一种基于核糖体毒性应激反应的响应性纳米诊疗材料

本发明属于医学诊断与生物医学材料制备领域，涉及一种用于核糖体毒性应激反应协同诱导的响应性纳米肿瘤诊疗材料的制备。

背景技术：

1、恶性肿瘤的精准治疗与实时疗效评估是当前生物医学领域的核心挑战之一。传统的化疗药物因其缺乏靶向性及显著的毒副作用，临床应用受限。近年来，基于核酸药物的基因治疗，特别是反义寡核苷酸（aso）技术，为特异性干预疾病相关基因表达提供了新策略。然而，aso等生物大分子面临细胞膜渗透性差、体内易降解、靶向递送效率低以及单一疗法易引发细胞代偿性耐药等多重瓶颈。因此，开发能够协同多种治疗机制、并兼具实时反馈功能的智能递送系统，对于提升肿瘤治疗的特异性与有效性具有重要意义。

2、核糖体毒性应激反应是细胞在翻译过程中遭遇严重障碍时触发的一种程序性死亡通路，为诱导肿瘤细胞凋亡提供了新颖的靶点。通过小分子药物诱导翻译应激与aso抑制细胞存活通路相结合，有望协同放大此应激信号，实现对肿瘤细胞的高效杀伤。同时，实现治疗过程的可视化监控——即“治疗诊断学”理念，能为了解药物在细胞内的行为与疗效提供直接依据。

技术实现思路

1、为了解决传统的操作繁琐、灵敏度和特异性不足、无法实时且原位成像等核心问题，本发明提出了一种高灵敏实时成像、高度特异性的基于沸石咪唑酯骨架材料-8（zif-8）的多功能共递送材料。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

3、一种基于核糖体毒性应激反应的响应性纳米诊疗材料，简称为zcn，为包裹dnp-a探针、dnp-b探针和leu-ams（cas no. 288591-93-5）的沸石咪唑酯骨架材料-8（zif-8）；

4、所述dnp-a探针由核苷酸序列分别如seq id no:1-4所示a1、a2、a3、a4通过碱基互补配对形成；所述dnp-b探针由核苷酸序列分别如seq id no:5-8所示b1、b2、b3、b4通过碱基互补配对形成；

5、所述a1第7位核苷酸和第8位核苷酸通过二硫键连接，第26位核苷酸和第27位核苷酸通过二硫键连接；a2的3’端修饰荧光基团；a3的5’端修饰猝灭基团；a4的第8位和第20位为ap位点；

6、所述b1第7位核苷酸和第8位核苷酸通过二硫键连接，第26位核苷酸和第27位核苷酸通过二硫键连接；b2的3’端修饰荧光基团；b3的5’端修饰猝灭基团；b4的第9位和第21位为ap位点。

7、优选地，所述荧光基团和猝灭基团选自fam和tamra。

8、dnp-a探针合成，包括以下步骤：将a1、a2、a3、a4于nebuffertm2缓冲液中混合，95℃水浴加热5min，缓慢冷却至室温，得到dnp-a探针；a1、a2、a3、a4的摩尔比为1:1:1:1。

9、dnp-b探针合成，包括以下步骤：将b1、b2、b3、b4于nebuffertm2缓冲液中混合，95℃水浴加热5min，缓慢冷却至室温，得到dnp-b探针；b1、b2、b3、b4的摩尔比为1:1:1:1。

10、将leu-ams溶液、dnp-a探针溶液、dnp-b探针溶液和2-甲基咪唑甲醇溶液混合，然后再加入硝酸锌甲醇溶液，剧烈搅拌反应后静置，固液分离，固体即zcn。

11、所述zn2+和2-甲基咪唑的摩尔比为1:5-10。

12、所述zn2+和leu-ams的摩尔比为1:100-500。

13、所述zn2+和dnp-a探针的摩尔比为105-107:1；dnp-a探针和dnp-b探针的摩尔比为1:1。

14、一种包含上述探针组dnp-a和dnp-b的检测试剂盒。上述的试剂盒可用于双靶向检测肿瘤标志物ape1和gsh。

15、一种双靶向检测肿瘤标志物ape1和gsh的方法，包括以下步骤：将游离的dnp-a探针、游离dnp-b探针和待测样品或空白样品混合，然后避光孵育，孵育完成后测量相对于空白样品，待测样品580nm/520nm的荧光强度比值。比值升高说名待测样品中同时含有ape1和gsh。

