一种HBV整合位点的优势克隆识别方法与流程

本发明属于生物信息学、基因组学以及肿瘤基因组学，具体涉及乙型肝炎病毒（hbv）整合位点的数据分析与肝细胞癌（hcc）相关优势克隆的识别方法。

背景技术：

1、乙型肝炎病毒（hepatitis b virus，hbv）感染是肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，hcc）发生发展的重要危险因素之一。hbv dna可整合进入宿主肝细胞基因组，通过影响癌相关基因表达、诱导基因组不稳定、改变染色体结构或形成病毒-宿主融合序列等方式参与肝癌发生发展过程。已有研究表明，hbv整合可发生于肿瘤组织和癌旁非肿瘤组织中，且部分整合事件与癌基因激活、克隆扩增或肿瘤进展相关。

2、随着高通量测序技术的发展，hbv-human整合位点可通过全基因组测序、靶向捕获测序、转录组测序或专门的病毒整合检测流程进行识别。现有方法和工具如hivid、virus-clip和hivid2等，能够定位病毒-宿主整合断点并注释其对应的宿主基因区域。现有研究进一步发现，hbv整合在hcc中并非完全随机分布，部分整合事件可反复发生于tert、kmt2b/mll4、ccne1等癌相关基因或调控区域。若某一整合事件参与肿瘤发生或促进肿瘤细胞生长，则携带该整合事件的细胞可能发生克隆扩增，这种扩增在整合位点（integrationsite，is）层面可表现为该整合位点支持reads数及样本内占比升高，并形成is层面的优势克隆结构。同时，癌旁非肿瘤组织中也可检测到hbv整合事件，且可能存在一定程度的reads集中现象。因此，仅依据某一整合事件是否存在、是否位于癌相关基因，或单一主位点支持reads数是否较高，并不能稳定地区分肿瘤相关整合优势克隆与癌旁非肿瘤背景中的普通整合波动。现有hbv整合位点分析流程难以从大量整合事件中客观识别潜在肿瘤相关is层面优势克隆，且容易将癌旁非肿瘤背景中的整合波动误判为肿瘤相关信号。因此，如何从大量整合事件中识别可能与肿瘤发生发展相关的整合事件是目前亟需解决的问题。

技术实现思路

1、本发明旨在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种基于癌旁非肿瘤背景分布比较的hbv整合位点的优势克隆识别方法。本发明通过pa背景分布建模与噪声控制、多指标联合统计判定和pa留一假阳验证，识别相对于非肿瘤背景显著偏离的is层面优势克隆，从而为筛选潜在肿瘤相关整合事件、主整合位点和候选整合基因提供依据，能够有效降低非肿瘤背景整合波动造成的误判。

2、因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种hbv整合位点优势克隆的识别方法，所述识别方法包括下述步骤：s1：分别获取待测样本、参照样本的hbv-human整合位点数据，并对各样本内的整合位点进行合并，获得样本级整合位点集合；s2：基于所述样本级整合位点集合，计算克隆结构指标；s3：以所述参照样本的克隆结构指标构建对照背景集，并将所述待测样本的各克隆结构指标分别与所述对照背景集中同一克隆结构指标进行经验分布比较，获得各克隆结构指标的经验显著性度量；s4：将至少两个所述经验显著性度量进行联合显著性检验，获得联合显著性度量；s5：基于所述联合显著性度量是否满足预设显著性条件，判断所述待测样本是否存在hbv整合优势克隆，并输出判断结果及对应的主整合位点信息；其中，所述克隆结构指标包括表征主整合位点reads支配程度的指标和表征整合reads分布不均衡程度的指标。

3、在一些实施例中，所述待测样本为肿瘤样本，所述参照样本为癌旁非肿瘤样本。

4、在一些实施例中，所述表征主整合位点reads支配程度的指标包括主整合位点reads占比和/或前五整合位点累积reads占比。

5、在一些实施例中，所述表征整合reads分布不均衡程度的指标包括整合reads分布不均衡程度的gini指数、整合reads分布均匀程度的均匀度指数、整合reads集中度指数、整合reads多样性指数和有效克隆数中的一种或多种。

6、在一些实施例中，所述表征主整合位点reads支配程度的指标为主整合位点reads占比和前五整合位点累积reads占比，所述表征整合reads分布不均衡程度的指标为整合reads分布不均衡程度的gini指数和整合reads分布均匀程度的均匀度指数。

7、在一些实施例中，所述hbv-human整合位点数据至少包含样本编号、染色体、整合位置、基因注释和支持reads数。

8、在一些实施例中，所述识别方法还包括下述步骤：在步骤s1中，同步获取所述参照样本的样本级质控数据，并基于所述质控数据对所述参照样本进行质控清洗；其中，所述质控数据至少包含测序质量、去重后reads数、总整合reads数和整合位点数量。

9、在一些实施例中，所述识别方法还包括下述步骤：在步骤s1中，在进行所述合并前，对所述hbv-human整合位点数据进行初步过滤，仅保留支持reads数＞第一预设阈值的整合位点数据。

10、在一些实施例中，所述质控清洗的条件包括下述至少一种：（1）测序质量≥第二预设阈值；（2）去重后reads数≥参照样本分布的预设分位数；（3）总整合reads数≥第三预设阈值；（4）整合位点数量≥第四预设阈值；（5）剔除整合位点数量≤1，且主整合位点reads占比≥0.95的极端单点型样本。

