一种葡萄剪接因子VvSR45及其在采后抑制失水中的应用

本发明属于生物，尤其是一种葡萄剪接因子vvsr45及其在采后抑制失水中的应用。

背景技术：

1、水分是果蔬生命活动的核心物质，其含量直接决定了果实的新鲜度与商品价值。然而，在当前的果蔬全球供应链中，采后损耗问题异常突出。全球果蔬产量约有45-55%在生产到销售的价值链中流失，而失水是诱发采后变质的首要因子。对于大多数果蔬而言，水分流失一旦达到初始重量的5%-10%，浆果即会出现萎蔫、果皮皱缩等现象，导致商品价值彻底丧失。过度的水分流失除了导致可销售重量损失外，还会促进褐变和果实软化，降低果实的营养和品质，加速衰老进程，提高膜崩解的易感性。目前关于葡萄采后失水的研究多集中于宏观生理生化描述，对分子层面的调控研究大多局限于转录水平的有无，缺乏深度的研究。

2、可变剪接（alternative splicing，as）是真核生物中一个至关重要的转录后过程，是增加蛋白质组多样性和调节mrna水平的关键调控剂。可变剪接在植物非生物胁迫、生物胁迫和生长发育中发挥重要作用。剪接位点的选择不仅由核心剪接体成分决定，而且在很大程度上由外源性非剪接体rna结合蛋白（剪接因子）决定，主要是富含丝氨酸/精氨酸（sr）的蛋白质和异质性核糖核蛋白，它们与位于内含子或外显子中的顺式调控元件结合，从而激活或抑制剪接。剪接因子sr45作为sr家族蛋白的核心成员，在植物发育、抗逆、免疫以及疾病应答中扮演着多功能“桥梁”角色。现有研究表明，sr45自身发生可变剪接产生两个同源异构体，在发育、盐胁迫和磷酸化调控中发挥重要作用。此外，sr45还负责调控脱落酸和葡萄糖信号通路，也是植物先天免疫的负调节因子。虽然在模式植物中sr45的研究已取得较多进展，但在葡萄中该类研究仍处于起步阶段。尽管sr45能在植物非生物胁迫中发挥重要作用，且已有研究表明其它sr家族剪接因子，如scl30参与植物抗干旱，但葡萄中vvsr45能否在采后失水中发挥重要作用尚未可知。

3、现有技术缺乏能特异性响应采后失水这一特定生理过程的葡萄内源sr基因，无法在不依赖母体供应的情况下实现果实的自主水分调节。由于缺乏对vvsr45等关键基因的功能验证，目前葡萄产业中仍缺乏能够从转录后层面有效延长货架期、维持果实品质的生物技术方案。

4、因此，明确vvsr45基因在采后葡萄失水中的具体作用机制并开发相应的分子调控技术具有重要意义。从宏观和微观层面揭示vvsr45对葡萄水分散失的正向保护作用。通过对水通道蛋白以及核心抗逆基因表达的精准调控，显著提升了葡萄在离体状态下的抑制失水的能力。本发明的实施可有效降低葡萄采后损耗，为提升产业链经济效益提供分子层面的技术支撑。

5、通过检索，发现如下几篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

6、1、中国专利公开文献cn117603990a，一种赤霞珠葡萄抗旱基因vvdreb2a及其应用，主要聚焦于转录水平的调控，通过过表达vvdreb2a提高葡萄愈伤组织的抗旱性及花色苷合成。其存在的问题在于，调控手段单一，且主要针对葡萄愈伤组织的抗旱，未能解决采后浆果在脱离母体后，由于复杂的可变剪接调节失效导致的快速失水问题。在采后极端水分胁迫下，单纯的转录调控往往响应滞后，产生的抗逆效果不理想。

7、2、中国专利公开文献cn117327714a，澳洲野生棉剪接因子gausr45a及其应用，公开了澳洲野生棉剪接因子gausr45a在抗黄萎病方面的应用。物种来源（棉花）与葡萄差异巨大，且调控的功能方向为生物胁迫（抗病）而非水分相关的非生物胁迫。剪接因子在不同物种和不同胁迫下的剪接靶标具有高度特异性，因此无法为解决葡萄采后失水提供直接的技术指导。

8、3、中国专利公开文献cn112342219a，木薯基因mescl30及其在抗干旱胁迫中的应用，证明了sr类剪接因子能提高木薯的耐旱性，但其技术点主要针对的是木薯植株的抗旱。其问题在于，未涉及果实采后的失水生理调控。葡萄浆果采后失水涉及独特的角质层结构改变和水通道蛋白调节，木薯的抗旱机制难以直接平移至葡萄浆果的采后保鲜，导致其实际应用范围窄，对提升葡萄货架期的贡献度较低。

9、通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种葡萄剪接因子vvsr45及其在采后抑制失水中的应用。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种葡萄剪接因子vvsr45，所述葡萄剪接因子vvsr45的基因序列如seq id no.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、如上所述的葡萄剪接因子vvsr45在果蔬采后抑制失水和/或维持果皮细胞结构稳定性中的应用。

5、进一步地，所述果蔬为葡萄。

6、一种过表达葡萄剪接因子vvsr45基因在抑制葡萄失水中的应用，所述vvsr45基因的基因序列如seq id no.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

7、进一步地，所述抑制葡萄失水的指标体现在外观、失水量、硬度、果皮细胞和细胞壁形态。

8、一种过表达葡萄剪接因子vvsr45基因在水通道蛋白和抗逆相关基因的表达水平中的应用，所述葡萄剪接因子vvsr45基因的基因序列如seq id no.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

9、一种包含葡萄剪接因子vvsr45基因的vvsr45过表达的oe-vvsr45载体，所述vvsr45基因的基因序列如seq id no.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

