rapZ基因缺失的重组卡介苗及其构建方法和应用

本发明属于微生物，涉及rapz基因缺失重组卡介苗的构建及其在结核分枝杆菌感染的预防性疫苗中的用途。

背景技术：

1、结核病是全球公共卫生面临的重大挑战之一。目前全球结核病发病率下降趋势发生逆转，防治形势十分严峻。而与此同时，耐药结核病日趋严重。控制这一全球流行病的最有效手段是预防性免疫,因此疫苗的研发急不可待。目前唯一获得批准使用的结核疫苗还是100年前发明的卡介苗bcg，但是卡介苗保护效果差强人意，对成年人保护效果弱。因此，研发新型结核疫苗至关重要。

2、ag85复合物包括ag85a、ag85b和ag85c,存在于所有分枝杆菌中,是结核分枝杆菌分泌的最主要蛋白。该复合物在结核对人体的致病中发挥重要作用：ag85可以与宿主细胞表面的纤连蛋白结合，介导结核菌对细胞的侵袭，当结核菌进入巨噬细胞后，ag85参与阻碍吞噬体成熟为吞噬溶酶体的过程，从而帮助结核菌在吞噬体中生存。此外，三种ag85蛋白均具有分枝菌酸转移酶活性，可以催化海藻糖单分枝菌酸(tmm)转变为海藻糖二分枝菌酸(tdm)，从而参与结核菌细胞壁的生物合成。作为分枝杆菌重要抗原，以表达ag85a或ag85b为特征的多种重组bcg疫苗已经被证实在动物实验中可以诱导抗结核细胞免疫和体液免疫应答，增强对结核的抵抗作用。因此，ag85已经成为最有前景的结核疫苗候选抗原之一。

3、结核菌的细胞壁和外膜中富含各种类型的脂质分子，它们对维持结核菌细胞壁的形态及保护细菌免受有害环境的侵害至关重要。不仅如此，多种脂质成分如海藻糖单分枝菌酸(trehalose monomycolates，tmm)、海藻糖双分枝菌酸(trehalose dimycolates，tdm)、硫酸海藻糖糖脂(sulphated trehalose glycolipids，sgl)、脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，lam)、磷脂酰肌醇甘露糖苷(phosphatidyl-myo-inositolmannosides，pims)等均可作为免疫分子，激活或抑制宿主免疫。

技术实现思路

1、本发明的目的是构建一种重组卡介苗，以增强卡介苗免疫原性，提高对抗结核菌感染的保护效果。

2、本发明人在前期研究工作中发现结核分枝杆菌的rapz(rv1421)基因缺失会导致多种参与细胞壁生物合成的蛋白含量改变，其中包括ag85蛋白以及细胞壁脂质成分的改变。由于ag85和细胞壁脂质是分枝杆菌重要抗原，具有良好的抗原性和免疫原性，本发明在bcg中敲除同源的rapz基因，证实能引起ag85抗原表达上调，脂质成分改变。基于上述研究，本发明制备了一种rapz基因敲除的bcg菌株，该rapz基因敲除的bcg菌株在保持与野生型bcg相当安全性的同时，能够提升对结核分枝杆菌感染的保护效力。

3、具体的，本发明提供了如下技术方案：

4、在本发明的第一个方面，提供一种重组卡介苗菌株，所述重组卡介苗菌株中编码rapz蛋白的基因缺失。

5、所述rapz蛋白的氨基酸序列如序列表中seq id no：1所示。rapz基因缺失的重组卡介苗在本发明中命名为bcgδrapz。

6、在本发明的一个实施例中，所述重组卡介苗菌株中编码rapz蛋白的基因的第93～725位核苷酸残基被删除了。

7、所述重组卡介苗bcgδrapz能够增强ag85蛋白的含量，可用作制备bcg疫苗。

8、在本发明的第二个方面，提供所述bcgδrapz的一种构建方法，是通过基因编辑方法将bcg中编码rapz蛋白的基因进行敲除。

9、优选地，通过crispr辅助的非同源末端连接基因编辑技术敲除bcg中编码rapz蛋白的基因，例如利用中国发明专利zl201910343121.9公开的应用于结核分枝杆菌的基因编辑系统(一种双质粒的crispr-cas辅助的nhej编辑系统)来实现，该系统包括crispr系统表达质粒和nhej元件表达质粒，其中所述crispr系统表达质粒包含sgrna作用元件和cas基因，所述nhej元件表达质粒包含促进非同源末端连接的nhej元件基因。

