羰基还原酶突变体及其在色满酮还原中的应用

本发明属于分子生物学和酶工程领域，涉及羰基还原酶突变体及其在还原色满酮中的应用。

背景技术：

1、羰基还原酶carbonyl reductase，也称作醇脱氢酶alcohol dehydrogenase，是一类可逆催化羰基还原为醇的生物催化剂。为了实现催化活性，羰基还原酶需要辅酶参与传递氢负离子给羰基底物。在羰基还原酶的催化过程中，辅酶的使用是与底物的摩尔量相同的，从反应的经济性出发，在羰基还原酶的催化反应中会匹配相应的辅酶再生系统，随着定向进化技术的发展，羰基还原酶在手性醇制备领域的应用越来越广泛。

2、色满酮还原后的色满醇是许多药物的关键中间体，如特格拉赞tegoprazan是一种新型的选择性可逆h+/k+-atp酶质子泵抑制剂，通过抢占质子泵上钾离子结合位点，竞争性挡住钾离子与泵体结合，使得离子交换被阻断，氢离子无法被泵出，从而抑制胃酸分泌。2018年特格拉赞在韩国被批准用于治疗胃食管反流症gerd、糜烂性食管炎ee和非糜烂性反流病nerd。(r)-5,7-二氟苯并二氢吡喃-4-醇是合成其中手性模块的关键中间体图1。

3、目前已有合成(r)-5,7-二氟苯并二氢吡喃-4-醇的方法，如利用5,7-二氟苯并二氢吡喃-4-酮为底物，在氩气保护的条件下，将硼烷二甲硫醚络合物注入s-me-cbs的甲苯溶液中，缓慢滴加底物的无水四氢呋喃溶液，放置过夜，反应液缓慢倒入冰水浴冷却的甲醇中，萃取后重结晶获得产物(r)-5,7-二氟苯并二氢吡喃-4-醇cn112851646a，利用化学催化不可避免的会使用危险试剂，开发绿色高效的催化技术势在必行。本发明通过定向进化获得了转化5,7-二氟苯并二氢吡喃-4-酮活力明显提升的突变体，为(r)-5,7-二氟苯并二氢吡喃-4-醇的绿色生物制造奠定基础。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供羰基还原酶突变体、其编码基因及应用，提高酶活性及底物结构多样性等，使之符合工业使用需求。本发明对来源于myriangium duriaei的酶mdadh，genbank：kaf2156407.1进行了功能确定和定向进化，获得酶活力明显提高的突变体，以色满酮及其结构类似物，如5,7-二氟苯并二氢吡喃-4-酮为底物进行还原生成，(r)-色满醇。

2、本发明提供羰基还原酶的突变体，其蛋白序列与seq id no：1具有至少90%同一性，且对应于seq id no：1所示的氨基酸序列第1至301中的位点s12、r17、n20、k80、n199、p201、q202，q204，y238，s244，t251、w255的一个或多个存在替换突变获得的突变体。

