一种重组胶原蛋白填充材料及其制备方法和应用与流程

本发明属于凝胶填充材料，具体涉及一种重组胶原蛋白填充材料及其制备方法和应用。

背景技术：

1、随着社会经济发展与生活水平提升，消费者对皮肤抗衰的需求日益迫切，推动了医疗美容领域抗衰产品的快速发展。胶原蛋白作为人体细胞外基质的核心功能成分，在皮肤真皮层干重中占比达70%~80%，凭借其天然生物相容性、生物活性及力学支撑特性，成为医疗美容填充抗衰领域的核心原料。

2、目前已上市的胶原蛋白填充类产品，按原料来源可分为两大类：一类是以双美系列产品为代表的提取类胶原蛋白制品，其原料提取自天然组织，虽保留了部分天然胶原的三螺旋结构及力学特性，但存在免疫原性风险、降解速率快等问题，且制备过程中使用的戊二醛、京尼平等化学交联剂可能引发慢性炎症反应，安全性存疑。另一类是以薇旖美系列产品为代表的重组类胶原蛋白填充剂，通过基因工程技术制备，可有效降低免疫原性风险，但仍存在力学支撑不足、体内存留时间短等缺陷，难以满足长效填充的临床需求。

3、为解决上述技术问题，公开号为cn119101256a的中国发明专利申请公开了一种交联重组胶原蛋白凝胶，通过4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐（dmtmm）激活胶原蛋白分子侧链的羧基，进而与分子内/分子间的氨基发生酰化反应形成肽键，使胶原蛋白分子通过侧链交联构建网络结构。然而，该类基于dmtmm的直接交联技术，在实际应用中常面临力学支撑性弱、体内抗降解能力不足的问题。此外，该交联凝胶为透明体系，由于材料折射率与皮肤组织差异，注射于真皮浅层时易因丁达尔效应呈现蓝色透光外观，影响填充部位的自然度。

4、鉴于现有胶原蛋白填充材料普遍存在力学支撑不足、体内降解过快及没学相容性差等问题，本领域亟需开发一种兼具高力学支撑、长效抗降解和优异美学相容性的重组胶原蛋白填充材料，以满足医疗美容领域对安全长效抗衰产品的临床需求。

技术实现思路

1、本发明旨在克服上述现有技术的不足，提供一种重组胶原蛋白填充材料及其制备方法和应用。该填充材料采用重组胶原蛋白絮凝物和重组胶原蛋白经羧基活化剂交联制成，通过调控重组胶原蛋白絮凝物与重组胶原蛋白的复配比例，可使制备的填充凝胶呈现剪切稀化特性与优异的触变性恢复能力。该填充材料在高剪切条件下黏度显著降低，推注顺畅，便于临床注射操作，可兼顾临床操作便利性与填充效果稳定性。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种重组胶原蛋白填充材料，其特征在于，采用重组胶原蛋白絮凝物和重组胶原蛋白经羧基活化剂交联制成；所述重组胶原蛋白絮凝物是将重组胶原蛋白溶液通过醇沉和梯度盐析制备而成的具有微球-纤维复合结构的絮凝物。

3、上述的一种重组胶原蛋白填充材料，其特征在于，所述重组胶原蛋白絮凝物的制备方法包括：

4、步骤一、将重组胶原蛋白加入ph为7.2~7.4的缓冲溶液中，制成质量分数为0.5%~3.0%的重组胶原蛋白溶液；

5、步骤二、在搅拌条件下，向步骤一中所述重组胶原蛋白溶液中滴加无水乙醇，滴加完成后继续搅拌，得到产物1；

6、步骤三、将步骤二中所获得的产物1经离心，洗涤，烘干，得到产物2；

7、步骤四、对步骤三中所获得的产物2进行梯度盐析，具体过程包括：将产物2以3.0%~5.0%的质量分数分散于总盐浓度为0.05mol/l~0.20mol/l的ph为7.2~7.4的磷酸盐缓冲溶液中，以10r/min~50r/min速率搅拌1h~5h；然后将体系中的总盐浓度提高到0.30mol/l~0.50mol/l，以100r/min~200r/min速率搅拌1h~5h；再将体系中的总盐浓度提高到0.70mol/l~0.90mol/l，搅拌至盐溶解后，静置8h~12h，得到产物3；

