一种核桃蛋白的制备方法与流程

本发明涉及植物蛋白制备，尤其涉及一种核桃蛋白的制备方法。

背景技术：

1、核桃蛋白具有较高的营养价值和良好的食品加工应用潜力，通常可采用脱脂、脱酚、蛋白提取、分离纯化及干燥等工艺从核桃仁或核桃粕中制得。其中，核桃原料中含有一定量的多酚类物质，部分多酚以游离状态存在，部分多酚则通过氢键、疏水作用、离子作用等方式与蛋白质或原料基质相结合。多酚含量及其结合状态会对核桃蛋白的色泽、溶解性、提取率以及后续加工性能产生影响。

2、现有核桃蛋白制备过程中，通常采用水洗、乙醇洗涤或超声辅助洗涤等方式进行脱酚处理，并多以固定的溶剂浓度、处理时间或洗涤次数作为脱酚终止依据。上述处理方式主要以降低总多酚含量为目的，难以根据游离态多酚、弱结合态多酚和稳定结合态多酚之间结合强度及释放特性的差异实施选择性脱除。当脱酚程度不足时，残留的游离态及弱结合态多酚可能影响后续蛋白提取和产品性能；而持续提高脱酚强度又可能使与蛋白稳定结合的部分多酚继续解离，同时增加蛋白损失，导致核桃蛋白原有的部分功能性质受到影响。因此，如何在核桃蛋白制备过程中识别不同结合状态多酚的释放变化，并在弱结合多酚得到有效脱除而稳定结合态多酚尚未大量释放时及时终止脱酚处理，是现有技术仍有待进一步解决的问题，所以需要一种核桃蛋白的制备方法。

技术实现思路

1、本技术所述“前段标志多酚”是指在基准释放谱前段达到最大或局部最大单位时间释放速率、且此后至少连续两个检测周期释放速率下降的代表性多酚组分；所述“后段标志多酚”是指在前段单位时间释放速率低于后段单位时间释放速率、且自中段以后至少连续两个检测周期释放速率升高的代表性多酚组分。上述标志多酚根据同批次或同来源核桃原料经与正式处理相同的粉碎、分散及第一阶段脱酚处理后形成的基准第一脱酚固相的分阶段基准释放谱确定，并不预先限定为某一种固定的多酚化合物。当同一类别存在多个符合筛选条件的多酚组分时，优先选择保留时间稳定、峰形清晰、有效信号高于检测噪声且平行测定中释放趋势重复性较好的组分作为对应的代表性多酚组分。

2、本发明的目的在于提供一种核桃蛋白的制备方法，通过两阶段脱酚、分阶段基准释放谱以及前段标志多酚与后段标志多酚的组合趋势判定，解决固定处理时间或固定洗涤次数难以兼顾游离态及弱结合状态多酚脱除与稳定结合状态多酚保留的问题。

3、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

4、一种核桃蛋白的制备方法，包括以下步骤内容：

5、s1、对脱脂核桃原料进行粉碎并与第一阶段脱酚介质混合，得到核桃原料分散体系；

6、s2、对所述核桃原料分散体系进行第一阶段脱酚处理，使核桃原料中的游离态多酚优先向液相中迁移，经固液分离后获得第一脱酚固相；

7、s3、将所述第一脱酚固相置于第二阶段脱酚介质中，使所述第二阶段脱酚介质的乙醇体积分数和离子强度高于所述第一阶段脱酚介质，以使与核桃蛋白呈弱结合状态的多酚进一步从所述第一脱酚固相中释放；

8、s4、在所述第二阶段脱酚处理过程中，对所述第二阶段脱酚体系液相中的多酚组分进行分时检测，并根据预先建立的核桃多酚分阶段基准释放谱确定前段标志多酚和后段标志多酚，其中所述核桃多酚分阶段基准释放谱通过取同批次或同来源核桃原料，按照与正式处理相同的粉碎、分散及第一阶段脱酚条件处理获得基准第一脱酚固相，再采用与正式第二阶段脱酚处理相同的第二阶段脱酚介质组成、料液比、ph、温度、搅拌条件及检测周期，对所述基准第一脱酚固相进行完整基准洗脱并对液相进行分时检测获得，并将所述完整基准洗脱的总处理时间依次划分为前段、中段和后段三个等时段；

