一种靶向巨噬细胞的MS4A7mRNA脂质纳米递送系统及其抗肿瘤应用

本发明涉及生物医药，具体涉及一种靶向巨噬细胞的ms4a7 mrna脂质纳米递送系统及其抗肿瘤应用。

背景技术：

1、免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, icis）已成为多种恶性肿瘤治疗的重要手段，但其在肝细胞癌等实体瘤中的客观缓解率仍远未满足临床需求。深入研究表明，肿瘤微环境（tumor microenvironment, tme）中效应性cd8+ t细胞浸润不足、功能耗竭以及髓系免疫细胞亚群（尤其是巨噬细胞）的稳态失衡，是导致免疫治疗原发性或获得性耐药的核心机制之一。

2、巨噬细胞作为tme中丰度最高的髓系细胞，其功能表型对肿瘤免疫应答具有决定性影响。通过干预巨噬细胞的极化状态，恢复其促炎性和抗肿瘤活性，已被证实可有效促进cd8+ t细胞的募集与功能活化，从而提升ici疗法的响应率。近期，多队列转录组学与单细胞测序分析揭示，ms4a7（一种巨噬细胞相关跨膜蛋白）阳性巨噬细胞亚群的富集与免疫治疗临床获益及患者良好预后呈显著正相关。在荷瘤动物模型中，增强巨噬细胞ms4a7的异位表达已初步展现出重塑tme和增强抗肿瘤免疫的潜力，提示ms4a7是干预tams功能、逆转免疫抑制的关键靶点。

3、与此同时，信使rna（mrna）药物因具有不整合至宿主基因组、表达时效可控、生产工艺快速且序列设计灵活等优势，正逐渐成为肿瘤免疫治疗的前沿策略。脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles, lnps）作为目前最成熟的mrna递送载体，可有效保护mrna免受核酸酶降解，并促进其胞内递送和翻译表达。然而，常规lnp制剂对特定免疫细胞亚群的选择性靶向能力有限，静脉给药后易在肝脏kupffer细胞及脾脏等网状内皮系统中非特异性蓄积，不仅导致靶部位有效剂量不足，还增加了非靶组织暴露及相关毒性风险，严重制约了其临床转化与精准治疗应用。

4、鉴于现有技术存在的缺陷，亟需一种能够将ms4a7 mrna高效、稳定且选择性地递送至巨噬细胞的纳米递送系统，实现对巨噬细胞功能的精准调控与重编程，从而有效增强cd8+ t细胞抗肿瘤免疫应答。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供一种靶向巨噬细胞的ms4a7 mrna脂质纳米递送系统及其抗肿瘤应用，用于实现对巨噬细胞功能的精准调控与重编程，从而有效增强cd8+ t细胞抗肿瘤免疫应答，改善肿瘤免疫治疗的低响应率问题。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种靶向巨噬细胞的ms4a7 mrna脂质纳米递送系统，包括ms4a7 mrna和脂质纳米颗粒载体；

3、ms4a7 mrna自5'端至3'端依次包含t7启动子序列、5'非翻译区、ms4a7蛋白编码序列、3'非翻译区以及多聚腺苷酸结合蛋白a尾结构；

4、脂质纳米颗粒载体负载所述ms4a7 mrna，且脂质纳米颗粒载体表面修饰有靶向巨噬细胞的甘露糖或甘露糖-peg-脂质。

5、进一步，所述5'非翻译区包含kozak序列gccacc；所述3'非翻译区为β-球蛋白3'非翻译区；所述多聚腺苷酸结合蛋白a尾的长度为100～120bp。

6、进一步，所述ms4a7 mrna采用n1-甲基假尿苷替代尿苷三磷酸进行修饰，和/或采用cleancap、arca或cap 1结构进行5'端加帽修饰。

7、进一步，所述脂质纳米颗粒载体包含可电离阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和peg化脂质。

8、进一步，所述可电离阳离子脂质为dlin-mc3-dma，所述辅助磷脂为dspc，所述peg化脂质为dmg-peg2000或dspe-peg2000。

9、进一步，所述dlin-mc3-dma、dspc、胆固醇与peg化脂质的摩尔比为50：10：38.5：1.5。

10、进一步，所述ms4a7 mrna的体外转录模板构建方法，包括以下步骤：

11、s1、分别扩增获得三个功能片段：片段1包含t7启动子、5'非翻译区及ms4a7蛋白编码序列；片段2包含3'非翻译区；片段3包含多聚腺苷酸结合蛋白a尾序列，各相邻片段之间设计有20～25bp的同源重叠序列；

