一种间充质干细胞外泌体负载ML349的APT2抑制剂及其制备方法和应用

本发明涉及医药，具体而言，涉及一种间充质干细胞外泌体负载ml349的apt2抑制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、阿尔茨海默病（ad）是65岁以上老年人群高发的中枢神经系统退行性疾病，以神经元进行性病变所致的认知功能障碍为核心临床表现。伴随全球人口老龄化进程加速，阐明ad的致病分子机制、开发新型干预靶点与高效脑靶向递送方案，已成为神经科学领域亟待突破的重要课题。目前公认ad的两大核心病理特征为β淀粉样蛋白（aβ）异常沉积形成的老年斑，以及tau蛋白过度聚集形成的神经原纤维缠结，二者介导的神经毒性是神经元丢失的主要驱动因素。生理状态下，tau蛋白高表达于神经元轴突，通过结合微管维持骨架稳定性并调控轴突物质运输；tau与微管结合能力的异常下降，被认为是tau蛋白发生胞内聚集、推动ad病理进展的关键前置环节。

2、间充质干细胞外泌体是细胞分泌的纳米级胞外囊泡，免疫原性低，具备天然神经保护与免疫调节活性；经鼻腔给药可以通过嗅神经通路、三叉神经通路绕开血脑屏障直接入脑，能够响应脑内炎症趋化信号靶向富集于中枢损伤病灶，是中枢疾病极具潜力的药物递送载体。

3、目前，现有研究大多聚焦tau蛋白过度磷酸化，tau蛋白过度磷酸化是导致其与微管解离并诱发缠结的核心原因，但磷酸化以外的其他蛋白质翻译后修饰是否参与调控这一病理过程，仍缺乏系统阐释与明确验证。其中，蛋白质棕榈酰化作为一种可逆的脂类翻译后修饰，可通过调控蛋白亚细胞定位、分子间相互作用与蛋白稳定性参与多种神经疾病进程，是解析tau病理调控机制的潜在新方向。酰基蛋白硫酯酶2（apt2/lypla2）是调控蛋白质去棕榈酰化的关键酶之一，阿尔茨海默病病理状态下apt2发生异常过度激活，催化tau蛋白发生去棕榈酰化，造成tau蛋白棕榈酰化修饰水平下降，驱动tau蛋白聚集、脑内神经炎症爆发，是阿尔茨海默病极具价值的干预靶点。既往研究仅证实apt2参与炎症调控、抗病毒应答等生理过程，apt2作为ad治疗靶点，以及apt2与其与tau蛋白修饰及ad病理的关联此前尚未见文献报道。

4、现有专利cn119524136a公开了一种干预apt2靶点的药物的新用途，率先在apt2靶向干预神经退行性疾病这一方向上实现了系统性的研究突破，填补了相关领域空白，明确了apt2作为ad干预新靶点的科学依据：该研究在ad模型小鼠（5xfad）及临床ad患者脑组织中均证实，tau蛋白的棕榈酰化水平较正常对照显著降低；细胞与动物水平的验证共同表明，apt2可直接介导tau蛋白的去棕榈酰化过程，过表达apt2会显著下调tau棕榈酰化水平，而敲除apt2基因则可明显提升tau蛋白的棕榈酰化修饰水平，同时显著改善模型小鼠的空间工作记忆与学习记忆能力，减少脑内tau蛋白寡聚体聚集，上调突触相关蛋白表达以恢复突触功能，并降低小胶质细胞、星形胶质细胞活化水平及il-1β、il-6、tnf-α等促炎因子表达，有效缓解神经炎症。

5、因此，研发可以高效递送至脑内病灶、生物相容性好、可非侵入给药的负载ml349的apt2抑制剂具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明提出了一种间充质干细胞外泌体负载ml349的apt2抑制剂及其制备方法和应用，旨在解决当前技术中apt2抑制剂ml349血脑屏障穿透差、游离给药脑暴露不足，环糊精包载体系药效有限的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

3、一种apt2靶点的应用，抑制所述apt2靶点可以治疗apt2异常激活、tau蛋白棕榈酰化水平降低的阿尔茨海默病。

4、一种用于抑制权利要求1所述的apt2靶点的间充质干细胞外泌体负载ml349的apt2抑制剂，所述抑制剂包含以下质量份数的组分：

5、脐带来源间充质干细胞外泌体0.1-2份、apt2小分子抑制剂ml349 0.01-0.2份、无菌pbs缓冲液97.8-99.89份。

6、进一步的，所述apt2抑制剂的剂型为鼻腔滴注制剂。

7、进一步的，所述apt2抑制剂还配套有鼻腔预处理液，所述鼻腔预处理液按质量份数计：透明质酸0.2份，余量为无菌pbs缓冲液。

8、一种间充质干细胞外泌体负载ml349的apt2抑制剂的制备方法，包含以下步骤：

9、s1 脐带来源间充质干细胞外泌体的分离纯化，得到纯化脐带间充质干细胞外泌体；

10、s2 将纯化脐带间充质干细胞外泌体与ml349混合，置于冰浴；使用脉冲超声处理混合物；每完成一次超声循环，将样品置于冰上冷却；

11、s3 超声结束后，混合物室温孵育4小时，孵育完成后离心处理，沉淀载药外泌体复合物，向沉淀加入预冷pbs缓冲液洗涤沉淀，再次以相同离心条件离心，弃除上清，pbs重悬沉淀；

