一种含HSV-2gB2/gC2/gD2三抗原的重组蛋白疫苗组合物及其应用

本发明属于生物医药和疫苗制备，具体涉及一种含hsv-2 gb2/gc2/gd2三抗原的重组蛋白疫苗组合物及其应用。

背景技术：

1、单纯疱疹病毒（hsv）分为hsv-1和hsv-2两种主要型别，其中hsv-2是生殖器疱疹的重要病原体。hsv-2感染后可在宿主神经节内建立长期潜伏状态，并在免疫状态变化、局部刺激或其他诱因作用下出现反复再激活，导致复发性皮肤黏膜损害及病毒排毒。由于病毒潜伏机制复杂，现有抗病毒药物（如阿昔洛韦）通常难以彻底清除潜伏病毒，因此开发安全有效的预防性疫苗具有重要意义。由于生殖器疱疹的感染始于生殖道黏膜，建立有效的黏膜免疫屏障对预防hsv-2感染尤为关键。现有疫苗技术中，灭活或减毒全病毒疫苗因安全性和免疫原性问题进展缓慢，而重组亚单位疫苗逐渐成为主流。然而，现有单抗原（如仅gb或gd）或两抗原疫苗虽可诱导一定的全身igg应答，但普遍存在三个关键不足：1）抗原覆盖面有限，难以诱导全面均衡的体液免疫；2）大多数采用肌肉注射加传统全身佐剂（如alum），难以有效诱导生殖道黏膜局部的siga应答，黏膜防护能力不足；3）现有工作缺乏黏膜双佐剂策略的系统验证，难以同时强化全身和局部黏膜免疫。

2、因此如何克服现有技术的不足是目前生物医药和疫苗制备技术领域亟需解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种含hsv-2 gb2/gc2/gd2三抗原的重组蛋白疫苗组合物及其应用。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明第一方面提供一种含hsv-2 gb2/gc2/gd2三抗原的重组蛋白疫苗组合物，包括hsv-2重组蛋白和复合黏膜佐剂；其中，hsv-2重组蛋白由hsv-2 gb2、hsv-2 gc2、hsv-2gd2三个蛋白的胞外域组成，其中，hsv-2 gb2、hsv-2 gc2、hsv-2 gd2胞外域的氨基酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3所示；所述的复合黏膜佐剂为dmlt和mpla。

4、进一步，hsv-2 gb2蛋白胞外域、hsv-2 gc2蛋白胞外域、hsv-2 gd2蛋白胞外域、dmlt、mpla的质量比为10：10：10：10：25。

5、本发明第二方面提供一种含hsv-2 gb2/gc2/gd2三抗原的重组蛋白疫苗的制备方法，采用所述的含hsv-2 gb2/gc2/gd2三抗原的重组蛋白疫苗组合物，包括如下步骤：

6、步骤（1）将hsv-2 gb2、hsv-2 gc2、hsv-2 gd2三个蛋白胞外域对应的编码基因序列分别克隆至pfastbac1质粒的hindⅲ和ecorⅰ酶切位点之间，构建重组pfastbac1gb2质粒、重组pfastbac1gc2质粒以及重组pfastbac1gd2质粒；

7、步骤（2），从重组pfastbac1gb2质粒、重组pfastbac1gc2质粒以及重组pfastbac1gd2质粒中分别对应获取三种蛋白编码基因的目的片段，将其插入到bacmid质粒中，对应构建出三种重组bacmid质粒；

8、步骤（3），使用真核表达系统sf9细胞分别对步骤（2）构建出三种重组bacmid质粒进行蛋白表达，用镍柱纯化蛋白，分别获得hsv-2 gb2、hsv-2 gc2、hsv-2 gd2三个蛋白胞外域，置于-80℃保存；

9、步骤（4），将步骤（3）纯化得到的hsv-2 gb2、hsv-2 gc2、hsv-2 gd2三个蛋白胞外域置于冰上解冻；

10、用dmso将mpla佐剂溶解为1mg/ml的mpla母液；

11、用1ml超纯水将dmlt佐剂进行溶解为3mg/ml的dmlt母液；

12、然后将hsv-2 gb2蛋白胞外域、hsv-2 gc2蛋白胞外域、hsv-2 gd2蛋白胞外域、mpla母液、dmlt母液混合，并采用生理盐水进行稀释，即得到含hsv-2 gb2/gc2/gd2三抗原的重组蛋白疫苗。

