一种土壤用六价铬修复微生物菌剂及其制备方法和应用

本发明涉及微生物应用，具体涉及一种土壤用六价铬修复微生物菌剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、铬污染已严重威胁农业生产、人类健康和生态平衡。铬渣堆积和铬废水排放导致周边土壤和水体中铬元素大量富集，并以六价铬 cr (ⅵ) 和三价铬 cr (ⅲ) 化合物形式稳定存在，改变污染水体与土壤成分、破坏微生物群落结构，严重降低土壤肥力。cr (ⅵ)可由土壤进入植物细胞，抑制种子萌发、幼苗生长及后续发育过程；并通过水与食物链进入动物和人体，造成神经功能障碍，引发癌变。cr (ⅵ) 化合物已被世界卫生组织列为一类致癌物。我国作为全球重要工业制造基地，铬盐及其系列产品为重点发展化工原料，水土铬污染形势严峻，铬已被列为威胁国民安全的重点重金属污染物之一。因此，开发高效、环保的六价铬修复技术成为当前环境治理领域的迫切需求。

2、cr (ⅲ) 难溶于水，为生物必需微量营养元素，无致癌性，毒性仅为 cr (ⅵ) 的千分之一。因此，将 cr (ⅵ) 还原为 cr (ⅲ)，是比吸附、富集更为彻底有效的修复路径。近年来，物理、化学、材料、生物等多学科交叉的 cr (ⅵ) 污染治理技术不断出现，包括光催化辅助二维 co-al 层状双氢氧化物 / tio2异质结构材料、改性 fe-c 微电解工艺、有机膨润土纳米复合材料吸附、亚铁离子原位固定、草酸回收铬等。但上述方法普遍存在成本高、消耗能源与化学试剂、对 ph、温度、光照等环境条件要求苛刻、操作复杂、需实时监控等问题，实际场地应用受限。

3、植物修复可用于铬污染场地治理，植物 - 细菌协同作用可提升 cr (ⅵ) 在植物体内的积累量，但铬富集植物仍需后续二次处理，难以实现原位高效解毒。微生物参与自然界物质循环、维持生态系统平衡，是环境修复的重要功能生物。自 20 世纪 70 年代首次发现具有 cr (ⅵ) 还原能力的细菌以来，微生物修复因绿色、高效、成本低、可原位处理、可持续性强等优势，被公认为最具发展潜力与应用前景的 cr (ⅵ) 去除技术。

4、在铬污染环境中，细菌可进化出多种抗铬胁迫机制，主要包括减少吸收、增加外排、损伤修复、胞外还原、吸附固定和胞内还原。cr (ⅵ) 因与硫酸根结构相似，可经硫酸根离子通道进入菌体；细菌可通过通道形变减少吸收、通过 chra 外排蛋白将 cr (ⅵ) 泵出胞外，或通过 sod 酶、dna 损伤修复应对氧化应激。但上述均为被动抗铬机制，无法有效去除环境中的 cr (ⅵ)。细菌细胞壁表面羧基、氨基、羟基、磷酸基、巯基等官能团可非酶促还原 cr (ⅵ)，但胞外还原效率低，仅在 cr (ⅵ) 浓度低于 10 mg/l 时有效。细菌亦可吸附富集 cr (ⅵ) 于细胞壁或胞内，但难以回收、无法实现污染物解毒，仍存在二次污染风险。

5、目前已在芽孢杆菌、大肠杆菌、假单胞菌、沙雷氏菌等菌株中发现胞内铬还原酶yief、nfsa、chrr、nema、chrt 等，为微生物修复提供核心功能基础。但现有铬还原菌株普遍存在六价铬耐受力差、还原效率低等缺陷，严重制约微生物修复技术的规模化应用。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明实施例提供了一种土壤用六价铬修复微生物菌剂及其制备方法和应用，本发明以专利菌株 c6 为功能菌，采用改性无机载体钙基膨润土结合交联固定技术，制备可高效修复土壤六价铬的固态微生物菌剂，显著提升菌剂稳定性、定殖能力与修复效率，可实现重度六价铬污染土壤的快速、长效、低成本修复。

2、为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种土壤用六价铬修复微生物菌剂，所述菌剂以保藏编号为 cgmcc no.20390的芽孢杆菌bacillus paramycoides c6为功能菌株（已于2020年7月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为芽孢杆菌bacillus sp.），以改性钙基膨润土为固定化载体；所述改性钙基膨润土依次经过高温处理、金属阳离子改性、壳聚糖包覆改性。