10、如上所述的oe-vvsr45载体的构建方法，包括如下步骤：

11、（1）vvsr45基因的扩增与回收

12、提取葡萄果皮组织的总rna并反转录为cdna，以所述cdna为模板，采用核苷酸序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示的引物进行pcr扩增，得到pcr产物；所述pcr扩增的退火温度为61℃，循环数为35个循环；对扩增得到的vvsr45基因pcr产物进行检测和回收；

13、（2）重组质粒的构建与鉴定

14、将检测和回收得到的vvsr45基因pcr产物与pnc-cam1304-subc载体质粒进行nc克隆反应，所述nc克隆反应的温度为50℃，时间为30-60 min；将所得反应产物转化至dh5α感受态细胞，经50 μg/ml卡那霉素抗性筛选后，采用核苷酸序列分别如seq id no.3和seq idno.5所示的引物进行菌落pcr鉴定，并对阳性菌落进行测序验证，获得含vvsr45基因的重组质粒；

15、（3）农杆菌转化与阳性鉴定

16、将测序正确的重组质粒转化至农杆菌感受态细胞，经50 μg/ml卡那霉素和20 μg/ml利福平的培养基筛选后，对所得菌落进行pcr鉴定，获得oe-vvsr45载体。

17、如上所述的oe-vvsr45载体在调控采后葡萄失水中的应用。

18、如上所述的oe-vvsr45载体在减缓细胞失水损伤中的应用。

19、本发明取得的优点和积极效果为：

20、1、本发明通过过表达葡萄vvsr45基因，可显著减缓采后葡萄浆果的水分散失。在25℃、相对湿度60%的贮藏条件下，oe-vvsr45组在贮藏第4天和第6天的失水量均显著低于ev-oe对照组，表明vvsr45对葡萄采后失水具有抑制作用。

21、2、本发明能够减缓采后葡萄浆果硬度下降。与ev-oe对照组相比，oe-vvsr45组在贮藏第4天和第6天保持了较高的果实硬度，有利于维持采后葡萄浆果的质地品质。

22、3、本发明透射电镜观察表明，过表达vvsr45后，葡萄果皮细胞壁轮廓相对规整，原生质体与细胞壁的贴合程度较好，广泛的原生质体收缩和质壁分离现象较弱，胞内膜系统和原生质体的保存程度优于ev-oe对照组，说明vvsr45过表达能够减轻失水条件下的果皮细胞结构损伤。

23、4、本发明明确了vvsr45过表达与水通道蛋白及抗逆相关基因表达变化的关系。与ev-oe对照组相比，oe-vvsr45组中

vvpip2-5、vvaco、vvpal和

vvwrky75的表达量均显著升高，为进一步研究葡萄采后失水的分子调控及相关遗传改良提供了候选基因和载体工具。

24、5、本发明vvsr45对葡萄采后失水及品质能够实现宏观正向调控，公开的vvsr45基因具有seq id no.1所示的序列，其在葡萄采后失水胁迫下被强烈诱导。通过外源瞬时过表达提高其表达量，可显著减缓浆果25℃和60%湿度储藏条件下的水分散失速度。实验结果表明，贮藏6天后，oe-vvsr45组与过表达ev-oe对照组相比失水量显著降低，具体失水量分别为13.82%和8.88%。同时减缓了果实的硬度下降，具体硬度分别为0.64 n和0.60 n（图3）。

25、6、本发明vvsr45能够对果皮细胞结构稳定性进行调控，从浆果的外果皮的细胞形态、原生质体和细胞壁等角度揭示了采后果皮的分子调控机制，为果实采后失水的研究提供了新的理论和技术支撑。通过透射电镜观察细胞结构和细胞壁形态，明确了vvsr45基因过表达对失水损伤的延缓作用。ev-oe对照组果皮细胞中可见较大的电子透明区域，说明液泡显著扩大或融合；细胞质多被压缩至细胞周边，并出现分布不均、局部凝聚和碎片化。部分原生质体与细胞壁之间存在分离，细胞轮廓较扁长，表示细胞膨压下降并伴随一定程度的结构塌陷。虽然细胞壁主体尚保持连续，但胞内膜结构清晰度下降，小泡状结构增多，说明液泡膜及其他膜系统已受到较明显损伤。因此，ev-oe组表现为较明显的失水胁迫和细胞超微结构破坏。oe-vvsr45组细胞壁轮廓相对规整，中央细胞内仍可观察到较丰富、较连续的颗粒状细胞质，原生质体对细胞腔的占据程度相对较高，与细胞壁的贴合也相对较好。与ev-oe相比，广泛的原生质体收缩和质壁分离现象较弱。该组仍存在液泡扩大、小泡化及局部胞内结构模糊，说明细胞同样受到失水胁迫，但膜系统和原生质体的保存程度总体优于ev-oe（图4）。vvsr45过表达能提高葡萄果皮细胞在失水胁迫下的结构稳定性，减轻原生质体收缩、液泡异常变化及膜系统解体，从而延缓细胞失水损伤。

26、7、本发明vvsr45能够对水通道蛋白和抗逆基因表达精准调控，从分子层面深度解析了vvsr45对采后果实失水的正调控作用。检测了水通道蛋白和抗逆行相关基因的表达变化。结果表明，与ev-oe组相比过表达vvsr45组水通道蛋白基因

vvpip2-5的表达量提高1.4倍，抗逆基因

vvaco的表达量提高3.5倍，

vvpal的表达量提高1.4倍，

vvwrky75的表达量提高1.8倍（图5）。vvsr45通过分子级联反应，调控跨膜水分运输效率，维持细胞内环境稳定。同时，通过提高抗逆基因的表达，在多层面增强果实对失水的响应。