一种基于人源鲜味受体细胞模型的鲜味活性及增鲜效果评价方法

本发明涉及一种基于人源鲜味受体细胞模型的鲜味活性及增鲜效果评价方法，属于味觉检测。

背景技术：

1、鲜味是食品五大基本味觉之一，主要由谷氨酸钠、呈味核苷酸以及鲜味肽等呈味物质共同作用产生，对食品风味品质和消费者接受度具有重要影响。目前，食品中鲜味物质的评价主要依赖感官评价、电子舌分析以及化学检测等方法。然而，感官评价易受到评价人员经验、状态及环境因素影响，存在主观性强、重复性差和通量有限等问题；电子舌虽然能够对滋味差异进行快速分析，但其响应机制基于人工传感器材料，无法真实反映人体味觉受体介导的分子识别过程。因此，建立一种基于人体味觉感知机制、能够客观评价鲜味活性的检测方法，对于鲜味物质筛选及食品风味调控具有重要意义。

2、人体鲜味感知主要由位于味蕾细胞膜上的鲜味受体介导，其中t1r1/t1r3异源二聚体被认为是识别氨基酸、核苷酸及部分鲜味肽的重要受体。鲜味分子与t1r1/t1r3受体结合后，可激活下游g蛋白偶联信号通路，引起细胞内钙离子浓度变化，并进一步产生味觉信号传递。然而，现有鲜味评价方法大多无法直接反映鲜味分子与受体之间的相互作用过程，难以实现对鲜味分子受体激活能力以及不同分子间协同增鲜效应的定量评价。特别是在鲜味增强剂开发过程中，部分呈味肽自身鲜味较弱，但能够显著增强谷氨酸钠（msg）等鲜味物质的响应能力，传统评价方法难以准确区分其自身鲜味活性与协同增鲜作用。

3、近年来，基于味觉受体表达细胞模型的功能评价方法逐渐受到关注。然而，目前相关细胞评价体系仍存在检测指标单一、难以同时评价鲜味激活能力和协同增鲜能力等不足。因此，开发一种基于人源鲜味受体、能够同时评价鲜味活性及增鲜效果的细胞模型及相应的鲜味评价方法，对于高效筛选新型鲜味分子和天然增鲜成分具有重要应用价值。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供基于人源鲜味受体细胞模型的鲜味活性及增鲜效果评价方法，目的是建立一种基于人体味觉感知机制的客观化、定量化鲜味评价方法，实现对鲜味分子受体激活能力及协同增鲜能力的快速评价。

2、本发明采用的技术方案如下：

3、本技术提供基于人源鲜味受体细胞模型的鲜味活性及增鲜效果评价方法，包括：

4、s1、设计并构建携带人源鲜味受体及信号转导相关基因的重组表达载体；

5、s2、将所述重组表达载体导入hek-293细胞中，构建人源鲜味受体细胞模型；

6、s3、对转染后的人源鲜味受体细胞进行抗性筛选培养，获得稳定表达鲜味受体信号通路的阳性细胞株；

7、s4、培养并鉴定所获得的人源鲜味受体细胞模型，将筛选获得的阳性细胞株进行扩大培养；

8、s5、将待测鲜味分子加入人源鲜味受体细胞模型中进行刺激，并采用钙离子荧光检测方法获得细胞响应信号；

9、根据不同浓度鲜味分子诱导产生的细胞响应信号，建立剂量-响应曲线，获得ec50，以评价鲜味分子的受体激活能力；

10、或，

11、s6、在s5的基础上，将待测鲜味分子与标准鲜味物质进行复配，通过比较复配体系与标准鲜味物质单独作用体系的响应变化，评价鲜味分子的增鲜效果。

12、在一种实施方式中，步骤s1中，所述人源鲜味受体及信号转导相关基因包括人源tas1r1基因（seq id no: 1所示）、tas1r3基因（seq id no: 2所示）以及gα16-gust44信号转导元件编码基因（seq id no: 3所示）。

13、在一种实施方式中，步骤s1中，所述人源tas1r1基因和tas1r3基因通过连接肽（核苷酸序列如seq id no: 4所示）连接，构建tas1r1/tas1r3双基因共表达表达框。

14、在一种实施方式中，步骤s1中，人源tas1r1和tas1r3受体用于识别鲜味分子刺激，所述gα16-gust44信号转导元件用于增强人源鲜味受体介导的细胞内信号传递，提高鲜味分子刺激后的细胞响应强度。