9、s5、根据所述前段标志多酚和后段标志多酚随第二阶段脱酚时间的释放变化关系确定脱酚终止节点；当正式第二阶段脱酚处理达到所述基准释放谱中段起始时点后，且连续至少两个检测周期内，前段标志多酚在当前检测周期的释放速率低于其前一检测周期的释放速率，且后段标志多酚在当前检测周期的释放速率高于其前一检测周期的释放速率时，将第二个连续满足上述条件的检测周期结束时点确定为所述脱酚终止节点，并终止第二阶段脱酚处理，以限制稳定结合状态多酚继续解离，并经固液分离获得第二脱酚固相；

10、s6、对所述第二脱酚固相进行蛋白提取，使核桃蛋白进入液相，提取完成后进行固液分离，得到蛋白提取液；

11、s7、对所述蛋白提取液进行纯化和浓缩，并经干燥得到核桃蛋白。

12、通过采用上述技术方案，先利用第一阶段脱酚使游离态多酚优先迁移，再利用第二阶段脱酚促进弱结合状态多酚进一步释放，并在达到基准释放谱中段起始时点后，通过分时检测前段标志多酚和后段标志多酚的释放变化确定脱酚终止节点，使第二阶段脱酚的终止时机由核桃原料实际释放状态确定，而非仅由固定处理时间或固定洗涤次数确定，从而在脱除游离态及弱结合状态多酚的同时，减少稳定结合状态多酚继续解离及伴随的蛋白损失；

13、上述方案将脱酚过程划分为作用强度不同且功能目标不同的两个阶段，第一阶段侧重降低游离态及高迁移性多酚的背景干扰，第二阶段侧重释放弱结合状态多酚，并通过释放谱变化判断何时停止，由此，第一阶段、第二阶段、检测步骤和终止步骤并非彼此独立，而是围绕“选择性脱酚而非完全脱酚”形成前后衔接关系，使后续蛋白提取所面对的原料状态更加可控。

14、优选的，所述s2中，第一阶段脱酚处理采用水或体积分数为5%～25%的食品级乙醇水溶液作为第一阶段脱酚介质，所述脱脂核桃原料与第一阶段脱酚介质的料液比为1:8～1:25，处理温度为15～35℃，处理时间为5～30min，以优先脱除游离态及高迁移性的多酚组分。

15、通过采用上述技术方案，采用水或低体积分数食品级乙醇并限定料液比、温度和处理时间，可在相对温和的条件下优先促使游离态及高迁移性多酚进入液相，降低第一阶段对稳定结合状态多酚产生过强解离作用的可能性，并为第二阶段处理提供较一致的初始固相。

16、优选的，所述s3中，第二阶段脱酚介质为体积分数20%～40%的食品级乙醇水溶液，且所述第二阶段脱酚介质的乙醇体积分数高于所述第一阶段脱酚介质的乙醇体积分数；并向所述第二阶段脱酚介质中加入食品级无机盐，使所述第二阶段脱酚介质的离子强度高于所述第一阶段脱酚介质，从而促进弱结合状态的多酚从核桃蛋白及核桃原料基质中解离。

17、通过采用上述技术方案，第二阶段通过使乙醇体积分数和离子强度均高于第一阶段，使处理作用相对于第一阶段增强，可促进弱结合状态的多酚进一步释放，为后续依据释放谱变化确定终止节点提供选择性处理区间；

