一种具有双酶活性的纳米诊疗制剂及其制备方法和应用

本发明属于纳米材料，具体涉及一种具有双酶活性的纳米诊疗制剂及其制备和其在类风湿关节炎等疾病中的诊疗应用。

背景技术：

1、类风湿关节炎（ra）是一种以持续性滑膜炎症、血管翳形成为核心特征的慢性自身免疫性疾病，其全球发病率约为0.5%至1%，且女性患者显著多于男性。ra不仅会导致关节软骨及骨的进行性破坏，造成关节畸形和高达60%-70%的致残率，还会引发心血管疾病、肺间质病变等一系列全身性并发症，严重威胁患者的生命健康与生活质量。

2、ra的发病机制复杂，目前公认的核心病理环节包括：氧化应激与缺氧，进而导致促炎型m1巨噬细胞异常活化与极化失衡、以及由此引发的炎症级联反应和软骨组织破坏，进而致残。近年来，针对ra病理微环境的调控策略受到广泛关注。研究表明，氧化应激与缺氧促进巨噬细胞向促炎性m1型巨噬细胞极化，而m1型巨噬细胞是炎症和骨侵蚀的主要驱动因素，其通过分泌tnf-α、il-1β等促炎细胞因子和过量ros加剧关节破坏。因此，若能同时实现高效ros清除与缓解缺氧，进而诱导巨噬细胞表型重塑，将有望从根本上改善ra的发生与进展。

3、随着纳米科学与技术的兴起与发展，纳米医学将纳米技术广泛应用于多个生物医学领域，主要包括疾病治疗、诊断、分子成像以及再生医学等。将纳米材料引入到类风湿关节炎的诊断与治疗更是引起了国内外研究者的广泛关注。其中，金属有机框架（mofs）作为一种由金属节点与有机配体通过配位键形成的多孔晶体材料，其高比表面积、可调孔径及结构多样性使其成为小分子药物的理想载体。

4、具有酶活性的分子作为结构单元构建mofs赋予了mofs多功能化以及酶的活性。通过将具有酶活性的分子引入mof结构，实现了结构稳定性、催化活性和功能可设计性的融合。在肿瘤治疗、生物催化、传感检测和免疫调控等领域展现出巨大潜力，也将成为该领域的重要研究方向。

技术实现思路

1、针对多数纳米酶体系仅关注单一治疗功能，缺乏诊疗一体化的设计；mof载体与酶的偶联方式往往影响酶的活性保持；纳米诊疗剂的生物相容性和靶向性有待提高；对级联反应的空间协同效应缺乏优化的问题，本发明提供一种具有双酶活性的纳米诊疗制剂，通过合理设计mofs的结构使其具有类酶活性。引入具有酶活性的锰卟啉作为构建mof的配体，同时负载超小铈纳米酶颗粒和功能性靶向配体ha，实现对活性氧ros的级联清除，协同缓解氧化应激与缺氧，调控巨噬细胞表型极化，实现免疫调控及精准靶向治疗。

2、为解决上述技术问题，本发明采用了下列技术方案：

3、本发明第一方面，提供了一种具有双酶活性的金属有机框架纳米诊疗剂的制备方法，包括以下步骤：

4、步骤1，将四羧基苯基卟啉锰(mn-tcpp)、苯甲酸（ba）、八水氧氯化锆(zrocl2·8h2o)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶剂中进行反应，洗涤后得到金属有机框架mn-pcn；

5、步骤2，将醋酸铈水合物、油胺溶解中在二甲苯溶剂中，混合物超声，以每分钟2摄氏度的加热速率从20 °c加热到90 °c时向反应液中加入去离子水。溶液颜色从白色变为黄色，表示反应已经发生。在90 °c下孵育3小时后，将得到的溶液冷却至室温，并进行离心洗涤。将得到的ce纳米颗粒重新分散在氯仿中。

6、步骤3，为了实现水分散和马来酰亚胺功能化，将ce纳米颗粒进一步用磷脂-聚乙二醇（peg）修饰。因此，将peg溶解在氯仿中，然后与氯仿中的ce纳米颗粒混合。混合物超声，用旋转蒸发器去除样品中的氯仿，然后在60 °c真空烘箱干燥，使氯仿完全去除。接着，向样品中加入去离子水并超声，得到透明的胶体悬液。将得到的ce纳米颗粒样品离心洗涤去除多余的peg。