3、具体地，其氨基酸序列对应于seq id no：1所示的氨基酸序列存在下述任一替换突变：

4、第199位天门冬酰胺n突变为丙氨酸a，甘氨酸g；

5、第201位脯氨酸p突变为丝氨酸s、苏氨酸t、酪氨酸y；

6、第202位谷氨酰胺q突变为丙氨酸a、甘氨酸g、缬氨酸v；

7、第204位谷氨酰胺q突变为甲硫氨酸m、丙氨酸a、亮氨酸l；

8、第238位酪氨酸y突变为组氨酸h、丝氨酸s、苏氨酸t；

9、第244位苏氨酸s突变为脯氨酸p；

10、第251位苏氨酸t突变为天门冬酰胺n、组氨酸h、赖氨酸k；

11、第255位色氨酸w突变为丙氨酸a、缬氨酸v、异亮氨酸i；

12、第204位谷氨酰胺q突变为甲硫氨酸m，且第238位酪氨酸y突变为组氨酸h；

13、第199位天门冬酰胺n突变为丙氨酸a,第204位谷氨酰胺q突变为甲硫氨酸m，且第238位酪氨酸y突变为组氨酸h；

14、第199位天门冬酰胺n突变为丙氨酸a,第204位谷氨酰胺q突变为甲硫氨酸m，且第238位酪氨酸y突变为组氨酸h；

15、第204位谷氨酰胺q突变为甲硫氨酸m，第238位酪氨酸y突变为组氨酸h，且第251位苏氨酸t突变为丙氨酸a；

16、第17位精氨酸r突变为组氨酸h，第204位谷氨酰胺q突变为甲硫氨酸m,且第238位酪氨酸y突变为组氨酸h；

17、第199位天门冬酰胺n突变为丙氨酸a,第204位谷氨酰胺q突变为甲硫氨酸m，第238位酪氨酸y突变为组氨酸h，且第251位苏氨酸t突变为丙氨酸a；

18、第12位苏氨酸s突变为脯氨酸p，第17位精氨酸r突变为组氨酸h，第204位谷氨酰胺q突变为甲硫氨酸m，且第238位酪氨酸y突变为组氨酸h；

19、第12位苏氨酸s突变为脯氨酸p，第17位精氨酸r突变为组氨酸h，第199位天门冬酰胺n突变为丙氨酸a,第204位谷氨酰胺q突变为甲硫氨酸m，且第238位酪氨酸y突变为组氨酸h；

20、第12位苏氨酸s突变为脯氨酸p，第17位精氨酸r突变为组氨酸h，第80位赖氨酸k突变为丝氨酸s，第199位天门冬酰胺n突变为丙氨酸a,第204位谷氨酰胺q突变为甲硫氨酸m，且第238位酪氨酸y突变为组氨酸h；

21、第12位苏氨酸s突变为脯氨酸p，第17位精氨酸r突变为组氨酸h，第80位赖氨酸k突变为丝氨酸s，第199位天门冬酰胺n突变为丙氨酸a,第204位谷氨酰胺q突变为甲硫氨酸m，第238位酪氨酸y突变为组氨酸h，且第251位苏氨酸t突变为丙氨酸a。

22、本发明还提供所述的羰基还原酶的突变体的编码核酸。

23、本发明进一步提供所述的羰基还原酶的突变体的编码核酸的重组表达载体。

24、本发明还提供所述的羰基还原酶的突变体的编码核酸的重组菌。

25、本发明还提供一种还原色满酮，尤其是还原5,7-二氟苯并二氢吡喃-4-酮的方法，其包括如下步骤：

26、将所述的羰基还原酶突变蛋白与反应底物接触，添加辅酶循环系统进行催化反应，从而获得相应的(r)-色满醇，尤其是(r)-5,7-二氟苯并二氢吡喃-4-醇。

27、具体地，反应体系的ph为6.0-8.0，反应时间为12-48小时；反应的底物浓度为80-270g/l。

28、估选地，反应体系的ph为6.5；反应时间为15-36小时。

29、任选地，还包括分离并纯化所述(r)-5,7-二氟苯并二氢吡喃-4-醇的步骤。

30、将本发明中活力提升的羰基还原酶突变株应用到特格拉赞中间体中的生产过程中，可转化80-270g/l底物的完全转化，生成(r)-5,7-二氟苯并二氢吡喃-4-醇，因此更具有实用价值。

1.一种羰基还原酶的突变体，其特征在于，其氨基酸序列对应于seq id no：1所示的氨基酸序列存在下述任一替换突变：

2.一种如权利要求1所述的羰基还原酶的突变体的编码核酸。

3.一种含有如权利要求2所述的编码核酸的重组表达载体。

4.一种含有如权利要求2所述的编码核酸的重组菌。

5.如权利要求1所述的羰基还原酶的突变体在色满酮还原中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，其是用于制备(r)-5,7-二氟苯并二氢吡喃-4-醇。

7.一种还原色满酮制备色满醇的方法，其包括如下步骤：

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述色满酮是5,7-二氟苯并二氢吡喃-4-酮，所述(r)-色满醇是(r)-5,7-二氟苯并二氢吡喃-4-醇。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，反应体系的ph为6.0-8.0；反应的底物浓度为80-270g/l，反应时间为12-48小时。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，反应体系的ph为6.5；反应时间为15-36小时；还包括分离并纯化所述(r)-色满醇的步骤。