一种用于预测高危型人乳头瘤病毒持续性感染的标志组合物及应用

本发明属于多组学分子诊断技术，具体涉及一种用于预测高危型人乳头瘤病毒持续性感染的标志组合物及应用。

背景技术：

1、高危型人乳头瘤病毒（hr-hpv）的持续感染是宫颈癌发生发展的主要病因。虽然大多数女性一生中会感染至少一种hpv，但有10%-20%会发展为持续性hr-hpv感染，进而可能进展为宫颈癌。因此，及早区分一过性感染与持续性感染是宫颈癌早筛早诊的核心需求。

2、近年来，阴道微生态与hpv感染之间的关系受到广泛关注。健康女性阴道微生态通常以乳杆菌属细菌为主要优势菌群，其中部分乳杆菌能够通过产生乳酸等代谢产物维持相对酸性的局部环境，并与其他微生物共同参与阴道微生态稳态。与之相比，阴道微生态失衡通常表现为菌群组成和相对丰度发生改变，并可伴随局部环境及代谢状态的变化。已有研究提示，阴道微生态组成与hpv感染状态及感染转归之间存在一定关联，部分乳杆菌丰度较高的微生态状态与hpv清除相关，而某些微生态失衡状态则与hpv持续检出相关。上述研究表明，阴道微生态可能是影响hpv感染转归的因素之一，但不同微生物特征与hpv持续感染之间的具体关系仍具有一定的个体差异，其能否单独用于准确预测hr-hpv持续感染仍有待进一步研究。

3、目前，hpv感染的检测主要包括hpv核酸检测、hpv基因分型检测以及宫颈细胞学检测等。其中，hpv核酸检测主要用于判断受试者当前是否存在hpv核酸，hpv基因分型检测可进一步获得感染相关的病毒基因型信息，宫颈细胞学检测，例如液基薄层细胞学检测（tct），则主要用于评价宫颈细胞的形态学改变。上述检测手段能够分别从病毒感染状态、病毒基因型以及细胞学状态等方面提供信息，并可结合受试者的临床情况和其他检查结果用于hpv感染及相关宫颈病变的筛查和风险管理。

4、然而，对于已经检测为hr-hpv阳性的受试者而言，单次hpv核酸检测或基因分型检测主要反映检测时点的感染状态，并不能直接确定后续感染转归。hr-hpv阳性受试者在随访过程中可能出现不同的感染状态，包括后续检测转阴、持续检出相同或相关的hr-hpv基因型，以及出现不同hpv基因型等。因此，仅依据单一时间点的hpv阳性结果或病毒基因型信息，通常难以在后续随访结果获得之前，对个体发生持续性感染的可能性进行进一步区分。对于持续性感染的判断，通常仍需要结合不同时间点的检测结果进行动态观察，由此使风险判断具有一定的时间滞后性。

5、除hpv dna检测和细胞学检测外，现有研究还尝试通过检测hpv病毒转录活性以及宿主表观遗传变化对hpv感染状态进行进一步评价。例如，可检测hpv e6/e7等病毒基因的信使rna（mrna），以获得与病毒转录活性相关的信息；还可检测宿主基因或病毒基因相关区域的dna甲基化水平，以反映感染过程中可能出现的表观遗传变化。上述分子指标能够从不同于hpv dna检测的角度提供感染相关信息，并可用于研究病毒活性及宿主分子状态与hpv感染转归之间的关系。

6、但是，病毒转录活性或dna甲基化状态的改变并不必然对应于持续性感染。部分一过性感染过程中同样可能出现病毒相关基因表达或宿主分子状态的变化，因此，单独检测某一种病毒转录指标或表观遗传指标，可能仍不足以对活动性的一过性感染与具有较高持续感染风险的状态进行充分区分。此外，上述检测主要反映病毒或宿主特定分子层面的变化，对阴道局部微生态等其他可能参与hpv感染转归的生物学特征覆盖有限。

7、针对阴道微生态，现有技术可通过采集阴道或宫颈相关样本，利用16s rrna测序等方法分析微生物群落的组成及相对丰度，从而研究不同微生物群落特征与hpv感染之间的关系。该类检测能够从局部微生态角度提供与hpv感染相关的信息，并有助于分析微生物群落变化与hpv清除或持续检出之间的关联。

8、然而，基于16s rrna测序的微生物组分析通常主要获得微生物分类组成及相对丰度等信息，其在菌株水平和微生物功能层面的解析能力受到检测方法和分析策略的限制。同时，阴道微生物群落具有一定的动态性，不同个体之间也存在较大的基础差异。因此，即使部分微生物特征与hpv感染转归存在统计学关联，单独依据微生物群落组成仍难以直接、稳定地评价已经hr-hpv阳性的受试者发生持续性感染的个体风险。尤其是在缺乏针对特定感染转归进行训练和验证的风险模型时，微生物检测结果与具体个体的持续感染风险之间仍需要进一步建立相应的评价关系。