16、一种抗肿瘤药物，包括上述响应性纳米诊疗材料。所述药物用于治疗ape1和gsh高表达的肿瘤。

17、本发明的原理如图1所示，其中各核酸元件的序列如下：

18、a1：

19、gctacgt/ihs-sh/tacaatgcgtacacctttc/ihs-sh/tgcatcg；

20、a2：

21、gcaatttccatctcagg

cgccagcgtgacgcccgcattgtaacgtagc/fam/；

22、a3：

23、/tamra/cgatgcagaaaggtgt

ggcgtcacgctggcgcgactcta tgacaaa ct；

24、a4：

25、tttgtca/idsp/agagtcctgag/idsp/tggaaatt；

26、b1：

27、gactcta/ihs-sh/tgacaaactagcaatttcc/ihs-sh/atctcag；

28、b2：

29、acacctttctgcatcgg

cggcagcgtgacgcgagtttgtcatagagtc/fam/；

30、b3：

31、/tamra/ctgagatggaaattgc

cgcgtcacgctgccgcgctacgttacaatgcg；

32、b4：

33、cattgtaa/idsp/gtagccgatgc/idsp/gaaaggt；

34、其中，ihs-sh表示二硫键连接，是通过将前、后两个核苷酸的磷酸酯分别替换为巯基磷酸酯、硫代磷酸酯缩合后获得；idsp表示ap位点；上述核酸元件中相同标示的部分可以通过碱基互补配对结合形成双链，下划线和加粗部分分别标示znf598和gcn2的aso序列。

35、利用生物相容性良好的沸石咪唑酯骨架材料-8（zif-8）作为纳米载体，本发明通过一锅法在生物相容性良好的zif-8中共封装翻译应激诱导剂（leu-ams）与设计的双重响应性核酸探针（dnp-a和dnp-b）。该dnp探针在稳定状态下，其序列被“锁定”，治疗性反义寡核苷酸（aso）被掩蔽，其两端标记的供体（fam）与受体（tamra）荧光基团因距离较近而发生荧光共振能量转移（fret），导致供体荧光淬灭。

36、本发明的材料通过正常组织和肿瘤组织的结构差异实现肿瘤区域的富集：正常组织血管内皮间隙仅2-8 nm，大分子/纳米颗粒会被截留、快速清除；实体瘤新生血管发育畸形、内皮缝隙宽达100-780 nm，淋巴回流缺失：zif-8常规合成粒径几十至200 nm，刚好能穿透肿瘤血管进入间质；进入后没有淋巴回流带走，长时间滞留在肿瘤区域，局部富集浓度远高于正常器官。

37、当zcn被肿瘤细胞内吞后，其zif-8骨架在更强酸性的溶酶体环境中迅速降解，释放出包载的leu-ams与dnp探针。

38、对于dnp探针，在肿瘤细胞质内高浓度的还原性谷胱甘肽（gsh）和核酸修复酶ape1的共同作用下，dnp探针中预设的ap位点与二硫键被精确切割。此过程一方面释放出具有活性的aso，该aso可特异性结合并znf598和gcn2的mrna，沉默其表达，从而削弱细胞的抗应激防御能力；另一方面，触发了探针的构象重排：释放aso后剩余的核酸骨架碎片，依据碱基互补原则，自发进行自组装，形成有序的纳米网状结构。该组装过程使得多个fam与tamra在空间上紧密、规则排列，极大增强了fret效率，导致tamra受体荧光显著增强（或fam供体荧光恢复，取决于检测通道），产生强烈且特异的“turn-on”型荧光信号。此信号不仅实时、原位报告了aso的成功释放，其组装体结构更起到了信号放大作用。

39、对于leu-ams，其可干扰蛋白质翻译起始，引发初步的核糖体应激。

40、由于aso对细胞生存过程中关键路径酶的抑制，使得leu-ams引发的轻微翻译初始障碍被急剧放大，协同驱动不可逆的核糖体毒性应激反应，最终导致肿瘤细胞凋亡。

41、综上，本发明的材料实现了从靶向递送、双重响应、协同治疗到疗效可视化的完整闭环。

42、由于正常细胞和肿瘤细胞中的溶酶体酸性差异以及细胞中gsh、ape1含量差异，导致上述过程几乎不在正常细胞中发生，从而实现对肿瘤的特异性靶向。

43、本发明具有以下优点：

44、相较于传统检测癌症标志物的传感器，本发明展现出多重显著优势。首先，它能够提供实时、动态的可视化信息，不仅可静态定位肿瘤，还能监测治疗过程中生物标志物的变化，为疗效评估提供直观依据。其次，它具备高空间分辨率，能清晰显示肿瘤的边界、浸润范围乃至瘤内异质性分布，这是传统体液检测无法实现的。再者，通过设计多重靶向或多色荧光探针，理论上可实现多标志物的同步成像，有助于更全面、准确地进行肿瘤识别与分型。最后，荧光成像设备相对普及且操作简便，这为其临床转化提供了便利。本发明通过将高灵敏度的荧光成像与特异的肿瘤标志物双响应识别相结合，融合了分子特异性的识别能力与光学成像的直观可视性，从而有望在活体层面实现肿瘤的定位、边界界定乃至分子分型的可视化。