一种三维光电协同酶促基因合成芯片及方法

本发明属于半导体合成生物学与集成电路设计交叉领域，具体涉及一种三维光电协同酶促基因合成芯片及方法。

背景技术：

1、本部分的陈述仅仅是提供了与本发明相关的背景技术信息，不必然构成在先技术。

2、酶促dna合成技术（enzymatic dna synthesis，eds）以末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，tdt）等工程化酶为核心催化剂，在水相温和条件下实现脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，dna）链逐步延伸，具有反应条件温和、低错误率及环境友好等优势，是突破化学法合成局限的重要方向。

3、现有酶促合成方案多为溶液相批次反应或微流控通道架构，反应体积仍在微升级别，难以在空间分辨率与并行通量之间取得平衡，无法满足大规模、高精度、低成本的基因合成需求。

4、也有部分现有文献提出了在芯片上固定末端脱氧核苷酸转移酶及dna引物探针，通过酶促方式实现碱基延伸合成或采用不同tdt变体将3'-o-可逆封闭的脱氧核苷三磷酸掺入生长链，以实现可控的逐步合成。然而，上述方案中光控脱保护单元与微流控反应单元在空间上相互独立，各功能单元之间的时序协同依赖外部控制系统，导致光控脱保护、酶促碱基延伸与荧光检测三个功能单元无法在单一芯片封装内实现时空同步协同。

5、同时，现有方案中合成过程与质量检测在物理空间和时间维度上分离，合成错误只能在终点通过片外离线检测手段发现，无法构建实时闭环控制回路；此外，光电器件、微流控反应单元、单光子检测器与半导体逻辑控制器分属不同材料体系与工艺平台，在单一封装内实现异质异构垂直集成与精密光轴对准存在较大技术困难。

技术实现思路

1、本发明为了解决上述问题，提出了一种三维光电协同酶促基因合成芯片及方法，本发明将半导体集成电路设计技术、微流控技术、微机电系统（micro-electro-mechanicalsystem，mems）技术、生物合成技术融合，构建异质异构芯粒3d堆叠光电协同酶促基因合成芯片，有助于实现高通量、高质量、低成本、无环境污染的基因合成。

2、根据一些实施例，本发明采用如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种三维光电协同酶促基因合成芯片，包括：

4、光控芯粒，包含按照阵列分布的多个发光源，所述发光源用于根据预设的寻址信号对目标微反应池发出激发光，触发所述目标微反应池内的保护基团脱除；

5、基因合成芯粒，包含按照阵列分布的多个微反应池，每个微反应池用于固定末端脱氧核苷酸转移酶或其工程化变体，以在保护基团脱除后催化碱基延伸反应；

6、荧光传感测控芯粒，包含按照阵列分布的多个光电探测器件，用于在所述光控芯粒的触发关闭后对所述目标微反应池内碱基延伸反应的荧光信号进行检测，得到荧光检测结果；

7、伺服芯粒，分别与所述光控芯粒、所述基因合成芯粒和所述荧光传感测控芯粒通信连接，用于按照基因合成、检测与纠错的闭环逻辑控制所述光控芯粒、所述基因合成芯粒和所述荧光传感测控芯粒的动作时序；

8、所述光控芯粒、所述基因合成芯粒、所述荧光传感测控芯粒和所述伺服芯粒之间垂直堆叠封装连接，且所述发光源、所述微反应池和所述光电探测器件形成的阵列在垂直方向上相互对准，形成多个独立单元。

9、作为可选择的实施方式，所述光控芯粒包括由上至下垂直堆叠布设的寻址芯粒、发光源驱动芯粒、发光源阵列芯粒和聚光微透镜阵列芯粒，其中：

10、所述寻址芯粒与所述伺服芯粒通信连接，用于接收所述伺服芯粒发送的寻址指令，将目标微反应池的二维坐标转换为选通信号，以对目标微反应池上方对应的发光源执行像素级地址译码；

11、所述发光源驱动芯粒与所述寻址芯粒信号连接，用于根据接收到的光脉冲控制指令以及所述选通信号驱动对应发光源输出激发光；

12、所述发光源阵列芯粒与所述发光源驱动芯粒电连接，用于发出预定峰值波长的激发光；

13、所述聚光微透镜阵列芯粒位于所述发光源阵列芯粒下方，用于将所述激发光聚焦至目标微反应池的中心区域，并抑制相邻微反应池间的光串扰。

14、作为进一步限定的实施方式，所述寻址芯粒支持全局扫描、行并行、列并行和任意单元独立译码四种寻址模式。

15、作为进一步限定的实施方式，所述发光源驱动芯粒为μled驱动芯粒，集成有多路独立恒流驱动单元，每路恒流驱动单元包括数模转换器、恒流源和选通开关，所述数模转换器与所述寻址芯粒数据连接，用于根据光强等级信息输出基准电压，所述恒流源与所述数模转换器电连接，用于将所述基准电压转换为驱动电流，所述选通开关由所述选通信号控制通断。