10、所述构建方法的一种实施方式包含以下步骤：

11、(1)将nhej元件表达质粒转入bcg中，筛选阳性克隆，其中，所述nhej元件表达质粒可以在bcg中转录表达促进非同源末端连接的酶kuc、ligd和nrga；

12、(2)将上述阳性克隆菌株制备成感受态细胞备用；

13、(3)将针对rapz基因片段的sgrna靶标序列连接到crispr系统表达质粒上的sgrna作用元件中，得到含有sgrna靶标序列的crispr系统表达质粒；所述crispr系统表达质粒包含sgrna作用元件和cas基因；

14、(4)用步骤(3)制备的含有sgrna靶标序列的crispr系统表达质粒转化步骤(2)制备的感受态细胞，筛选阳性克隆并进行验证，得到rapz基因发生大片段删除的转化子。

15、在本发明的一种实施方式中，上述步骤(1)中所述nhej表达元件质粒是pyc1759，通过电转化的方法导入卡介苗菌株中。所述质粒pyc1759含有来自海分枝杆菌的kuc、ligd、nrga基因，以及降低reca依赖的同源重组的基因元件recx，该质粒又名pnhej-recxmtb。

16、在本发明的一种实施方式中，上述步骤(3)中将含有针对rapz基因片段的sgrna靶标序列的sgrna作用元件连接到质粒pyc1876中，得到靶向rapz基因的crispr系统表达质粒。其中，所述质粒pyc1876是对表达cas9和sgrna的复制性穿梭质粒pyc1640进行优化改造得到。

17、在本发明的一个优选实施方案中，为了更有效地实现基因的大片段删除，步骤(3)所述crispr系统表达质粒包含成对的sgrna作用元件，即两个相连的sgrna作用元件序列，其中的两个sgrna靶标序列如序列表中seq id no：2和seq id no：3所示。

18、在本发明的第三个方面，提供rapz基因缺失的重组卡介苗在制备抵抗结核感染的疫苗中的应用。

19、本发明将构建的rapz基因缺失的重组卡介苗(bcgδrapz)免疫小鼠，bcgδrapz免疫后的小鼠较野生型bcg疫苗免疫小鼠增强了对结核菌的抵抗作用。实验数据表明bcgδrapz有望成为预防结核感染的新型候选疫苗之一。总之，本发明通过敲除bcg中的rapz基因而获得了一种重组卡介苗，该重组卡介苗与野生型bcg比较，能够显著增加分枝杆菌特异性抗原ag85的表达及引起细胞壁脂质成分发生改变，在动物实验中能够降低结核分枝杆菌的感染。因此该重组卡介苗有望成为预防结核感染的新型候选疫苗，具有较好的应用前景。

1.一种重组卡介苗菌株，其特征在于，所述重组卡介苗菌株中编码rapz蛋白的基因缺失。

2.如权利要求1所述的重组卡介苗菌株，其特征在于，所述重组卡介苗菌株中编码rapz蛋白的基因的第93～725位核苷酸残基被删除。

3.权利要求1或2所述重组卡介苗菌株的构建方法，通过基因编辑方法将卡介苗菌株中编码rapz蛋白的基因进行敲除。

4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，通过crispr辅助的非同源末端连接基因编辑技术敲除卡介苗中编码rapz蛋白的基因，包括以下步骤：

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤3)中所述crispr系统表达质粒包含成对的sgrna作用元件，即两个相连的sgrna作用元件序列。

6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，两个sgrna作用元件中包含的sgrna靶标序列如序列表中seq id no：2和seq id no：3所示。

7.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤1)中所述nhej元件表达质粒是pyc1759质粒，通过电转化的方法导入卡介苗菌株中；所述质粒pyc1759含有来自海分枝杆菌的kuc、ligd、nrga基因，以及降低reca依赖的同源重组的基因元件recx。

8.权利要求1或2所述的重组卡介苗菌株在制备抵抗结核感染的疫苗中的应用。