7、步骤4，将金属有机框架mn-pcn负载ce纳米酶，搅拌过夜后离心洗涤，得到mn-pcn@ce；然后将mn-pcn@ce与透明质酸（ha），混合搅拌过夜，使mn-pcn@ce的外层包裹透明质酸，离心洗涤后得到mn-pcn@ceh纳米诊疗制剂。

8、在mn-pcn中，锰卟啉具有sod活性。进一步引入的铈纳米酶，可通过ce的价态转换使其具有类sod和类cat活性。此外，ha可与炎症部位高表达的cd44的受体结合，从而实现纳米药物的精准靶向并对ros级联清除，协同缓解氧化应激与缺氧，实现免疫调控。

9、进一步地，所述四羧基苯基卟啉锰、苯甲酸和八水氧氯化锆的质量比为5 : 0.14: 15。

10、进一步地，所述具有双酶活性的金属有机框架mn-pcn、ce纳米酶的质量比为1:1、1:2、1:3、1:4。

11、优选地，所述具有双酶活性的金属有机框架mn-pcn、ce纳米酶的质量比为1:2。

12、进一步地，所述mn-pcn@ce与透明质酸的质量比为1:1、1:2、1:3。

13、更进一步地，所述mn-pcn@ce与透明质酸的质量比为1：2。

14、进一步地，制备过程中离心的条件是离心转速为12000r/min，离心时间为10 min。

15、本发明提供了一种如前述制备方法制得的具有双酶活性的金属有机框架纳米诊疗剂，具有强靶向性和治疗协同性。本发明将四羧基苯基卟啉（tcpp）与锰（mn）螯合，合成锰四羧基苯基卟啉（mn-tcpp）。以mn-tcpp为配体、锆化合物团簇为金属节点合成锰卟啉mof（mn-pcn），不仅保留mof的结构优势，还使其具有了类超氧化物歧化酶（sod）的功能特性。紧接着，在mn-pcn表面负载铈纳米酶（ce nps），ce nps作为一种基于纳米材料的人工酶，比天然酶的催化稳定性更高，通过ce3+ /ce4+ 的可逆转化而具有类sod和类过氧化氢酶（cat）活性等，能够有效清除o2- 和h2o2。最后，用透明质酸（ha）修饰，用于提升其稳定性与靶向性。本发明构建的具有双酶活性的纳米诊疗制剂（mn-pcn@ceh），通过缓解氧化应激与缺氧，可实现缓解ra的进展。

16、一种具有双酶活性的金属有机框架纳米诊疗剂在治疗类风湿关节炎中的应用。

17、与现有技术相比本发明具有以下优点：

18、本发明的纳米诊疗剂以mn-pcn为载体负载铈纳米酶，并用ha修饰用于提升其稳定性与靶向性。针对类风湿关节炎中氧化应激与缺氧，以及m1型巨噬细胞异常极化导致的炎症恶性循环，所述纳米诊疗剂利用mn-pcn的类sod活性与铈纳米酶的类sod、cat活性构建级联抗氧化通路，持续清除超氧阴离子和过氧化氢，缓解氧化应激与缺氧；进而诱导巨噬细胞从m1向m2表型极化，降低tnf-α、il-1β等促炎因子分泌。该体系最终实现活性氧清除、乏氧改善与免疫微环境重塑的多模式协同与级联促进，从而显著提升类风湿关节炎的治疗效果。

1.一种具有双酶活性的金属有机框架纳米诊疗制剂，其特征在于，所述纳米诊疗制剂包括：

2.根据权利要求1所述的纳米诊疗制剂，其特征在于，所述mn-pcn具有类超氧化物歧化酶活性，所述铈纳米酶通过ce3+/ce4+价态可逆转化具有类超氧化物歧化酶活性和类过氧化氢酶活性。

3.根据权利要求1所述的纳米诊疗制剂，其特征在于，所述透明质酸通过与炎症部位高表达cd44受体的特异性结合实现靶向递送。

4.一种具有双酶活性的金属有机框架纳米诊疗制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述四羧基苯基卟啉锰、苯甲酸和八水氧氯化锆的质量比为5:0.14:15。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述mn-pcn与铈纳米酶的质量比为1:1至1:4。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述mn-pcn@ce与透明质酸的质量比为1:1至1:3。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，离心的转速为12000 r/min，离心的时间为10 min。

9.根据权利要求1-3任一项所述的纳米诊疗制剂在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述纳米诊疗制剂通过级联清除活性氧、缓解氧化应激与缺氧、诱导巨噬细胞从m1向m2表型极化来治疗类风湿关节炎。