16、作为更进一步限定的实施方式，所述驱动电流的调节范围为0.1ma至10ma，电流上升时间及下降时间均不超过预定值。

17、作为更进一步限定的实施方式，所述μled驱动芯粒还集成过流保护电路、热关断电路和静电防护电路，所述过流保护电路用于提供过流保护，所述热关断电路用于执行热关断机制，所述静电防护电路用于钳制异常电压。

18、作为进一步限定的实施方式，所述聚光微透镜阵列芯粒的基板材料为石英玻璃或蓝宝石。

19、作为可选择的实施方式，所述基因合成芯粒包括由上至下垂直堆叠布设的微流控通道层、上密封层、微反应池阵列层、下密封层和产物收集-废液处理-温控层，其中：

20、所述微流控通道层包括若干试剂供液通道、酶通道、冲洗液通道和气泡排出通道；

21、所述上密封层设有试剂注入口、酶注入口、冲洗液注入口和气泡排出口，所述试剂注入口和所述试剂供液通道连通，所述酶注入口和所述酶通道连通，所述冲洗液注入口和所述冲洗液通道连通，所述气泡排出口和所述气泡排出通道连通；

22、所述下密封层设有废液排出口和产物收集口；

23、所述产物收集-废液处理-温控层包括废液收集通道、产物收集池和温控模块，所述废液收集通道和所述废液排出口连接，所述产物收集池和所述产物收集口连接，所述温控模块用于将所述微反应池内的反应温度维持在预定范围内。

24、作为进一步限定的实施方式，所述微反应池阵列层中相邻微反应池之间的间距为20μm至50μm，微反应池的池体深度为5μm至10μm；所述微反应池的内壁表面沉积有高反射率金属薄膜，且覆盖有保护层，使壁面对激发光的反射率不低于设定百分比，相邻微反应池间的光串扰不超过设定值；

25、所述微反应池的内壁表面水接触角不超过30°；

26、所述微反应池的底部中心设有引物锚定点，用于共价固定或亲和捕获脱氧核糖核酸引物。

27、作为进一步限定的实施方式，所述温控模块包括薄膜热传感器阵列和微流控冷却液通道，所述薄膜热传感器阵列分布于所述产物收集-废液处理-温控层背面，用于采集反应温度信息，所述微流控冷却液通道内容纳有循环温控液体，所述微流控冷却液通道与所述薄膜热传感器阵列配合，通过pid闭环控制循环温控液体以调节反应温度。

28、作为可选择的实施方式，所述荧光传感测控芯粒包括由上至下垂直堆叠设置的荧光过滤透镜层、光电探测阵列层、寻址控制层和数据处理层，其中：

29、所述荧光过滤透镜层位于所述光电探测阵列层上方，用于将微反应池发出的荧光聚焦至光电探测光敏区，并滤除激发光散射及环境杂光；

30、所述光电探测阵列层与所述荧光过滤透镜层光学耦合，包括多个探测模组，每个微反应池正下方对应一个探测模组；

31、所述寻址控制层位于所述光电探测阵列层下方，集成光电探测地址译码模块和盖革-淬灭电路模块，所述光电探测地址译码模块与所述光控芯粒的寻址芯粒在空间上映射对应，在所述发光源发光照射期间，所述盖革-淬灭电路模块控制对应的探测模组处于淬灭状态，在所述发光源关闭后，所述盖革-淬灭电路模块控制对应探测模组切换至盖革模式进行单光子荧光检测；

32、所述数据处理层位于所述寻址控制层下方，用于对单光子荧光检测结果进行质量评估，并将评估结果发送至所述伺服芯粒。

33、作为进一步限定的实施方式，所述荧光过滤透镜层采用四色滤光阵列，四个象限分别对应a、t、c、g四种碱基荧光染料的特征波长；

34、所述光电探测阵列层包括多个呈阵列布设的探测模组，每个探测模组包括2×2个单光子雪崩二极管（single-photon avalanche diode，spad），每个单光子雪崩二极管分别对应荧光过滤透镜层的四个象限，通过分析四个单光子雪崩二极管的相对响应强度识别当前合成延伸的碱基类型，实现原位碱基类型验证。

35、作为进一步限定的实施方式，所述数据处理层包括时间数字变换（time todigital converter，tdc）模块、直方图处理模块和推理分析模块，其中：