18、第二阶段并不以持续提高乙醇浓度或盐浓度作为目标，而是利用相对于第一阶段更强的介质环境形成弱结合多酚的主要释放区间，只要前段标志多酚逐渐减弱、后段标志多酚开始增强，即可据此识别释放阶段已经发生变化，从而避免继续强化处理至大量稳定结合状态多酚被解离。

19、优选的，所述食品级无机盐为氯化钠，所述第二阶段脱酚介质中氯化钠的浓度为0.02～0.10mol/l，第二阶段脱酚处理的ph为6.0～8.0，处理温度为20～40℃。

20、通过采用上述技术方案，采用食品级氯化钠并限定其浓度、第二阶段ph及温度，可对第二阶段脱酚的离子环境和传质条件进行约束，使不同处理批次具有可重复的工艺基础；

21、通过限定氯化钠浓度、ph和温度，可使建立基准释放谱时的处理环境与正式第二阶段脱酚时保持可比，只有在介质条件一致时，不同检测时点间的释放速率变化才主要反映原料中多酚结合状态的变化，而不是由外部处理条件突然变化引起，因此有利于提高终止节点判定的一致性。

22、优选的，所述s4中的核桃多酚分阶段基准释放谱通过以下方式获得：取同批次或同来源核桃原料，按照与正式处理相同的粉碎、分散及第一阶段脱酚条件处理，获得基准第一脱酚固相；再按照与正式第二阶段脱酚处理相同的第二阶段脱酚介质组成、料液比、ph、温度、搅拌条件及检测周期，对所述基准第一脱酚固相进行一次完整基准洗脱；其中，所述完整基准洗脱是指以相同检测周期持续对基准洗脱液进行分时取样和色谱分析，在检测过程中以当前累计处理时间作为候选总处理时间，并将所述候选总处理时间依次划分为前段、中段和后段三个等时段；当至少存在一个多酚组分在前段达到最大或局部最大单位时间释放速率、且此后至少连续两个检测周期释放速率下降，同时至少存在另一个可区分多酚组分的前段单位时间释放速率低于后段单位时间释放速率、且自中段以后至少连续两个检测周期释放速率升高时，继续至少一个检测周期进行复核，并以所述复核周期结束后的当前累计处理时间重新作为候选总处理时间，将重新确定的候选总处理时间依次划分为前段、中段和后段三个等时段；若按照重新划分的三个等时段仍能够分别确定满足上述两类释放趋势的多酚组分，则以该复核周期结束时点作为完整基准洗脱结束时点；基于所述完整基准洗脱形成处理时间与各多酚组分累计释放量之间的对应关系。

23、通过采用上述技术方案，使建立基准释放谱的原料先经历与正式处理相同的粉碎、分散和第一阶段脱酚过程，并使基准洗脱与正式第二阶段脱酚采用相同的介质组成、料液比、ph、温度、搅拌条件及检测周期，可使两者具有一致的处理起点和传质条件，为正式处理时的标志多酚筛选和释放速率比较提供统一参照；

24、基准释放谱的作用是先回答“该类原料在当前第二阶段介质中通常怎样释放”，再据此筛选具有代表性的前段和后段标志峰。正式处理时无需重新鉴定全部多酚化学结构，只需在相同检测条件下跟踪已经筛选出的标志峰，即可把复杂的多酚体系转化为能够重复比较的过程指标。

25、优选的，所述色谱分析采用高效液相色谱法或超高效液相色谱法；在前述将一次完整基准洗脱总处理时间依次划分为前段、中段和后段三个等时段的基础上；所述前段标志多酚为从在前段达到最大或局部最大单位时间释放速率、且此后至少连续两个检测周期释放速率下降的多酚组分中选取的一个代表性多酚组分；所述后段标志多酚为从前段单位时间释放速率低于后段单位时间释放速率、且自中段以后至少连续两个检测周期释放速率升高的多酚组分中选取的一个代表性多酚组分，当同一类别存在多个符合条件的色谱峰时，优先选择保留时间稳定、峰形清晰、有效信号高于检测噪声且平行测定中释放趋势重复性较好的一个色谱峰作为对应的代表性标志峰。