9、对于已经检测为hr-hpv阳性但尚未发现明确宫颈病变的受试者，现有管理方式通常需要结合hpv检测结果、病毒基因型、细胞学检查结果以及既往检测情况进行随访，并通过后续时间点的重复检测观察hpv感染是否持续。该方式能够通过连续检测获得感染转归信息，但对于首次检测为hr-hpv阳性的受试者而言，在后续检测结果获得之前，仍缺少能够基于当前生物学特征进行持续感染风险分层的手段。

10、因此，现有hpv检测、病毒分子指标检测以及阴道微生态检测分别从病毒存在状态、病毒基因型、病毒转录活性、宿主分子状态以及局部微生态等不同维度对hpv感染进行表征。已有研究虽然提示上述不同维度的生物学特征与hpv感染转归之间可能存在关联，但现有技术尚难以针对已经确定为hr-hpv阳性的受试者，将多个与感染转归相关的生物学特征进行组合，并建立相应的风险评价关系，从而在持续性感染通过后续时间点检测得到确认之前，对个体发生hr-hpv持续性感染的风险进行评价或分层。

11、因此，有必要提供一种适用于hr-hpv阳性人群的持续性感染风险评估技术，通过检测与hpv感染转归相关的多个生物标志物，并基于所述生物标志物的检测结果建立相应的风险评价模型，从而对hr-hpv阳性受试者发生持续性感染的风险进行评价，并在一定程度上区分持续性感染与一过性感染或hpv基因型改变等不同感染转归，为hr-hpv阳性人群的风险分层及后续管理提供客观的生物学依据。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提供了一种用于预测高危型人乳头瘤病毒持续性感染的标志组合物及应用，该标志组合物能够用于区分hr-hpv持续感染与一过性感染，并能够基于hr-hpv阳性受试者的标志物检测结果，在持续感染尚未通过随访确认之前，对发生hr-hpv持续感染的风险进行早期识别和分层。

2、为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

3、本发明的第一目的在于提供一种用于预测高危型人乳头瘤病毒持续性感染的标志组合物，所述标志物组合用于对高危型人乳头瘤病毒hr-hpv 的阳性受试者进行检测，并根据检测结果预测所述受试者发生hr-hpv持续性感染的风险；所述标志物组合由微生物标志物和小分子代谢物标志物联合组成；所述微生物标志物包括无乳链球菌（streptococcusagalactiae）；所述代谢物标志物包括1-甲基烟酰胺、2,3-二羟基吡啶、d-甘油1-磷酸、l-苯丙氨酰-l-甲硫氨酸、肌酐、去亚甲基诺卡胺和烟酸。

4、进一步地，所述高危型人乳头瘤病毒包括hpv 16、hpv18、hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、 hpv 45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73和hpv82中的一种或多种。

5、本发明的第二目的在于提供一种用于预测高危型人乳头瘤病毒持续性感染的试剂盒，所述试剂盒用于对hr-hpv阳性的受试者进行二次筛查与风险预测，所述试剂盒包括：

6、微生物检测模块：包含用于定量检测无乳链球菌相对丰度或绝对丰度的特异性试剂，所述特异性试剂为针对无乳链球菌特异性保守基因区域的qpcr引物对、探针或16srrna测序引物；

7、代谢物检测模块：包含用于提取或检测所述小分子代谢物含量的试剂、显色剂或内标物。

8、本发明的第二方面在于提供所述的标志物组合、或所述的试剂盒在制备用于筛查、预测或辅助诊断高危型人乳头瘤病毒持续性感染产品中的应用。

9、本发明的第三方面在于提供一种体外预测高危型人类乳头瘤病毒持续性感染的方法，所述方法包括以下步骤：

10、获取已经确定为 hr-hpv 阳性受试者离体的阴道分泌物样本，分别提取其中的微生物总dna和总代谢物；

11、检测所述微生物总dna中无乳链球菌的丰度数据

xmicrobe；

12、检测所述总代谢物中目标小分子代谢物的相对表达量数据

xmetabolite；

13、将所述

xmicrobe和

xmetabolite输入预设的机器预测模型中进行联合计算，得到发生高危型人乳头瘤病毒持续性感染的风险概率值 p；

14、将所述风险概率值 p 与预设的评估标准进行比较，从而预测出所述 hr-hpv 阳性受试者中具有持续性感染高风险的受试者。

15、进一步地，所述目标小分子代谢物的相对表达量数据采用液相色谱-串联质谱法或气相色谱-质谱联用法检测，所述无乳链球菌的丰度数据采用16s rrna测序或宏基因组测序检测。

16、进一步地，所述机器预测模型包括通过留一交叉验证框架完成超参数优化的机器学习模型；所述机器学习模型包括支持向量机模型、k近邻模型、集成树模型、神经网络模型、随机森林模型或逻辑回归模型。