15、在一种实施方式中，步骤s1中，所述重组表达载体为适用于哺乳动物细胞表达的真核表达载体。

16、在一种实施方式中，步骤s2中，所述宿主细胞为hek-293细胞或hek-293t细胞。

17、在一种实施方式中，步骤s2中，所述重组表达载体通过转染方式导入hek-293细胞中，所述转染方式包括电转染、脂质体介导转染或病毒介导转染。

18、在一种实施方式中，步骤s2中，所述携带tas1r1/tas1r3表达框以及gα16-gust44表达框的重组表达载体共同导入hek-293细胞。

19、在一种实施方式中，步骤s3中，所述转染后的hek-293细胞采用含有筛选抗生素的培养基进行抗性筛选，以获得稳定表达鲜味受体信号通路的阳性细胞株。

20、在一种实施方式中，步骤s3中，所述筛选抗生素包括嘌呤霉素（puromycin）和潮霉素（hygromycin）。

21、在一种实施方式中，步骤s3中，所述puromycin筛选浓度为0.5～2 μg/ml，优选为1μg/ml；所述hygromycin筛选浓度为400～1000 μg/ml，优选为800 μg/ml。

22、在一种实施方式中，步骤s4中，所述阳性细胞株采用dmem高糖培养基进行培养，所述培养基包括10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素混合液。

23、在一种实施方式中，步骤s4中，所述细胞培养条件为37℃、5% co2培养环境。

24、在一种实施方式中，步骤s4中，当细胞融合度达到80%～90%时进行细胞传代培养。

25、在一种实施方式中，步骤s4中，采用实时荧光定量pcr、western blot检测或免疫荧光染色方法对人源鲜味受体表达情况进行鉴定。

26、在一种实施方式中，步骤s4中，所述鉴定指标包括tas1r1基因表达水平、tas1r3基因表达水平以及gα16-gust44信号转导元件表达水平。

27、在一种实施方式中，步骤s5中，所述待测鲜味分子包括谷氨酸钠、呈味核苷酸、鲜味肽、谷氨酰肽以及天然食品来源呈味物质中的一种或多种。

28、在一种实施方式中，步骤s5中，所述鲜味分子包括蛋白酶解产物、发酵产物、天然提取物以及人工合成呈味物质。

29、在一种实施方式中，步骤s5中，将不同浓度梯度的待测鲜味分子加入人源鲜味受体细胞模型中进行刺激，通过检测细胞内ca²+浓度变化获得细胞响应信号。

30、在一种实施方式中，步骤s5中，所述钙离子响应信号通过钙离子荧光探针进行检测。

31、在一种实施方式中，步骤s5中，所述钙离子荧光探针包括但不限于fluo-4 am、fluo-8 am、cal-520 am中的一种或多种。

32、作为具体实施方式，fluo-8 am工作浓度为5 μmol/l，细胞与fluo-8 am于37℃避光孵育30 min。

33、作为具体实施方式，采用多功能酶标仪检测细胞荧光响应信号，其中激发波长为488 nm，发射波长为515 nm。

34、在一种实施方式中，步骤s5中，根据不同浓度鲜味分子诱导产生的细胞响应信号，建立鲜味分子浓度与细胞响应强度之间的剂量-响应曲线。

35、在一种实施方式中，步骤s5中，采用非线性回归模型对剂量-响应曲线进行拟合，获得ec50。

36、在一种实施方式中，步骤s5中，所述鲜味活性评价指标包括半数有效浓度ec50以及剂量-响应曲线变化趋势。ec50用于评价鲜味肽激活htas1r1/htas1r3受体的敏感程度。

37、在一种实施方式中，步骤s5中，ec50的计算公式为：；

38、其中，：不同浓度刺激物对应的ca²+响应值（y=（ft-f0）/f0）；：鲜味刺激物加入前细胞的基础荧光强度；：鲜味刺激物刺激后某一时间点的荧光强度；：刺激物浓度的对数值（log concentration）；：最大荧光响应值（）；：基础响应值；：诱导50%最大响应所需的刺激物浓度；：剂量-响应曲线斜率参数。

