一种柑橘CsARO1基因在增强柑橘对溃疡病抗性中的应用的制作方法

本发明属于植物基因工程，具体涉及一种柑橘csaro1基因在增强柑橘对溃疡病抗性中的应用。

背景技术：

1、柑橘溃疡病（

citrus bacterial canker，cbc）是由地毯草黄单胞杆菌柑橘亚种（

xanthomonas citri subsp. citri，xcc）引起的细菌性病害，其危害当前大多数主栽柑橘品种。因此，加强对柑橘溃疡病防控研究是柑橘产业发展的迫切需求。

2、柑橘溃疡病的传统防控手段例如病树焚烧和农药使用等需要投入大量人力和物力，且会造成巨大环境危害。因此，柑橘溃疡病防治更多寄希望于培育抗病新种质。分子育种由于可定向、高效培育抗病新种质，目前得到快速发展和广泛应用。近年来，通过生物技术手段已获得一些抗溃疡病的柑橘资源，例如转柞蚕抗菌肽d基因的锦橙、新会橙、脐橙株系；过表达csbzip40的晚锦橙株系；基因定点编辑柑橘溃疡病感病基因cslob1启动子获得的对柑橘溃疡病抗性提高的植株等。但优质候选基因仍然匮乏，且功能和作用机制研究不深，因此，亟待有针对性地挖掘更多与柑橘溃疡病紧密相关的基因，深入解析其功能和机制，用于抗溃疡病分子育种。

3、aro（芳香族氨基酸合成相关蛋白）家族广泛存在于各类植物中，是一类由多基因编码、功能高度分化的代谢调控蛋白，核心区段含有保守的芳香族氨基酸合成催化结构域，可介导莽草酸途径代谢、酚类抗病物质合成、内源激素前体供给等核心生化过程，是连接植物初生代谢与逆境免疫调控的关键蛋白家族。依据蛋白保守催化基序、系统进化与基因结构特征，植物aro家族可划分为多个进化分支，典型aro蛋白均含有特征性莽草酸脱氢酶保守结构域，该结构域是该家族区别于其他代谢蛋白的标志性特征。目前aro家族基因已在拟南芥、水稻、玉米、大豆等多种作物中完成全基因组鉴定，该家族蛋白通过调控莽草酸通路通量、水杨酸与植保素合成平衡，广泛参与植物器官建成、内源激素交叉调控、非生物胁迫应答与病原菌侵染互作等多重生物学过程。已有研究证实，病原菌侵染会显著扰动宿主aro家族基因转录水平，通过提升酚类防御物质积累重塑抗病通路，调控植株对真菌、细菌性病害的基础抗性，改变病斑扩展速率与发病严重程度。

4、虽然aro介导的生长素信号通路在植物病害抗性调控中已有少量基础研究，但在柑橘溃疡病互作机制领域，针对csaro1基因的体内功能验证、育种应用尚未有相关研究报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种柑橘csaro1在增强柑橘对溃疡病抗性中的应用，本发明首次克隆获得柑橘csaro1基因，通过将柑橘csaro1基因的vigs载体转到柑橘中，降低柑橘csaro1的转录水平，能够显著提高柑橘对溃疡病的抗性，降低溃疡病的发病程度，并且不影响转基因植株的表型。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了柑橘csaro1基因在增强柑橘溃疡病抗性中的应用，通过降低柑橘中csaro1基因的转录水平增强柑橘溃疡病抗性；

4、所述柑橘csaro1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

5、本发明还提供了一种防治柑橘溃疡病的方法，包括采用vigs沉默的方式降低柑橘csaro1基因的转录水平，所述柑橘csaro1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

