冠果根系皂苷的制备方法，包括如下步骤：

4、将文冠果种子播种后培育至获得根系完整的实生幼苗；

5、移栽文冠果实生幼苗时接种am菌剂，移栽后培育得到1~2年生菌根化幼苗；所述am菌剂由根内根孢囊霉经分层接种法扩繁后获得，孢子密度≥50个/g；

6、对1~2年生菌根化幼苗施加干旱-低磷双重胁迫处理，采用有效磷初始含量<5 mg/kg的栽培基质，胁迫期间浇灌无磷hoagland营养液以调控基质有效磷含量，并控制土壤含水量为田间最大持水量的30%~50%；

7、胁迫处理后，采收文冠果1~2年生菌根化幼苗得出完整根系，经烘干、粉碎过筛后制得根粉原料；

8、根粉原料经乙醇回流提取、树脂纯化、梯度洗脱和冷冻干燥，获得文冠果根系皂苷。

9、本发明以文冠果幼苗根系替代传统成年树根皮作为皂苷原料，建立了一种“am真菌共生诱导+苗龄适配型干旱-低磷双重胁迫”协同富集根系皂苷的获取方法：先对文冠果幼苗接种am真菌并共生培养，利用共生关系激活三萜皂苷生物合成通路，获得菌根化幼苗；再针对一年生和二年生幼苗分别施以不同强度的干旱胁迫与低磷胁迫，通过“苗龄适配”的精准胁迫方案，在保障幼苗正常存活、维持根系生物量的前提下，利用非生物逆境进一步上调皂苷积累相关基因的表达，从而在短时间内实现幼苗根系中皂苷的高效定向富集。该方法将am真菌的生物诱导与适配性物理胁迫有机整合，利用两者间的协同增效克服了传统胁迫方法中胁迫损伤与积累量难以兼顾的瓶颈，突破了单一因素调控的局限，为短周期、高含量文冠果根系皂苷的获取提供了新的途径。

10、进一步地，所述烘干的温度为50℃~70℃，烘干至恒重。

11、进一步地，所述过筛为过50~80目筛。

12、进一步地，所述乙醇回流提取的工艺参数为：乙醇体积浓度60%~80%，料液比1：10~1：14，提取温度55℃~65℃，提取次数2~4次，合并提取液后减压浓缩脱除乙醇，加水定容得到总皂苷粗提液。

13、进一步地，所述减压浓缩的温度为45℃~55℃。

14、进一步地，所述树脂纯化为：将乙醇回流提取得到的总皂苷粗提液上样至大孔吸附树脂；所述大孔吸附树脂为ab-8型树脂。

15、进一步地，所述梯度洗脱依次采用蒸馏水、25%乙醇溶液、70%乙醇溶液进行洗脱，收集70%乙醇洗脱组分；上样完成后先静态吸附25 min~35 min，再启动梯度洗脱程序。

16、进一步地，所述冷冻干燥的工艺条件为：先于-15℃~-25℃条件下预冻，再转入冷阱温度-50℃~-60℃、真空度10pa~20 pa的环境中干燥至恒重。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

18、本发明首次以一年生或二年生文冠果幼苗根系作为皂苷原料，突破了传统依赖成年树（5~8年）根皮或种皮的局限，将皂苷原料的获取周期大幅缩短至1~2年，同时充分利用通常被废弃的幼苗根系，实现了农林生物质资源的高值化转化，兼具显著的经济效益与生态效益。在可控环境条件下，对文冠果幼苗接种am真菌（根内根孢囊霉）并建立共生关系获得菌根化幼苗，再结合针对不同苗龄的干旱-低磷双重胁迫精准调控（一年生：田间持水量40%~50%，胁迫14天；二年生：30%~40%，胁迫21天），通过“苗龄适配型”精准胁迫方案，在保障幼苗正常存活、维持根系生物量的前提下，有效诱导根系皂苷积累，成功解决了传统胁迫方法中胁迫窗口窄、生物量与积累量难以兼顾的技术难题。实验数据表明，单独接种am真菌可使根部皂苷含量较未接种对照提高104.5%（从1.12 mg/g增至2.29 mg/g）；在干旱-低磷双重胁迫下，菌根化幼苗根中皂苷含量达4.65 mg/g，较未胁迫菌根苗再提高103.1%，较传统原料（通常为1%~3%）提高1.5~4倍。进一步设置不接种am真菌但施加同等胁迫的对照（ck4，皂苷含量2.65 mg/g）证实，单独胁迫虽有一定诱导效果，但am真菌接种与胁迫处理之间存在显著协同增效，而非简单效应叠加——在相同胁迫条件下，接种am真菌使皂苷含量额外提升75.5%，表明am真菌的共生诱导是克服胁迫损伤、协同放大皂苷积累效应的关键。此外，干旱-低磷组合的诱导效果不仅优于干旱-盐胁迫组合及任一单一胁迫，更经多重对比确认为最优胁迫配对方式，能够在避免植株严重损伤的前提下，稳定、高效地实现幼苗根中皂苷的定向富集。

19、本发明建立了针对菌根化文冠果幼苗根系的专属提取纯化工艺，采用60%~80%乙醇加热回流提取（优选70%乙醇、料液比1:12、60℃、提取3次），结合ab-8型大孔吸附树脂梯度洗脱（蒸馏水→25%乙醇→70%乙醇→95%乙醇），其中70%乙醇洗脱段集中了总洗脱皂苷的78.6%，且该流分中总皂苷纯度高达51.30%。经纯化后，终产品中总皂苷含量可达49.18%（以冻干物干重计），皂苷回收率超过85%（ab-8树脂达85.68%），二年生幼苗根的总皂苷得率达5.20%。该工艺操作简便、条件温和，兼具高回收率与高纯度优势，充分满足药用原料的质量要求，且所选用树脂可经95%乙醇再生后重复使用，具有良好的工业化应用前景。

1.一种am真菌诱导富集的文冠果根系皂苷的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述烘干的温度为50℃~70℃，烘干至恒重。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述过筛为过50~80目筛。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇回流提取的工艺参数为：乙醇体积浓度60%~80%，料液比1：10~1：14，提取温度55℃~65℃，提取次数2~4次，合并提取液后减压浓缩脱除乙醇，加水定容得到总皂苷粗提液。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述减压浓缩的温度为45℃~55℃。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述树脂纯化为：将乙醇回流提取得到的总皂苷粗提液上样至大孔吸附树脂；所述大孔吸附树脂为ab-8型树脂。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述梯度洗脱依次采用蒸馏水、25%乙醇溶液、70%乙醇溶液进行洗脱，收集70%乙醇洗脱组分；上样完成后先静态吸附25 min~35min，再启动梯度洗脱程序。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的工艺条件为：先于-15℃~-25℃条件下预冻，再转入冷阱温度-50℃~-60℃、真空度10pa~20 pa的环境中干燥至恒重。