39、在一种实施方式中，步骤s6中，将待测鲜味分子与标准鲜味物质进行复配，构建增鲜效果评价体系。

40、在一种实施方式中，步骤s6中，所述标准鲜味物质为谷氨酸钠（msg）。

41、在一种实施方式中，步骤s6中，通过比较msg单独作用体系与msg-待测鲜味分子复配体系的细胞响应信号变化评价增鲜效果。

42、在一种实施方式中，步骤s6中，所述增鲜效果评价指标包括ec50变化以及剂量-响应曲线位移程度。

43、在一种实施方式中，步骤s6中，ec50位移的计算公式为：ec50位移=；

44、其中ec50(msg)表示用msg刺激权利要求1所述人源鲜味受体细胞时，诱导50%最大响应所需的刺激物浓度；ec50(msg+待测鲜味分子)表示同时用msg和待测鲜味分子刺激权利要求1所述人源鲜味受体细胞时，诱导50%最大响应所需的刺激物浓度；

45、在一种实施方式中，步骤s6中，当待测鲜味分子降低msg体系ec50值时，表明所述待测鲜味分子具有协同增鲜效果。

46、本技术还提供一种利用上述基于人源鲜味受体细胞模型的鲜味活性及增鲜效果评价方法筛选获得的鲜味活性物质或增鲜物质。

47、本技术还提供一种上述鲜味活性物质或增鲜物质在食品调味、低钠食品开发、天然增鲜剂制备以及食品风味改善中的应用。

48、本发明提供了一种基于人源鲜味受体细胞模型的鲜味活性及增鲜效果评价方法，通过构建稳定表达人源tas1r1/tas1r3鲜味受体及gα16-gust44信号转导元件的hek-293细胞模型，使细胞具有人源鲜味感知相关的信号响应能力。

49、相比传统依赖评价人员主观感知的感官评价方法，本发明建立的细胞评价体系能够基于人体鲜味受体识别机制，对鲜味分子诱导的细胞响应进行客观检测，降低个体差异对评价结果的影响，提高鲜味评价结果的稳定性和重复性。

50、相比电子舌等理化分析方法，本发明通过检测鲜味分子激活人源t1r1/t1r3受体后产生的细胞内ca²+信号变化，能够更加直接反映鲜味分子与人体鲜味受体之间的相互作用，并通过ec50实现鲜味活性的定量评价。

51、此外，本发明进一步构建鲜味增强评价体系，通过比较标准鲜味物质与待测鲜味分子复配前后的受体响应变化，实现对鲜味分子协同增鲜能力的评价，可用于鲜味肽、天然呈味物质以及新型增鲜剂的快速筛选。

52、本发明建立的人源鲜味受体细胞模型具有检测效率高、评价过程客观、可实现批量筛选等优点，可为食品风味调控、低钠食品开发以及天然鲜味增强剂研发提供新的技术方法。

53、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，或者通过实施本发明而了解。

54、本发明的有益效果如下：

55、本发明提供了一种基于人源鲜味受体细胞模型的鲜味活性及增鲜效果评价方法，通过构建稳定表达人源tas1r1/tas1r3鲜味受体以及gα16-gust44信号转导元件的hek-293细胞模型，实现了基于人体鲜味感知机制的鲜味分子功能评价。

56、相比传统感官评价方法，本发明建立的评价体系不依赖评价人员主观感受，能够通过检测鲜味分子诱导的细胞信号响应变化，对鲜味活性进行客观、定量评价，降低个体差异、评价环境等因素对检测结果的影响，提高评价结果的稳定性和重复性。

57、相比电子舌等理化分析方法，本发明基于人源鲜味受体识别机制，通过检测鲜味分子激活t1r1/t1r3受体后产生的细胞内ca²+信号变化，能够更加直接反映鲜味分子与人体鲜味受体之间的相互作用，并利用ec50实现对鲜味活性的定量表征。

58、此外，本发明进一步建立了基于谷氨酸钠复配体系的增鲜效果评价方法，通过比较标准鲜味物质与待测鲜味分子复配前后的受体响应变化，实现对鲜味增强能力的评价，可用于鲜味肽、天然呈味物质及新型增鲜剂的筛选。

59、本发明所构建的人源鲜味受体细胞模型具有响应机制明确、检测过程客观、评价效率高以及适用于多种鲜味物质筛选等优点，可为食品风味调控、低钠食品开发以及天然鲜味增强剂研发提供可靠的技术方法。