12、s2、采用两步重叠延伸pcr法拼接上述三个片段：首先将片段2与片段3进行融合，获得3'utr-多聚腺苷酸结合蛋白a融合产物；然后将片段1与所述3'utr-多聚腺苷酸结合蛋白a融合产物进行融合，获得全长线性dna模板；

13、s3、对所得全长线性dna模板进行鉴定和序列验证。

14、进一步，所述ms4a7 mrna的体外转录模板合成方法，包括以下步骤：

15、以全长线性dna模板为模板，采用t7 rna聚合酶进行体外转录，其中所述体外转录体系中包含n1-甲基假尿苷三磷酸替代尿苷三磷酸，转录后对所得mrna进行5'端加帽修饰和纯化。

16、进一步，所述靶向巨噬细胞的ms4a7 mrna脂质纳米递送系统的制备方法，包括以下步骤：a、将可电离阳离子脂质dlin-mc3-dma、辅助磷脂dspc、胆固醇及peg化脂质溶解于无水乙醇中，作为有机相；

17、b、将制备得到的ms4a7 mrna溶解于柠檬酸钠缓冲液中，作为水相；

18、c、将所述水相与所述有机相混合，使脂质与mrna自组装形成包载ms4a7 mrna的脂质纳米颗粒；

19、d、将所得脂质纳米颗粒进行缓冲液置换至生理ph环境，并去除有机溶剂及游离组分；

20、e、采用后插入法，将甘露糖-peg2000-dspe插入所述脂质纳米颗粒表面，获得甘露糖功能化的靶向巨噬细胞ms4a7 mrna脂质纳米递送系统。

21、进一步，所述水相与有机相的混合采用微流控混合法或乙醇注入法；所述缓冲液置换采用透析、超滤、凝胶柱层析或切向流过滤进行。

22、进一步，所述甘露糖-peg2000-dspe的添加量占总脂质摩尔数的1%～3%。

23、进一步，还包括巨噬细胞膜仿生纳米囊泡，所述ms4a7 mrna装载于所述巨噬细胞膜仿生纳米囊泡内部，所述巨噬细胞膜仿生纳米囊泡表面修饰有甘露糖或甘露糖-peg-脂质。

24、采用上述方案有以下有益效果：

25、1、本方案，通过引入甘露糖受体介导的主动靶向机制，使ms4a7 mrna在巨噬细胞中的摄取效率显著提高，相较于未修饰lnp体系，巨噬细胞平均荧光摄取信号（mfi）明显增强，同时在非巨噬细胞（如肝细胞aml12）中的非特异性摄取显著降低，表现出更优的细胞选择性。此外，本发明构建的ms4a7 mrna经utr优化及m1ψ核苷修饰后，其在巨噬细胞中的蛋白表达水平显著提高，并可实现稳定、持续的功能性表达。

26、2、本方案，能够显著重塑肿瘤免疫微环境，经ms4a7 mrna-lnp处理后，肿瘤组织中ms4a7阳性巨噬细胞比例显著增加，同时cd8+t细胞浸润显著增强，其功能活化水平明显提高，表现为ifn-γ+cd8+t细胞及tnf-α+cd8+t细胞比例显著上升。上述免疫增强效应进一步导致肿瘤细胞增殖水平下降（ki67表达降低）及肿瘤负荷显著减少（生物发光信号及瘤重均明显下降）。

27、3、本方案，与现有单纯免疫检查点抑制剂或常规mrna递送体系相比，本发明单药即可显著抑制原位肝癌模型中肿瘤生长，并延长动物生存时间。在联合治疗方面，本发明与抗pd-l1抗体联用可进一步增强抗肿瘤免疫应答，使cd8+t细胞浸润及功能活性进一步提升，并表现出明显优于单药的肿瘤抑制效果；在进一步联合仑伐替尼的三联治疗方案中，可实现更强的肿瘤负荷降低及生存获益提升，显示出显著的协同增敏作用。

28、4、与现有技术相比，传统mrna-lnp体系主要存在靶向性不足、表达效率有限及免疫微环境调控单一等问题，难以有效激活巨噬细胞–t细胞轴的协同抗肿瘤效应。本方案通过构建“甘露糖靶向递送+ms4a7功能性重编程+mrna表达优化”三位一体策略，实现了对肿瘤相关巨噬细胞的精准调控，从而系统性增强抗肿瘤免疫反应。

29、5、本发明所采用的mrna-lnp体系具有制备工艺成熟、可规模化生产、成本相对可控及可模块化替换治疗靶点等优势，具备良好的产业转化基础。该技术可用于肝癌及多种实体瘤的免疫治疗增敏，提高免疫检查点抑制剂的总体应答率，降低耐药发生风险，从而提升患者生存获益，具有重要的临床应用价值和广阔的市场前景。