4、进一步地，所述金属阳离子改性包括fe(iii)、al(iii)、co(ii)或na(i)改性中的至少一种。

5、本发明还提供了一种上述的土壤用六价铬修复微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

6、功能菌株培养：将芽孢杆菌bacillus paramycoides c6在含六价铬的培养基中优化培养，收集处于对数生长期的菌体，制备菌悬液；

7、钙基膨润土改性：钙基膨润土经过筛、洗涤、烘干处理后，置于马弗炉中，缓慢升温至450~550℃，高温处理1~2h，缓慢冷却，取出并粉碎，过筛，得预处理钙基膨润土，将预处理钙基膨润土加入金属阳离子溶液中，25~35℃恒温搅拌3.5~4.5h，静置沉淀后弃上清，用去离子水洗至中性，烘干，得金属阳离子改性钙基膨润土，将金属阳离子改性钙基膨润土分散于壳聚糖溶液中超声处理25~35 min，浓缩至糊状，冷冻干燥后粉碎过筛，即得改性钙基膨润土；

8、固定化：将所得改性钙基膨润土与菌悬液混合，振荡吸附；加入氯化钙溶液进行交联处理；

9、成型干燥：将交联后体系与无菌水混合，冷冻干燥，得到菌剂粉剂。

10、进一步地，所述培养基中六价铬浓度为200mg/l，优化培养时间为12~18h。

11、进一步地，菌悬液的制备方法为将菌体用磷酸缓冲液洗涤，离心后重悬，调整菌浓至1×1010 cfu/ml。

12、进一步地，所述预处理钙基膨润土与金属阳离子溶液的固液比为1g：10 ml，所述金属阳离子溶液浓度为0.5mol/l。

13、进一步地，在钙基膨润土改性步骤中，在金属阳离子改性时，烘干温度为105℃。

14、进一步地，所述金属阳离子改性钙基膨润土与壳聚糖溶液固液比为1g：5 ml。

15、进一步地，改性钙基膨润土与菌悬液的固液比为1∶2（g/ml）。

16、进一步地，振荡吸附温度为23~27℃，时间为0.8~1.2h。

17、进一步地，氯化钙溶液加入量为改性钙基膨润土载体质量的30%。

18、此外，本发明还提供了上述微生物菌剂在六价铬污染土壤修复中的应用。

19、本发明实施例与现有技术相比存在的有益效果包括：

20、1.菌株耐受性极强，修复专一高效

21、本发明采用保藏编号为 cgmcc no.20390 的芽孢杆菌bacillus paramycoidesc6，对六价铬最低抑菌浓度高达2500 mg/l，可在重度污染土壤中正常生长并发挥功能。菌株经六价铬诱导培养后，将高毒cr (ⅵ)转化为无毒 cr (ⅲ)，无需二次处理，修复彻底。

22、2.载体改性科学，负载与定殖能力大幅提升

23、采用高温活化+金属阳离子改性+壳聚糖包覆三步改性钙基膨润土，显著提高载体比表面积、孔容与孔径，为菌体提供大量附着位点；壳聚糖 - ca²⁺交联网络可增强菌体稳定性、改善土壤微环境，使功能菌株在土壤中快速定殖、长期存活，不易被土著微生物淘汰。

24、3.菌剂常温稳定，储存与施用便捷

25、采用冷冻干燥工艺制备粉剂，常温阴凉保存1年，活菌数与芽孢数仍保持在2×109cfu/g以上，产芽孢率稳定高于95%。菌剂储运方便、可直接撒施翻耕，无需复杂设备，适用于原位/异位修复。

26、4.修复效率高，重度污染快速达标

27、在最优施用量50 g/kg 土壤下，对六价铬污染土壤30天去除率达99.99%；对重度污染土壤，90天去除率≥97%，180天即可达到gb 36600-2018第二类用地筛选值，修复效果稳定可靠。

28、5.长效抗二次污染，一次施用长期有效

29、功能菌株可在土壤中长期定殖，功能基因持续表达，面对二次六价铬污染可快速启动修复，一次施药即可实现长期稳定治理，大幅降低重复投入成本。

30、6.绿色环保、成本低廉、适用范围广

31、菌剂以天然矿物钙基膨润土为载体，无化学药剂残留、不破坏土壤结构、不产生二次污染，兼具改良土壤 ph、提升土壤微生态的作用。原料成本低廉，性价比显著优于物理、化学修复技术，可广泛用于工业场地、铬渣堆场、农田等各类六价铬污染土壤治理。