26、通过采用上述技术方案，将完整基准洗脱划分为前段、中段和后段三个等时段，并结合连续检测周期的释放趋势筛选前段标志多酚和后段标志多酚，可将原有“前期”“后期”的定性表述转化为可重复的阶段划分和筛选规则；

27、将总处理时间等分为三个阶段，可以避免“处理前期”“处理后期”缺少客观边界的表述，标志多酚是否属于前段或后段，不以人为指定某一种化合物为准，而以同来源原料的实际释放曲线为准；当原料来源或前处理方式明显变化时，可重新建立基准释放谱，避免机械沿用原有标志峰造成误判。

28、优选的，所述s5中，以经取样体积和稀释因素校正后的标志多酚累计释放量在单位时间内的变化量表征释放速率；当正式第二阶段脱酚处理达到所述基准释放谱中段起始时点后，且连续至少两个检测周期内，前段标志多酚在当前检测周期的释放速率低于其前一检测周期的释放速率，且后段标志多酚在当前检测周期的释放速率高于其前一检测周期的释放速率时，将第二个连续满足上述条件的检测周期结束时点确定为所述脱酚终止节点。

29、通过采用上述技术方案，以经取样体积和稀释因素校正后的累计释放量计算释放速率，并要求前段释放速率下降与后段释放速率升高的组合趋势连续至少出现两个检测周期后才确定终止节点，可减少单次取样或检测波动造成的误判，并明确脱酚终止时点；

30、累计释放量校正将当前液相中仍存在的标志多酚与此前各次取样带出的标志多酚合并考虑，使连续取样造成的液相体积降低或补液造成的稀释不会被误判为真实释放速率变化，前段与后段标志多酚采用相同校正口径后，其趋势变化具有可直接比较的计算基础。

31、优选的，所述s5中，第二阶段脱酚处理终止后，在1～10min内完成固液分离，并采用水对所述第二脱酚固相进行1～2次快速洗涤，以降低所述第二脱酚固相中乙醇和无机盐的残留，同时减少已保留的稳定结合状态多酚继续发生解离。

32、通过采用上述技术方案，在达到脱酚终止节点后于限定时间内完成固液分离并采用水快速洗涤，可及时撤除第二阶段乙醇和无机盐环境，减少稳定结合状态多酚继续解离，同时降低残留介质对后续蛋白提取的影响；

33、在识别终止节点后及时撤除第二阶段介质，是实现选择性脱酚的必要后续动作，若虽然已经判定终止，但仍长时间搅拌或静置于原介质中，稳定结合状态多酚仍可能继续解离，因此本方案通过限定固液分离时间并采用短时水洗，使“检测到终止节点”和“实际停止第二阶段作用”在工艺上对应。

34、优选的，所述s6中，将所述第二脱酚固相加入水中形成提取体系，将所述提取体系的ph调节至8.0～10.0，并在20～45℃条件下提取20～90min，使核桃蛋白进入液相；提取完成后进行固液分离，得到所述蛋白提取液。

35、通过采用上述技术方案，在限定ph、温度和时间范围内对第二脱酚固相进行蛋白提取，可使核桃蛋白进入液相，并通过后续固液分离去除不溶性原料残渣，为膜纯化提供蛋白提取液；

36、蛋白提取在第二阶段脱酚结束并撤除残留介质后再进行，可以避免较强碱性蛋白提取条件提前参与多酚释放过程而改变基准释放谱。通过将脱酚阶段与蛋白提取阶段分开，既保持了终止判据的稳定性，也使后续蛋白提取可根据核桃蛋白的溶出需求单独调节ph、温度和时间。