36、所述时间数字变换模块用于记录每个光子事件的到达时间戳；

37、所述直方图处理模块用于对每个微反应池在合成周期内探测到的光子事件进行统计直方图分析，提取荧光强度、光子计数率和荧光寿命；

38、所述推理分析模块用于基于提取的数据，利用预设阈值或轻量级机器学习模型对每个微反应池的合成质量进行实时评估，评估结果通过通信接口发送至所述伺服芯粒。

39、作为可选择的实施方式，所述伺服芯粒包括光控芯粒伺服模块、基因合成芯粒伺服模块、荧光传感测控芯粒伺服模块、电源管理模块和电信号接口模块，其中：

40、所述光控芯粒伺服模块与所述光控芯粒通信连接，用于根据当前合成循环的碱基类型和目标序列信息向所述光控芯粒发送相应的寻址指令和光脉冲控制指令，并在接收到所述荧光传感测控芯粒反馈的合成错误信息后动态调整出错点位的光控参数；

41、所述基因合成芯粒伺服模块通过外部电信号接口与外部泵阀通信连接，用于按时序发送试剂注入、冲洗液注入、废液排出和产物收集的控制指令；

42、所述荧光传感测控芯粒伺服模块与所述荧光传感测控芯粒通信连接，设置有淬灭同步电路，用于在发光源驱动信号上升沿触发后预定时间内完成光电探测器件的全局淬灭，并在荧光检测阶段配置光电探测器件的读出模式；

43、所述电源管理模块包括多路稳压器和直流-直流（dc-dc）转换器，分别用于为各芯粒提供多电压等级的稳定电源，按安全时序控制各芯粒上电与下电；

44、所述电信号接口模块用于与外部上位机通信连接，实时上报合成状态并接收基因序列数据和时序控制指令。

45、作为可选择的实施方式，所述光控芯粒、基因合成芯粒、荧光传感测控芯粒和伺服芯粒通过穿透硅通孔技术和微凸点互连结构进行立体垂直堆叠封装，所述穿透硅通孔孔径为5μm至10μm，所述微凸点直径为10μm至20μm；

46、所述光控芯粒的发光源阵列采用氮化镓（gan）基工艺制造，所述荧光传感测控芯粒的光电探测器件阵列采用硅基或‌砷化镓（gaas）基工艺制造，所述伺服芯粒采用互补金属氧化物半导体（complementary metal oxide semiconductor，cmos）逻辑工艺制造，所述基因合成芯粒的微反应池阵列层采用半导体微加工（microelectromechanical systems，mems）工艺制造；

47、所述基板材料选自陶瓷基板、玻璃基板或电路板（printed circuit board，pcb）基板中的一种，封装壳体内部实施气密性封装。

48、作为可选择的实施方式，所述发光源发出的激发光经聚光微透镜聚焦后垂直向下照射微反应池中心区域，所述微反应池内碱基延伸反应产生的荧光信号垂直向下穿过微反应池底部透明窗口和荧光过滤透镜层后聚焦至对应光电探测器件的光敏区，对应的发光源、微反应池和光电探测器件三者光轴对准误差在设定范围内；

49、各微流控通道在水平面内布局，与垂直的光路不交叉；

50、液路输入端设于芯片一侧，液路输出端设于芯片另一侧；

51、通信接口集中布置于芯片上侧，电源与地接口集中布置于芯片下侧。

52、第二方面，本发明提供了一种基于上述芯片的光电协同酶促基因合成方法，包括以下步骤：

53、s1、光控脱保护与淬灭同步：所述伺服芯粒向所述光控芯粒发送寻址指令，控制发光源阵列对目标微反应池发出激发光，触发所述目标微反应池内的保护基团脱除；所述伺服芯粒向所述荧光传感测控芯粒发送淬灭指令，荧光传感测控芯粒控制对应的光电探测器件进入淬灭状态，淬灭持续时间覆盖光脉冲宽度及后续余辉衰减期；

54、s2、酶促延伸：保护基团脱除完成后，所述伺服芯粒控制外部泵阀向所述目标微反应池注入含荧光标记脱氧核苷酸的反应液，所述末端脱氧核苷酸转移酶或其工程化变体催化碱基延伸；

55、s3、冲洗残余与荧光检测：碱基延伸完成后，所述伺服芯粒控制外部泵阀向所述目标微反应池注入冲洗液，排除残余试剂；冲洗完成后，所述伺服芯粒解除光电探测器件的淬灭状态，光电探测器件切换至盖革模式，对所述目标微反应池内的荧光信号进行单光子检测，所述荧光传感测控芯粒对检测结果进行实时质量评估；

56、s4、反馈纠错与荧光基团切除：所述荧光传感测控芯粒将质量评估结果发送至所述伺服芯粒，所述伺服芯粒根据所述质量评估结果对出错的微反应池触发纠错操作，纠错完成后消除荧光背景，进入下一碱基合成循环。