17、进一步地，所述机器预测模型为基于逻辑回归构建的数学模型，所述风险概率值p 通过如下公式计算：

18、logit(

p)=2.01.2x10.9x20.7x30.6x4+0.8x50.5x6+0.7x70.6x8

19、式中，其中x1~x8分别代表无乳链球菌、1-甲基烟酰胺、2,3-二羟基吡啶、d-甘油1-磷酸、l-苯丙氨酰-l-甲硫氨酸、肌酐、去亚甲基诺卡胺、烟酸的检测值。

20、进一步地，所述的评估标准为：以 p = 0.50 作为预测和划分风险的截断值cut-off；当计算得到的概率值 p ≥ 0.50 时，判定所述受试者倾向于发生高危型人类乳头瘤病毒持续性感染；当计算得到的概率值 p<0.50时，将所述受试者排除于持续性感染人群之外。

21、本发明的第四方面在于提供一种用于辅助预测高危型人类乳头瘤病毒持续性感染的系统，所述系统包括：

22、数据输入模块，用于接收已经确定为 hr-hpv 阳性受试者离体样本中无乳链球菌的丰度数据以及目标小分子代谢物的相对表达量数据；

23、多组学分析模块，用于所述的数学模型与截断值对输入的无乳链球菌的丰度数据以及目标小分子代谢物的相对表达量数据进行联合计算，输出受试者发生高危型人乳头瘤病毒持续性感染的概率值并自动比对预测结果；

24、结果输出模块，根据所述预测结果生成并展示预测高危型人乳头瘤病毒持续性感染的临床风险评估结果报告。

25、现有技术比较，本发明提供的技术方案带来的有益效果是：

26、（1）与单独采用hpv核酸检测或病毒基因分型检测相比，本发明针对已经确定为hr-hpv阳性的受试者，引入阴道微生态和小分子代谢物等不同维度的生物学信息，并通过标志物组合和风险预测模型进行联合分析。为hr-hpv阳性受试者的感染转归评价提供额外的生物学信息，并可用于区分持续感染与一过性感染以及其他感染转归状态。

27、（2）本发明通过将无乳链球菌丰度和7个小分子代谢物检测结果输入预先建立的风险预测模型，可以获得定量化的风险概率值，并据此进行风险分层。由此，可以在持续感染尚需通过后续随访检测进行确认之前，为hr-hpv阳性受试者提供一种基于离体样本检测结果的风险评价方式。

28、（3）本发明率先建立基于阴道微生物-代谢物联合标志物的hpv持续感染预测模型，能够在感染早期精准区分一过性感染与持续性感染，提前识别高危个体。与现有hpv分型检测和tct细胞学检查仅能提供“感染状态”和“形态学改变”的局限性相比，本发明实现了从“事后诊断”向“前瞻预测”的跨越，可有效指导临床制定个性化随访方案，避免对低风险一过性感染者的过度诊疗和不必要心理负担，显著优化医疗资源配置。

29、（4）本发明突破了传统单一组学研究的局限，通过宏基因组学与代谢组学的深度整合，实现了从“物种组成”到“功能代谢”的全维度微生态解析。基于7种代谢物和无乳链球菌构建的logistic回归模型，auc达到0.970（95% ci: 0.940–1.000），预测灵敏度、特异性和准确率均较好。这一高性能预测工具为临床提供了可靠的决策支持。

30、（5）本发明不仅提供了预测工具，还基于微生物-代谢物关联机制，为开发靶向益生元/益生菌干预策略提供新思路，提示通过补充短双歧杆菌和两岐双岐杆菌等有益菌，抑制美洲爱文氏菌和荧光假单胞菌等机会致病菌的定植，从而调节阴道微生态平衡，逆转持续性hpv感染。这为临床提供了首个针对hpv持续感染的微生态靶向非药物干预方案思路，尤其适用于疫苗覆盖不足或对传统治疗不耐受的人群，具有重要的临床转化价值和社会效益。

31、（6）本发明率先在菌种和代谢物水平上阐明了hpv持续感染与清除的双向调控通路：

32、促持续感染通路：惰性乳杆菌（lactobacillus iners）通过水平基因转移获得质粒编码的氧化应激耐受、抗菌肽外排和溶菌酶等致病基因，驱动氧化应激和促炎代谢物的积累，营造有利于hpv持续感染的微环境；

33、促清除通路：无乳链球菌（streptococcus agalactiae）通过nadase介导的烟酰胺代谢途径驱动1-甲基烟酰胺（1-mna）的合成，发挥抗炎和抗氧化作用，促进hpv清除；

34、这两条核心通路的阐明，为后续抗hpv持续感染的药物开发提供了明确的功能靶点，也为微生态干预策略的优化提供了理论依据。