一种增加骨密度的活性骨髓肽-钙复合物及其制备方法与流程

本发明涉及生物提取，特别是涉及一种增加骨密度的活性骨髓肽-钙复合物及其制备方法。

背景技术：

1、牦牛栖息于海拔3000m以上高寒地带，其骨皮质因长期抵御强紫外、低氧及机械应力，胶原分子内/间交联度比普通黄牛高15%-25%，羟脯氨酸交联密度大，形成致密的“钙-胶原”网络。传统单一酶法或搅拌罐批次酶解存在水解效率低、目标肽段得率低、肽段在胃肠道中易被进一步降解、以及肽与钙等矿物质协同性差等缺陷，限制了牦牛骨活性肽在骨骼健康食品中的高值化利用。

2、鲟鱼作为古老软骨硬鳞类鱼类，其脊索组织富含ⅱ型胶原蛋白和硫酸软骨素。研究表明，从鲟鱼脊索中提取的ⅱ型胶原蛋白产率可达45.25%，硫酸软骨素产率可达5.34%。然而，现有骨肽制备多以单一陆生动物骨为原料，缺乏ⅱ型胶原及硫酸软骨素等软骨保护组分，无法同时实现成骨促进和关节软骨保护的双重功效。

3、此外，现有酶解工艺多采用单酶或双酶随机水解，缺乏对胶原蛋白特征序列（gly-x-y重复序列）的定向切割策略，导致富含脯氨酸和羟脯氨酸的活性肽段释放效率低。酶解所得小分子肽在胃肠道中易被胃蛋白酶、胰蛋白酶进一步降解，口服生物利用度有限。且现有骨肽产品多与钙源通过简单物理混合复配，肽链与钙离子缺乏特异性结合位点，钙的生物利用度低。

4、因此，有必要提供一种增加骨密度的活性骨髓肽-钙复合物及其制备方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种增加骨密度的活性骨髓肽-钙复合物及其制备方法。本发明所述的制备方法通过牦牛红骨髓与鲟鱼脊索组织复配、双功能酶膜反应器连续酶解、脯氨酸特异性内切酶定向切割、微生物转谷氨酰胺酶催化交联及肽-钙配位络合的特定组合，制备的活性骨髓肽-钙复合物生物利用度高、钙协同吸收效果好，能显著增加骨密度。

2、为实现上述目的，本发明提供一种增加骨密度的活性骨髓肽-钙复合物的制备方法，包括以下步骤：

3、s1.将牦牛红骨髓与鲟鱼脊索组织按质量比3∶1复配，加入去离子水打浆，经超高压-超声协同预处理，得预处理骨髓浆；

4、s2.将所述预处理骨髓浆泵入双功能酶膜反应器，控制ph为7.8-8.5、温度为45-55℃、跨膜压力为0.10-0.20mpa、循环流速为120-160ml/min，连续运行4-6h，得水解度为18%-22%的骨髓肽粗提液；

5、s3.调节所述骨髓肽粗提液的ph至6.8-7.2，加入脯氨酸特异性内切酶，在35-40℃下反应1.5-2.5h，灭酶，得定向切割肽液；

6、s4.调节所述定向切割肽液的ph至5.8-6.2，加入微生物转谷氨酰胺酶，在42-48℃下反应2.5-3.5h，至溶液黏度增加30%-50%，灭酶，得交联肽液；

7、s5.将所述交联肽液离心、微滤、纳滤脱盐浓缩，得高纯度活性肽溶液；

8、s6.将所述高纯度活性肽溶液与钙盐溶液混合，调节ph至7.2-7.6，在35-40℃条件下搅拌2-4h，得肽-钙复合物。

9、本发明还提供一种增加骨密度的活性骨髓肽-钙复合物，其通过上述制备方法制备得到。

10、进一步地，步骤s1中，所述牦牛红骨髓，其粗蛋白含量以湿基计不低于15%，含水量以湿基计不高于20%；所述鲟鱼脊索组织，其ⅱ型胶原蛋白含量以干基计不低于30%，硫酸软骨素含量以干基计不低于15%，含水量以湿基计不高于20%。

11、牦牛红骨髓富含ⅰ型胶原蛋白、骨形态发生蛋白-2（bmp-2）和胰岛素样生长因子-1（igf-1），提供成骨信号；鲟鱼脊索组织富含ⅱ型胶原蛋白和硫酸软骨素，提供软骨支架保护。两者按3∶1复配可同时实现硬骨-软骨协同修复，避免单一原料功效单一的问题。

12、进一步地，步骤s1中，所述超高压-超声协同预处理为：先在400-600mpa、室温条件下处理8-15min，再经20khz、250-350w超声处理10-20min。

13、超高压处理可使骨髓组织致密结构松散化，同时灭活内源酶及微生物；超声空化效应可进一步破坏胶原纤维束，提高蛋白暴露度，使后续酶解效率显著提高。超高压处理时间不足8min时组织松散不充分，超过15min则可能过度破坏胶原蛋白的天然结构，影响后续酶解产物的活性。

