安肾聚精汤治疗糖尿病肾病的靶点筛选方法及应用

本发明属于生物医药，特别涉及安肾聚精汤治疗糖尿病肾病的靶点筛选方法及应用。

背景技术：

1、目前，糖尿病肾病（diabetic kidney disease，dkd）是我国慢性肾脏病及终末期肾病的主要病因，中药治疗dkd的研究近年来取得显著进展，其“多成分-多靶点-多途径”的作用特点与dkd复杂的发病机制高度契合。安肾聚精汤是国医大师皮持衡教授根据多年临床治疗蛋白尿所拟经验方，载于《皮持衡肾病学术思想与临证经验》，在长期临床实践和治疗观察中用于延缓dkd进展已取得一定成效，药物组成包括党参、黄芪、丹参、芡实、鸟不宿、桑螵蛸、海螵蛸、五味子、红花，该方基于五大关键病机立法，重用党参、黄芪；以益气培元、固肾化瘀为主，兼祛湿排毒；行虚实兼顾、标本同治，有效减少dkd患者蛋白尿。然而，该复方起效的物质基础及作用靶点尚未明确，亟待建立科学、系统的筛选方法。

2、现阶段，在中药复方靶点筛选方面，现有技术存在以下不足。其一，靶点预测缺乏体内暴露与组织驻留的验证。当前广泛应用的网络药理学方法多依赖数据库进行反向对接，虽能高通量产出候选靶点，但未充分考虑药物在体内的真实过程，即成分是否入血以及是否能够靶向分布于肾组织。由于缺乏对“入血成分”与“肾组织驻留成分”的双重筛选，预测结果的假阳性率较高，靶点验证的生物学可靠性有限。其二，物质基础与效应靶点的解析存在脱节。血清药物化学主要用于分析体内暴露成分，但难以确定这些成分是否真正到达靶器官肾脏；而靶向肾组织的药物化学研究相对匮乏，难以建立“入肾成分-作用靶点”的直接映射关系。由于缺乏对靶部位真实药物化学组的系统分析，现有技术在解析多靶点协同机制方面存在明显局限，也难以对药物成分配比提供充分的实验依据。

3、针对现有技术缺陷，本发明提供安肾聚精汤治疗糖尿病肾病的靶点筛选方法，结合血清、靶向肾组织药物化学和分子对接技术，系统解析安肾聚精汤治疗糖尿病肾病的物质基础，解决中药复方多靶点机制解析困难、靶点验证可靠性低及药物成分配比缺乏科学依据的问题，为其临床应用和进一步开发提供科学依据。

技术实现思路

1、本发明提出安肾聚精汤治疗糖尿病肾病的靶点筛选方法及应用，解决了中药复方多靶点机制解析困难、靶点验证可靠性低及药物成分配比缺乏科学依据的问题。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、安肾聚精汤治疗糖尿病肾病的靶点筛选方法，包括构建“药物-入血成分-靶点-机制通路”网络，确定核心入血、入靶成分共9个，包括丹酚酸a、党参炔苷、丹酚酸h、丹参酮、五味子甲素、红车轴草素-7-o-吡喃葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷、绿原酸、芹菜素；确定关键核心靶点共7个，包括mmp9、casp3、mapk1、hsp90aa1、il6、akt1、tnf；确定核心通路为脂质与动脉粥样硬化、白细胞介素-17信号通路（il-17信号通路）、肿瘤坏死因子信号通路（tnf信号通路）、糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体信号通路（age-rage信号通路）。

4、通过上述技术方案，利用cytoscape 3.10.0软件构建“药物-入血成分-靶点-机制通路”网络，并使用该软件中的cytonca模块分析得出9个核心入血、入靶成分及7个关键核心靶点；同时将获得的37个潜在关键靶点导入david数据库进行kegg信号通路分析，分析排名前5的通路（排除癌症机制）得到4条核心通路。与通过搜集相关公共数据库相比，“药物-入血成分-靶点-机制通路”网络能够解决中药复方多靶点机制解析困难、靶点验证可靠性低及药物成分配比缺乏科学依据的问题。

5、可选的，还包括入血、入靶成分鉴定，其中，对安肾聚精汤的入血、入靶成分进行鉴定，共获得155个入血、入靶成分的结构信息。

6、通过上述技术方案，利用xcalibur定性分析软件，分析得到实测的化合物精确一级分子量和二级碎片离子信息，并将一级分子量和二级碎片离子信息与自建或商业中药数据库进行比对，从而进行定性。

7、可选的，还包括靶点预测与筛选，其中，通过获得的入血成分的代谢产物结构，预测活性靶点，结合数据库筛选疾病靶点，获取药物靶点与疾病靶点的交集，获得安肾聚精汤治疗糖尿病肾病的潜在共同作用靶点；其中，药物靶点为592（382+210）个，疾病靶点为4724（4514+210）个，潜在共同作用靶点为210个。