11、在一些实施例中，所述待测样本的数量＞1时，所述识别方法还包括下述步骤：在步骤s4中，对所述联合显著性度量进行多重假设检验校正，获得校正后的显著性度量。

12、在一些实施例中，所述主整合位点信息包括主整合位点及其对应的宿主基因。

13、在一些实施例中，所述识别方法还包括下述步骤：查询hbv整合数据库，获取所述宿主基因的公共肿瘤样本整合支持次数和/或公共非肿瘤样本整合支持次数。

14、在一些实施例中，所述预设显著性条件的判断包括以下分级判定规则：高置信度同时满足以下条件：联合错误发现率小于0.01，主位点占比与癌旁非肿瘤样本中位数的比值大于2.0，且具有配对支持；中置信度满足以下条件：联合错误发现率小于0.05，且主位点占比与癌旁非肿瘤样本中位数的比值大于1。

15、在本发明的第二方面，本发明提出一种hbv整合位点优势克隆识别的系统，所述系统包括：数据获取模块，配置为用于分别获取待测样本和参照样本的hbv-human整合位点数据；位点处理模块，配置为用于对各样本内的整合位点进行合并，获得样本级整合位点集合，并基于所述样本级整合位点集合计算克隆结构指标；背景比较模块，配置为用于以所述参照样本的克隆结构指标构建对照背景集，并将所述待测样本的各克隆结构指标分别与所述对照背景集中同一克隆结构指标进行经验分布比较，获得各克隆结构指标的经验显著性度量；联合检验模块，配置为用于将至少两个所述经验显著性度量进行联合显著性检验，获得联合显著性度量；判定输出模块，配置为用于基于所述联合显著性度量是否满足预设显著性条件，判断所述待测样本是否存在hbv整合优势克隆，并输出判断结果及对应的主整合位点信息；其中，所述克隆结构指标包括表征主整合位点reads支配程度的指标和表征整合reads分布不均衡程度的指标。

16、在一些实施例中，所述待测样本为肿瘤样本，所述参照样本为癌旁非肿瘤样本。

17、在一些实施例中，所述表征主整合位点reads支配程度的指标包括主整合位点reads占比和/或前五整合位点累积reads占比。

18、在一些实施例中，所述表征整合reads分布不均衡程度的指标包括整合reads分布不均衡程度的gini指数、整合reads分布均匀程度的均匀度指数、整合reads集中度指数、整合reads多样性指数和有效克隆数中的一种或多种。

19、在一些实施例中，所述表征主整合位点reads支配程度的指标为主整合位点reads占比和前五整合位点累积reads占比，所述表征整合reads分布不均衡程度的指标为整合reads分布不均衡程度的gini指数和整合reads分布均匀程度的均匀度指数。

20、在一些实施例中，所述hbv-human整合位点数据至少包含样本编号、染色体、整合位置、基因注释和支持reads数。

21、在一些实施例中，所述位点处理模块还配置为用于执行下述步骤：获取所述参照样本的样本级质控数据，并基于所述质控数据对所述参照样本进行质控清洗；其中，所述质控数据至少包含测序质量、去重后reads数、总整合reads数和整合位点数量。

22、在一些实施例中，所述背景比较模块还配置为用于执行下述步骤：在进行所述合并前，对所述hbv-human整合位点数据进行初步过滤，仅保留支持reads数＞第一预设阈值的整合位点数据。

23、在一些实施例中，所述质控清洗的条件包括下述至少一种：（1）测序质量≥第二预设阈值；（2）去重后reads数≥参照样本分布的预设分位数；（3）总整合reads数≥第三预设阈值；（4）整合位点数量≥第四预设阈值；（5）剔除整合位点数量≤1，且主整合位点reads占比≥0.95的极端单点型样本。

24、在一些实施例中，所述待测样本的数量＞1时，所述联合检验模块还配置为用于执行下述步骤：对所述联合显著性度量进行多重假设检验校正，获得校正后的显著性度量。

25、在一些实施例中，所述主整合位点信息包括主整合位点及其对应的宿主基因。

26、在一些实施例中，所述系统还包括注释模块，配置为用于查询hbv整合数据库，获取所述宿主基因的公共肿瘤样本整合支持次数和/或公共非肿瘤样本整合支持次数。

27、在一些实施例中，所述预设显著性条件的判断包括以下分级判定规则：高置信度是指同时满足以下条件：联合错误发现率小于0.01，主位点占比与癌旁非肿瘤样本中位数的比值大于2.0，且具有配对支持；中置信度是指满足以下条件：联合错误发现率小于0.05，且主位点占比与癌旁非肿瘤样本中位数的比值大于1。

28、在本发明的第三方面，本发明提出了一种计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现第一方面所述的识别方法。

29、与现有技术相比，本发明取得的有益技术效果：

30、1、引入癌旁非肿瘤背景作为参照，有效降低误判。本发明通过构建癌旁非肿瘤样本（pa样本）背景经验分布，将待测肿瘤样本的克隆结构指标与之比较，能够清晰区分真正的肿瘤相关优势克隆与背景中的偶然整合波动，显著减少假阳性。

31、2、多指标联合统计判定，克服单一阈值局限。本发明采用top1_ratio、gini指数（gini_index）、均匀度指数（evenness）等多个克隆结构指标，并构建fisher型联合统计量及多重校正，避免了依赖单一指标或固定阈值导致的不稳定和批次偏倚，提高了判定结果的稳健性和客观性。

32、3、提供分层分类与完整可解释输出。本发明输出高、中、低置信度及未显著四个样本层级，同时给出主整合位点、主整合基因、关键指标值和公共数据注释，并结合pa留一验证评估假阳率，实现了从样本级优势克隆判定到基因级功能解释的完整证据链，便于后续验证和筛选。

33、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。