13、进一步，每针剂含hsv-2 gb2/gc2/gd2三抗原的重组蛋白疫苗体积为150μl，其中含有hsv-2 gb2蛋白胞外域10μg、hsv-2 gc2蛋白胞外域10μg、hsv-2 gd2蛋白胞外域10μg、dmlt佐剂10μg、mpla佐剂25μg。

14、本发明第三方面提供所述的含hsv-2 gb2/gc2/gd2三抗原的重组蛋白疫苗的制备方法制得的含hsv-2 gb2/gc2/gd2三抗原的重组蛋白疫苗。

15、本发明第四方面提供所述的含hsv-2 gb2/gc2/gd2三抗原的重组蛋白疫苗组合物在制备预防或者治疗单纯疱疹病毒的感染导致的疾病的疫苗中的应用。

16、进一步，单纯疱疹病毒包括单纯疱疹病毒1型和单纯疱疹病毒2型。

17、本发明疫苗组合物以gb2、gc2和gd2作为核心抗原，联合dmlt（双突变不耐热肠毒素）和mpla（单磷酰脂a）复合黏膜佐剂。与仅针对单一入侵靶点的疫苗方案相比，本发明抗原组合同时覆盖病毒吸附、膜融合和受体结合等关键阶段，具有更完整的感染阻断阶段。通过对豚鼠进行免疫原性、安全性以及攻毒后保护效果的评价，验证其作为疫苗预防hsv-2的可行性，有望为hsv-2疫苗研发提供理论支持。

18、本发明疫苗采用肌肉注射免疫，免疫程序为3次免疫，每次间隔14天。

19、本发明疫苗是hsv-2病毒株和hsv-1病毒株的交叉免疫保护疫苗。

20、本发明通过优化gb2、gc2、gd2三抗原组合，配伍dmlt（双突变不耐热肠毒素）和mpla（单磷脂质a）黏膜双佐剂系统，采用肌肉注射途径，创新性地解决了上述问题。dmlt作为经过工程改造的黏膜免疫激发分子，具有增强局部黏膜上皮免疫应答的能力；mpla作为天然免疫增强分子，可激活固有免疫和适应性免疫。两种佐剂的协同组合既能诱导高水平的血清特异性igg抗体响应（涵盖gb、gc、gd三抗原），又能有效诱导生殖道黏膜局部特异性siga和igg应答，形成双重防御。本发明疫苗在豚鼠模型上的实验结果表明，相比现有取得不错免疫效果的三抗原疫苗（gc2/gd2/ge2），该三抗原和双佐剂组合也显著提升了免疫覆盖面、黏膜免疫原性和交叉保护潜力。

21、本发明并非简单的叠加佐剂，而是基于hsv-2既需“系统免疫”又需“黏膜屏障”的生物学特性，有针对性地选择了dmlt（侧重黏膜应答）与mpla（侧重系统应答）进行配伍。单一佐剂在机制上存在先天局限，无法独立解决“全面阻断病毒入侵及排毒”这一特定的技术难题。

22、本发明与现有技术相比，其有益效果为：

23、（1）本发明将hsv-2的三个关键包膜糖蛋白gb2、gc2和gd2进行组合。通过对gb2、gc2和gd2三种抗原的配伍，并非简单的功能叠加，而是实现了免疫应答的深度协同。

24、（2）本发明将dmlt与mpla联合使用作为hsv-2疫苗的复合佐剂。dmlt是一种高效的黏膜佐剂，能够诱导平衡的th1、th2型应答及th17型免疫反应；mpla是tlr4激动剂，能够增强抗病毒免疫应答并促进抗原交叉提呈。二者联用产生协同效应，显著增强了疫苗的免疫原性。

25、（3）本发明以hsv-2 gb2、gc2、gd2蛋白作为抗原，以dmlt和mpla佐剂作为复合佐剂，通过肌肉注射的方式免疫豚鼠，成功诱导高水平的gb、gc、gd特异性igg抗体和iga抗体，且免疫血清具有对hsv-2 km-1病毒株的中和能力和对hsv-1 strain17病毒株的交叉中和能力；组织病理学评价显示，经本发明的疫苗组合物免疫后，豚鼠心、肝、脾、肺、肾等主要脏器未见明显病理损伤，表现出良好的生物安全性。

26、（4）实验证明，本发明的gb2/gc2/gd2+dmlt+mpla疫苗在豚鼠hsv-2感染模型中生殖道病毒载量、病毒清除速度以及生殖道病理损伤方面都与阳性对照组（gc2/gd2/ge2）相差不大，均远远优于阴性对照组。