57、作为可选择的实施方式，所述步骤s1中，所述发光源的光脉冲宽度为1ms至100ms，驱动电流为0.1ma至10ma；

58、所述寻址指令包含目标微反应池的二维坐标、光脉冲宽度、光脉冲序列模式和光强等级信息；

59、所述寻址模式包括全局扫描模式、行并行模式、列并行模式和任意单元独立译码模式中的一种。

60、作为可选择的实施方式，所述步骤s3中，光电探测器件阵列工作于盖革模式，所述数据处理层的时间数字变换模块以10ps至50ps的时间分辨率记录光子到达时间戳，直方图处理模块通过时间相关单光子计数直方图拟合提取荧光强度、光子计数率和荧光寿命，所述推理分析模块基于提取的数据，利用荧光强度阈值判定、碱基类型识别和异常信号检测对每个微反应池的合成质量进行实时评估。

61、作为可选择的实施方式，所述步骤s4中，所述纠错操作包括增加光脉冲宽度或驱动电流以强化脱保护、重复碱基延伸步骤和标记废弃微反应池中的至少一种；

62、全部合成循环完成后，所述伺服芯粒控制所述基因合成芯粒进行产物收集，将目标dna产物导出至芯片外部。

63、作为可选择的实施方式，所述荧光标记脱氧核苷酸（dntp-nppoc）的分子结构包括：

64、3'-o-光敏保护基团，用于可逆封闭脱氧核苷三磷酸的3'-羟基，在光控脱保护步骤中被选择性切除以暴露游离3'-羟基；

65、碱基，通过可酶切连接臂共价偶联一种特征荧光染料，所述可酶切连接臂在碱基延伸反应条件下保持稳定，在荧光基团切除步骤中通过光解断裂释放荧光染料，同时恢复游离3'-羟基。

66、有益效果

67、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

68、本发明通过伺服芯粒内固化的时序控制状态机对光控脱保护与淬灭同步、酶促延伸、冲洗残余与荧光检测、反馈纠错与荧光基团切除四个阶段实施片上统一调度，消除了现有技术中各功能单元时序协同依赖外部机械切换、无法在单一封装内实现时空同步协同的根本缺陷，将合成-检测-纠错闭环周期从传统离线测序的数小时缩短至毫秒级，显著提升了长链基因合成的保真度与有效通量。

69、本发明通过荧光传感测控芯粒伺服模块内置的淬灭同步电路能够在μled驱动信号上升沿触发后短时间内完成spad全局淬灭，实现了μled阵列与spad阵列在时序上的精确互斥联动，有效防止365nm激发光导致spad误触发或探测器饱和，使荧光检测信噪比不低于设定值，达到单光子级灵敏度，克服了现有技术中合成与检测在物理空间和时间维度上分离、无法实现原位实时检测的缺陷，使得每个微反应池的脱保护、延伸与质检可以在微秒-毫秒时间尺度上独立控制，彻底消除了化学法芯片中的边缘效应与脱保护不彻底问题，实现了时空特异性的单碱基级精确合成。

70、本发明通过数据处理层集成tdc模块、直方图处理模块和推理分析模块，形成片上边缘计算架构，实现对每个微反应池合成质量的实时评估，响应时间短，并通过四色滤光阵列与2×2 spad探测模组的配合，在荧光检测阶段同步完成碱基类型的原位验证，实现合成即测序，无需离线ngs测序即可完成全程质量监控；且数据处理层在片内完成质量评估与错误识别，伺服芯粒实时触发局部纠错，进行重试或废弃，将错误发现与纠正的周期从传统离线测序的数小时缩短至毫秒级，显著提高了长链基因合成的保真度与有效通量。

71、本发明的微反应池容积处于皮升级别，单次碱基延伸循环的试剂用量较传统微升级体系降低3至6个数量级，结合酶促合成本身的水相温和反应条件，大幅降低了合成成本与环境负荷，实现了高通量、低成本、低环境负荷的基因合成；同时微反应池四壁的反光处理和亲水处理，能够控制反射率不低于预定值，光串扰不超过设定百分比，以及水接触角不超过30°，进一步保障了各池反应的独立性与一致性。

72、本发明通过将gan基μled阵列、mems微反应池、gaas基spad阵列与cmos逻辑控制器分别在各自最优工艺节点独立制造，再经tsv硅通孔与μbump微凸点进行3d垂直堆叠封装，各芯粒键合对准精度高，实现了异质异构器件的片上深度融合，突破了同构集成的性能瓶颈，避免了单一工艺节点对多物理场性能的制约，同时垂直同轴光路设计使光路与液路在三维空间内不交叉，最大化光能利用率。

73、本发明的芯片预留标准化的流体接口与电学接口，便于与外部泵阀、温控、上位机系统集成，确保了酶反应微环境的长期稳定性，为从芯片到合成仪整机的产业化路径提供了工程化基础。

74、为使本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附附图，作详细说明如下。