8、步骤五、将步骤四中所获得的产物3过滤、洗涤后烘干，得到重组胶原蛋白絮凝物。

9、上述的一种重组胶原蛋白填充材料，其特征在于，步骤一中所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（hepes）缓冲溶液、3-吗啉丙磺酸（mops）缓冲溶液和哌嗪-1,4-二乙磺酸（pipes）缓冲溶液中的任一种；

10、步骤四中提高盐浓度所采用的盐为硫酸铵、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和氯化钠中的一种或几种。

11、上述的一种重组胶原蛋白填充材料，其特征在于，步骤二中搅拌的速率为100r/min~300r/min，无水乙醇与重组胶原蛋白溶液的体积比为1:（1~3），无水乙醇的滴加速度为0.1ml/min~0.5ml/min，滴加完成后，继续以100r/min~300r/min速率搅拌1h~5h。

12、上述的一种重组胶原蛋白填充材料，其特征在于，步骤三的离心速率为3000r/min~5000r/min，离心时间为1min~10min。

13、进一步地，本发明提供了一种制备上述重组胶原蛋白填充材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：

14、将羧基活化剂加入ph为7.2~7.4的缓冲溶液中溶解，得到羧基活化剂溶液；

15、将重组胶原蛋白絮凝物和重组胶原蛋白一同加入所述羧基活化剂溶液中，搅拌均匀得到混合体系，然后将所述混合体系静置，得到凝胶；所述混合体系中重组胶原蛋白的质量分数为1.0%~10.0%，重组胶原蛋白絮凝物的质量分数为1.0%~50.0%；

16、对所述凝胶进行透析处理，再进行灌装，灭菌，得到重组胶原蛋白填充材料。

17、上述的方法，其特征在于，所述羧基活化剂选自以下缩合体系中的至少一种：（1）碳二亚胺类缩合剂，或碳二亚胺类缩合剂与n-羟基酰亚胺类稳定剂和/或n-羟基三唑类稳定剂的组合；（2）三嗪类缩合剂。

18、上述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（hepes）缓冲溶液、3-吗啉丙磺酸（mops）缓冲溶液和哌嗪-1,4-二乙磺酸（pipes）缓冲溶液中的任一种。

19、上述的方法，其特征在于，所述搅拌的速率为100r/min~500r/min，搅拌的时间为10min~30min，静置的时间为2h~24h；所述重组胶原蛋白和重组胶原蛋白絮凝物的侧链羧基与羧基活化剂的摩尔比为（0.1~1）:1。

20、更进一步地，本发明提供了一种上述重组胶原蛋白填充材料在制备软组织填充材料中的应用。

21、本发明与现有技术相比具有以下优点：

22、1、本发明的重组胶原蛋白填充材料采用重组胶原蛋白絮凝物和重组胶原蛋白经羧基活化剂交联制成，通过调控重组胶原蛋白絮凝物与重组胶原蛋白的复配比例，使制备的填充凝胶呈现剪切稀化特性与优异的触变性恢复能力。其中，本发明制备的填充材料触变性恢复率为92.9%~95.8%，表明材料在注射后能够迅速恢复黏弹状态，有利于在填充部位原位塑形并减少移位风险。剪切稀化倍数为53.89~149.71，表明材料在高剪切条件下黏度显著降低，推注顺畅，便于临床注射操作，可兼顾临床操作便利性与填充效果稳定性。

23、2、本发明制备的重组胶原蛋白填充材料在450nm波长下的透光率为5.7%~8.5%。有效避免传统纳米级透明胶原蛋白凝胶因丁达尔效应所致的填充部位泛蓝问题，提升填充效果的自然度与美观度。

24、3、本发明所制备的重组胶原蛋白填充材料的力学性能与抗降解稳定性有所提升。经动态流变学检测，该填充材料的储能模量为320.52pa~580.74pa；体外胶原酶降解实验结果表明，实施例的填充有效时间为13天以上；体内降解实验结果显示，实施例在注射6个月后注射部位仍保持轻微隆起，masson染色结果显示，注射部位组织中可见凝胶残留且胶原纤维较注射初期有所增加。

25、4、本发明通过醇沉和梯度盐析工艺制备重组胶原蛋白絮凝物，其比表面积为0.27~0.37m2/g，中位粒径为23μm~58μm；而改变制备工艺条件后，所得絮凝物比表面积仅为0.04~0.19m2/g。基于本发明所述絮凝物与重组胶原蛋白交联构建的填充材料，其储能模量与填充有效时间（体外加速测试）均优于对比试验组，表明在本发明所述工艺条件下，絮凝物的比表面积和粒径分布与填充材料的力学性能及抗降解性能相关。

26、下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。