12、s4 测定ml349包封率，调节体系ph、渗透压，0.22μm无菌过滤，无菌分装得到滴鼻制剂，同时配制配套0.2%透明质酸无菌水溶液鼻腔预处理液。

13、进一步的，步骤s1中所述脐带来源间充质干细胞外泌体的分离纯化的具体步骤为：

14、s1-1、样品预处理：收集脐带间充质干细胞无血清培养24至48小时后的上清液，将上清液在4℃条件下，以300×g离心10分钟，之后取上清，在4℃条件下，以2000×g离心20分钟，将上清液用0.22μm滤器过滤，完成预处理；

15、s1-2、tff切向流过滤浓缩：将中空纤维柱的进液端和回流端放入预处理后的料液容器中，透过端放入废液桶，之后启动蠕动泵开始浓缩，进口压力设定为30psi，出口压力设定为10psi，跨膜压维持在20psi左右，持续浓缩直至体积缩小至原体积的二十分之一；

16、s1-3、tff洗滤：浓缩完成后立即开始连续洗滤操作，调整无菌pbs缓冲液的流入速度，使其与透过端的流出速度保持一致，实现等体积置换，连续洗滤6倍透析体积，洗滤完成后，收集截留端的浓缩液，准备用于sec上样；

17、s1-4、sec尺寸排阻色谱精纯：根据样本体积选择合适的qev柱，将sec柱平衡至室温，移除柱子底部的滑动盖，使用至少10ml的pbs洗脱缓冲液冲洗柱子，并观察缓冲液流速是否稳定，之后将tff浓缩液缓慢加入sec柱顶部，开始洗脱，最开始的3ml洗脱液为空隙体积，继续添加pbs洗脱，收集空隙体积之后的液体，后续通过纳米颗粒追踪分析或280nm吸光度检测来确定外泌体富集的馏分并合并；

18、s1-5、最终处理与保存：将sec洗脱出的外泌体富集馏分合并，使用0.22μm滤器进行除菌过滤，按实验需求分装至无菌冻存管中，保存于-80℃冰箱。

19、进一步的，步骤s2中所述超声功率为130w；所述脉冲的模式为超声10s、停止10s，循环3次，脉冲总处理时间为2min；每完成一次超声循环，将样品置于冰上冷却2min。

20、进一步的，步骤s3中所述离心参数为：转速14000g、温度4℃、时间30min。

21、进一步的，步骤s3中所述预冷pbs缓冲液的添加量为250μl。

22、进一步的，步骤s4中所述调节体系ph为调节至5.5-6.5；所述渗透压为250~350mosm/kg。

23、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

24、本发明中脐带间充质干细胞外泌体滴鼻给药，仅2次滴注即可在海马、大脑皮层检测明显药物载体荧光信号，经鼻-脑通路直接入脑，规避血脑屏障、肝脏首过效应；外泌体响应脑内炎症信号主动靶向ad病灶，实现对脑内apt2靶点的有效抑制。

25、本发明中采用的脐带间充质干细胞外泌体本身具有免疫调节、神经保护活性，与ml349靶向apt2的药理效应协同，对比羟丙基-β-环糊精包载ml349（核心指标改善约30%）；本发明制剂tau蛋白棕榈酰化水平回升45%-50%；il-1β、tnf-αmrna水平下调50-60%，治疗效果显著提升。

26、本发明中滴鼻为非侵入给药，操作简便；配套透明质酸预处理进一步提升黏膜渗透；外泌体免疫原性低，生物相容性高，体内安全性好。

27、本发明采用切向流过滤联合尺寸排阻色谱纯化外泌体，兼顾产量与纯度；超声脉冲载药工艺稳定可控，可适配科研、中试放大生产；滴鼻制剂理化适配鼻腔生理条件。

28、本发明中动物实验证实，所述抑制剂同时实现分子病理、细胞炎症、行为学功能改善：减少tau寡聚聚集，抑制小胶质、星形胶质细胞活化，上调突触蛋白neun、syn-1；y迷宫、morris水迷宫证实可显著逆转5xfad模型小鼠短期工作记忆、空间学习记忆缺陷。