37、优选的，所述s7中，对所述蛋白提取液进行膜过滤纯化和浓缩，其中通过超滤对所述蛋白提取液进行浓缩，并在超滤过程中和/或浓缩后进行洗滤，以去除低分子多酚、盐类及其他小分子杂质，在蛋白保持溶解状态下获得核桃蛋白浓缩液，再对所述核桃蛋白浓缩液进行冷冻干燥或喷雾干燥，得到核桃蛋白。

38、通过采用上述技术方案，利用超滤截留主要蛋白组分并进行浓缩，再通过洗滤降低低分子多酚、盐类及其他可透膜小分子的残留，可减少低分子杂质对核桃蛋白产品的影响；经冷冻干燥或喷雾干燥后获得便于储存和使用的核桃蛋白；

39、膜过滤阶段承担蛋白浓缩与小分子杂质去除功能，并不重新改变前述脱酚终止判定，通过超滤截留主要蛋白组分，再通过洗滤降低盐类和可透膜低分子多酚含量，可减少后续产品中小分子杂质的残留，同时避免必须依赖强酸沉淀才能回收蛋白，为核桃蛋白后续干燥成粉提供较稳定的液相基础。

40、本发明并非单纯依据总多酚含量降低程度或者固定处理时间确定脱酚终点，而是利用不同结合状态多酚在脱酚过程中的释放阶段差异，通过前段标志多酚释放速率下降与后段标志多酚释放速率升高的组合变化识别脱酚阶段转换，从而实现针对不同结合状态多酚的选择性脱除。

41、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

42、1、通过第一阶段脱除游离态及高迁移性多酚、第二阶段释放弱结合状态多酚，并在达到基准释放谱中段起始时点后，根据前段标志多酚释放速率下降与后段标志多酚释放速率升高的连续组合趋势确定脱酚终止节点，使脱酚程度能够随核桃原料实际释放状态调整，有利于解决固定处理时间或固定洗涤次数下容易出现的脱酚不足与过度脱酚问题，并减少脱酚阶段稳定结合状态多酚不必要的继续解离及伴随的蛋白损失。

43、2、通过对同批次或同来源核桃原料采用与正式处理相同的粉碎、分散和第一阶段脱酚条件建立对应的基准第一脱酚固相，并使基准洗脱与正式第二阶段脱酚采用相同介质组成、料液比、ph、温度、搅拌条件及检测周期，使前段标志多酚和后段标志多酚具有明确且可比的筛选依据；当原料来源或前处理状态改变时，可重新建立对应基准释放谱，从而降低不同批次原料释放差异对固定工艺条件造成的影响。

44、3、通过要求前段标志多酚释放速率下降与后段标志多酚释放速率升高的组合趋势连续至少出现两个检测周期后再确定终止节点，可降低单次取样或检测波动造成的误判；同时以经取样体积和稀释因素校正后的累计释放量计算释放速率，使终止节点具有可重复、可追溯的判定依据。

45、4、通过在达到脱酚终止节点后及时进行固液分离和快速水洗，可减少第二阶段脱酚介质继续作用；后续通过碱性提取获得蛋白提取液，并利用超滤和/或洗滤去除低分子多酚、盐类及其他小分子杂质，在保持蛋白主要处于液相状态的条件下完成纯化和浓缩，便于获得核桃蛋白产品。

46、5、通过使基准释放谱建立过程与正式处理具有相同的第一阶段处理历史，并使两者的第二阶段脱酚介质组成、料液比、温度、ph、搅拌条件以及检测周期保持一致，同时通过取样体积与稀释因素校正累计释放量，使终止节点具有明确的数据来源和复核路径，可基于实际批次释放曲线重新筛选标志多酚，无需依赖说明书之外未公开的固定阈值，从而提高工艺重复性。

47、6、通过将第一阶段温和脱酚、第二阶段弱结合多酚释放、释放谱分时检测、组合趋势判定、快速撤除介质、碱性蛋白提取以及膜纯化依次衔接，使各步骤共同围绕“降低脱酚不足与过度脱酚风险”发挥作用，形成从原料预处理到核桃蛋白产品获得的完整工艺链。