8、通过上述技术方案，通过tcms数据库、swiss target prediction数据库和sea数据库对安肾聚精汤155个成分入血、入靶成分进行成分靶点的获取，删除重复值，从而确定出药物靶点为592（382+210）个。在genecards、omim、ttd、drugbank、pharmgkb和disgenet等数据库中，使用“糖尿病”、“肾病”、“慢性肾病”和“糖尿病肾病”等特定关键词进行了全面检索。为消除重复条目，将这些数据库的数据进行合并，从而获得相关疾病靶点为4724（4514+210）个。通过生物信息学云平台的维恩图，筛选出安肾聚精汤与糖尿病肾病重合的相关靶点，即为潜在共同作用靶点为210个。

9、可选的，还包括核心靶点分析，将潜在共同作用靶点进行蛋白质相互作用分析，构建“药物-入血成分-靶点-机制通路”网络，筛选出度值>69.15、紧密中心性>0.0028、中介中心性>140.12的潜在关键靶点；其中，潜在关键靶点共37个，分别为nfe2l2、hmox1、nqo1、mapk1、egfr、casp3、sox2、gsk3b、hsp90aa1、ptgs2、jun、hsp90ab1、mmp9、keap1、bcl2、il6、tnf、gpx4、braf、akt1、pparg、mapk3、tgfb1、il2、ifng、app、fos、sqstm1、gclc、creb1、cdkn2a、ccl2、apoe、il1b、icam1、cxcl8、pik3ca。

10、通过上述技术方案，利用cytoscape 3.10.3软件中的cytonca模块，分别获取度值、紧密中心性和中介中心性各项数值下的中位数，即分别为69.15、0.0028和140.12，从而确定潜在关键靶点。

11、可选的，核心入血、入靶成分和关键核心靶点的筛选条件为：度值>24、紧密中心性>0.0431、中介中心性>0.3700。

12、通过上述技术方案，利用cytoscape 3.10.3软件中的cytonca模块，分别获取度值、紧密中心性和中介中心性各项数值下的中位数，即分别为24、0.0431和0.3700，从而确定核心入血、入靶成分和关键核心靶点。

13、可选的，核心通路确定的方式为：go功能富集分析和kegg信号通路分析，其中，go功能富集分析包括生物学过程、细胞组分和分子功能，其中，生物学过程涉及一氧化氮生物合成过程的正向调控、rna聚合酶ii对转录的正向调控、对外源物刺激的反应、基因表达的正向调控、细胞外信号调节激酶1和2级联反应的正向调控（erk1和erk2级联反应的正向调控）；细胞组分涉及胞质溶胶、蛋白质复合物、线粒体、内质网腔、纤毛基体；分子功能涉及相同蛋白质结合、酶结合、泛素蛋白连接酶结合、聚合酶ii特异性dna结合转录因子结合、蛋白质结合。

14、可选的，将获得的核心入血、入靶成分与核心靶点进行分子对接，计算结合能s值和rmsd值，筛选出高亲和力成分。

15、采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：

16、本发明通过整合血清和入靶药物化学、网络药理学、分子对接验证，系统性地揭示了安肾聚精汤治疗糖尿病肾病的作用机制。该方法精准鉴定了9个核心入血、入靶成分，再通过靶点预测与筛选确定了7个安肾聚精汤治疗糖尿病肾病的潜在核心靶点，并构建了“药物-入血成分-靶点-机制通路”网络，发现脂质与动脉粥样硬化、白细胞介素-17信号通路（il-17信号通路）、肿瘤坏死因子信号通路（tnf信号通路）、糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体信号通路（age-rage信号通路）是安肾聚精汤治疗糖尿病肾病的核心通路。分子对接验证筛选出5个具有高亲和力的活性成分，毛蕊异黄酮苷、红车轴草素-7-o-吡喃葡萄糖苷、芹菜素、丹酚酸a、丹酚酸h，本发明不仅阐明了中药复方多靶点、多通路的协同作用机制，为安肾聚精汤治疗糖尿病肾病提供了现代科学解释，还为中药质量控制和临床联合用药方案的优化提供了重要依据。

17、相比传统研究方法，本发明显著提高了中药活性成分筛选的效率和准确性，建立了从化学表征到机制验证的完整研究范式，并针对核心靶点，筛选或设计能够增强或调节其活性的新型化学成分，与安肾聚精汤现有成分进行合理配伍，优化药物组成。根据关键信号通路，寻找能够协同调控该通路的其他药物或生物活性物质，设计联合用药方案，提高药物治疗效果的应用。