14、进一步地，步骤s2中，所述双功能酶膜反应器包括聚醚砜平板超滤膜，截留分子量为3000da，有效膜面积为0.02m2；所述超滤膜的膜表面通过聚多巴胺涂覆和戊二醛交联固定化碱性蛋白酶，膜孔内通过溶胶-凝胶包埋固定化胰蛋白酶；所述碱性蛋白酶的酶载量为2.2-2.5mg/cm2，固定化后活性保留率为65%-72%；所述胰蛋白酶的酶载量为1.5-1.8mg/cm2，固定化后活性保留率为58%-65%。

15、膜表面碱性蛋白酶负责催化疏水氨基酸羧端切割，使胶原三螺旋结构解旋；解旋后的大分子肽进入膜孔，被胰蛋白酶在赖氨酸/精氨酸羧端精准切割；分子量小于3000da的肽段透过膜进入渗透液收集罐，未水解的大分子被截留继续反应，实现连续酶解。通过该反应器结构，碱性蛋白酶和胰蛋白酶在空间上分区固定，避免了两种酶相互水解失活的问题，同时实现了产物的即时分离，消除了产物抑制效应。

16、进一步地，步骤s2中，所述双功能酶膜反应器连续酶解过程中，每运行2h补充缓冲液以维持循环料液体积恒定，渗透液收集速率为6-10ml/min。

17、进一步地，步骤s3中，所述脯氨酸特异性内切酶的添加量为所述骨髓肽粗提液中蛋白质量的0.1%-0.5%。

18、脯氨酸特异性内切酶是目前已知唯一能切割pro残基羧基端的内切酶，可特异性水解胶原蛋白特征序列（gly-x-y重复序列）中x位常为脯氨酸的结构特点，定向释放富含脯氨酸和羟脯氨酸的活性肽段。当酶添加量低于0.1%时，定向切割不充分，活性肽段释放不足；当添加量高于0.5%时，过度切割产生过多小分子肽，反而降低目标活性肽段的含量。

19、进一步地，步骤s4中，所述微生物转谷氨酰胺酶的添加量为所述定向切割肽液中蛋白质量的0.5%-1.5%；交联后肽的异肽键含量为15-25μmol/g。

20、微生物转谷氨酰胺酶催化肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基与赖氨酸残基的ε-氨基发生酰基转移反应，形成ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸异肽键。该异肽键对胃蛋白酶、胰蛋白酶等消化酶具有高度抗性，可显著提高肽的胃肠稳定性。交联程度过低（异肽键小于15μmol/g）时，胃肠稳定性提升不足；交联程度过高（异肽键大于25μmol/g）时，分子量过度增大可能影响肠道吸收效率。

21、进一步地，步骤s5中，所述离心条件为4℃、8000-10000rpm、15-20min；所述微滤膜的孔径为0.22-0.45μm；所述纳滤膜的截留分子量为500da，操作压力为0.6-1.0mpa。

22、进一步地，步骤s6中，所述钙盐为乳酸钙或氯化钙，钙盐添加量以钙离子计为肽质量的5%-15%。

23、肽链中谷氨酸和天冬氨酸残基的羧基作为钙离子配位位点，与钙离子形成可溶性肽-钙络合物，提高钙的生物利用度。钙离子添加量低于5%时，络合不充分，钙利用率提升有限；高于15%时，过量的钙离子可能引发肽链的过度交联聚集，影响产品稳定性。

24、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

25、1.本发明采用牦牛红骨髓与鲟鱼脊索组织按质量比3∶1复配，可同时提供ⅰ型胶原成骨信号和ⅱ型胶原软骨保护，实现硬骨-软骨协同修复。动物实验表明，实施例1的bmd达到0.251g/cm2，显著优于未复配鲟鱼脊索组织的对比例3（0.225g/cm2），证实了复配原料的协同增效作用。

26、2.本发明引入双功能酶膜反应器，通过膜表面固定化碱性蛋白酶与膜孔内包埋胰蛋白酶的空间分区和协同作用，实现了胶原蛋白的连续精准酶解，解决了传统游离酶传质效率低、酶无法重复利用、产物抑制效应明显的问题。

27、3.本发明采用脯氨酸特异性内切酶对胶原蛋白特征序列进行定向切割，特异性释放富含脯氨酸和羟脯氨酸的活性肽段。对比例1显示，未采用定向切割时bmd较实施例1降低9.2%，证实了定向切割对提升成骨活性的关键作用。

28、4.本发明通过微生物转谷氨酰胺酶催化交联形成异肽键，胃肠模拟消化后肽保留率达72.8%，显著高于未交联对照的38.4%，证实了交联修饰对提高口服生物利用度的显著效果。

29、5.本发明通过肽-钙配位络合技术，使肽链羧基与钙离子形成可溶性络合物。对比例4显示，简单物理混合时bmd较实施例1降低16.3%，证实了肽-钙络合对钙吸收的重要促进作用。