6、本发明还提供了一种提高柑橘溃疡病抗性的方法，包括以下步骤：

7、s1、克隆柑橘csaro1基因的vigs片段；

8、s2、构建csaro1的vigs表达载体；

9、s3、csaro1的vigs表达载体转化柑橘，得到柑橘csaro1基因被沉默的vigs植株；

10、所述vigs片段的核苷酸序列如seq id no.2所示。

11、优选地，步骤s1中，所述vigs片段的克隆方法为：提取柑橘总rna，反转录为cdna，以cdna为模板用高保真酶pcr扩增得到柑橘csaro1基因的vigs片段；

12、所述vigs片段的核苷酸序列如seq id no.2所示。

13、更优选地，所述pcr扩增所用的引物为csaro1-vigs-f和csaro1-vigs-r；

14、csaro1-vigs-f的核苷酸序列如seq id no.3所示；csaro1-vigs-r的核苷酸序列如seq id no.4所示。

15、优选地，步骤s2中，vigs表达载体的构建方法为：将步骤s1获得的vigs片段经ecori和kpni酶切，回收后与相同酶切的trv2载体连接并转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒，得到csaro1基因的vigs载体。

16、优选地，步骤s3中，vigs载体转化柑橘的方法为：将步骤s2获得的vigs表达载体转化农杆菌，制备含vigs载体的农杆菌菌液，侵染柑橘无菌幼苗，经荧光观察、pcr和qrt-pcr验证后，得到柑橘csaro1基因被沉默的vigs植株。

17、本发明还提供了采用vigs沉默降低csaro1转录水平在培育柑橘抗溃疡病品种中的应用，所述csaro1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

18、本发明的有益效果：

19、1、本发明实施例提供的一种柑橘csaro1基因及其在增强柑橘对溃疡病抗性中的应用，通过构建柑橘csaro1基因的vigs载体，农杆菌介导转化柑橘，得到的柑橘植株能够对溃疡病表现明显抗性，病斑面积降低了36.43%~44.57%，病情指数降低了36.61%~47.54%，显著减轻溃疡病的发病程度；

20、2、本发明实施例提供的一种柑橘csaro1基因及其在增强柑橘对溃疡病抗性中的应用，通过柑橘csaro1基因vigs沉默能够显著减轻柑橘溃疡病的发病程度，且柑橘csaro1基因vigs沉默不会影响柑橘植株的表型；

21、3、本发明实施例提供的一种柑橘csaro1基因及其在增强柑橘对溃疡病抗性中的应用，柑橘csaro1基因还可以作为候选基因同多个溃疡病抗、感病基因利用vigs沉默、rna干扰和基因编辑等技术协同进行溃疡病抗性育种，在柑橘抗溃疡病育种中具有重大的应用价值。

1.柑橘csaro1基因在增强柑橘溃疡病抗性中的应用，其特征在于，通过降低柑橘中csaro1基因的转录水平增强柑橘溃疡病抗性；

2.一种防治柑橘溃疡病的方法，其特征在于，包括采用vigs沉默的方式降低柑橘csaro1基因的转录水平，所述柑橘csaro1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3.一种提高柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的一种提高柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤s1中，所述vigs片段的克隆方法为：提取柑橘总rna，反转录为cdna，以cdna为模板用高保真酶pcr扩增得到柑橘csaro1基因的vigs片段；

5.根据权利要求4所述的一种提高柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，所述pcr扩增所用的引物为csaro1-vigs-f和csaro1-vigs-r；

6.根据权利要求4所述的一种提高柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤s2中，vigs表达载体的构建方法为：将步骤s1获得的vigs片段经ecori和kpni酶切，回收后与相同酶切的trv2载体连接并转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒，得到csaro1基因的vigs载体。

7.根据权利要求4所述的一种提高柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤s3中，vigs表达载体转化柑橘的方法为：将步骤s2获得的vigs载体转化农杆菌，制备含vigs载体的农杆菌菌液，侵染柑橘无菌幼苗，经荧光观察、pcr和qrt-pcr验证后，得到柑橘csaro1基因被沉默的vigs植株。

8.采用vigs沉默降低csaro1转录水平在培育柑橘抗溃疡病品种中的应用，其特征在于，所述csaro1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。