一种长效靶向富勒醇鼻咽制剂及其制备方法和应用

本发明属于纳米递药，更具体地，涉及一种长效靶向富勒醇鼻咽制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、鼻咽癌在我国南方和东南亚地区具有较高的发病率。由于病灶深在且紧邻颅底、脑干，放射治疗被视为根治的首选方案。然而，高能辐射在杀灭肿瘤细胞的同时也破坏局部微血管和基质，触发活性氧自由基爆发，最终导致鼻腔、鼻咽、口咽乃至下咽出现软组织坏死。文献报道，单次放疗后坏死发生率可达3-5%，再次放疗后可升至40%以上。病灶多在放疗结束后6个月至数年内显现，可进展为难愈溃疡、顽固感染、颅底骨坏死，甚至导致大血管破裂，严重危及生命。

2、目前临床治疗主要包括鼻腔冲洗清除坏死组织、抗生素控制感染、糖皮质激素鼻喷雾抑制炎症、高压氧治疗改善血供以及内镜下清创等综合手段，但整体疗效有限，治愈率仅13.4%-28.6%。现有方法存在以下不足：药效维持时间短，冲洗易洗脱新生肉芽且操作繁琐，激素喷雾仅能短期抑炎2-4小时且长期使用可能抑制黏膜免疫，高压氧需20-40次疗程费用高昂依从性差，缺乏持续抗氧化、促血管新生和基质重塑的综合疗效。

3、富勒烯类碳纳米材料因笼状共轭结构具有优异的自由基清除能力，一直是辐射损伤防治研究的热点。然而，现有富勒烯类制剂在鼻咽放射性坏死治疗方面存在以下不足：

4、专利cn115463094b报道的富勒醇蒙脱石软膏主要设计为外涂胃肠黏膜，粒径为百纳米级（200-500 nm），给药方式与鼻咽场景差异较大，且释放速度快，药效维持时间短。

5、专利cn111265547a公开的富勒烯消毒喷雾以杀菌消毒为主要功能，缺乏血管重建与基质修复支持，未载入促修复生长因子。

6、专利us10842738b1提及的c60姜黄素鼻喷剂用于呼吸道炎症，但c60载体容量相对有限，协同递送大分子修复因子的能力受限，且未在放射损伤模型中验证疗效。

7、综合上述现有技术，当前富勒烯类制剂在鼻咽放射性坏死治疗方面主要存在三点技术问题：①释放过程不可控，药效难以长期维持；②功能偏单一，以抗氧化或杀菌为主，缺乏血管重建与基质修复支持；③给药形式尚未针对深在鼻咽黏膜进行优化，缺乏靶向性。

8、因此，亟需开发一种既能长效控释富勒醇清除自由基，又可协同递送修复因子促进组织再生，并具备鼻黏膜靶向黏附特性的新型制剂，以解决现有鼻咽制剂在鼻咽处用药存在药效短暂、缺乏血管重建与基质修复支持、靶向性差的技术问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种长效靶向富勒醇鼻咽制剂及其制备方法和应用，由此解决现有鼻咽制剂在鼻咽处用药存在药效短暂、缺乏血管重建与基质修复支持、靶向性差的技术问题。

2、为实现上述目的，按照本发明的第一个方面，提供了一种长效靶向富勒醇鼻咽制剂，所述鼻咽制剂的活性成分包含三层核壳结构纳米粒，由内至外依次为富勒醇纳米核、含生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物中间层和透明质酸外层，所述富勒醇纳米核指的是作为核心的纳米尺度的富勒醇。

3、进一步地，所述三层核壳结构纳米粒的粒径为150 nm-220 nm，富勒醇纳米核的粒径为130 nm -160 nm，含生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物中间层的厚度为10 nm -30nm，透明质酸外层的厚度为10 nm -30 nm。

4、进一步地，所述含生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物中间层中生长因子为表皮生长因子egf、血管内皮生长因子vegf中的任意一种或其组合，生长因子的质量为三层核壳结构纳米粒总质量的0.1%-5%，生长因子的活性保持率≥90%；所述含生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物中间层中乳酸与羟基乙酸的摩尔比为3:2-4:1。

5、进一步地，所述富勒醇纳米核、含生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物中间层和透明质酸外层质量比为1:(0.8-2):(0.3-1.2)。

6、按照本发明的第二方面，提供了一种长效靶向富勒醇鼻咽制剂的制备方法，包括如下步骤：

7、（1）将富勒烯溶于芳香类溶剂，然后与相转移催化剂和碱性溶液混合，使富勒烯发生羟基化反应，得到纳米尺度的富勒醇作为富勒醇纳米核；

8、（2）采用微流控闪速沉淀工艺，将含生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物有机溶剂和富勒醇纳米核的醇溶液瞬时混合，形成包裹富勒醇纳米核的含生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物中间层；

9、（3）在缓冲液中，使用偶联剂活化含生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物中间层分子链末端的羧基后，加入透明质酸，羧基与透明质酸的羟基或氨基形成共价键，完成透明质酸外层的稳定接枝，得到三层核壳结构纳米粒，作为鼻咽制剂的活性成分。

10、进一步地，所述步骤（2）包括：

11、将含生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物有机溶剂作为油相，有机溶剂为二氯甲烷或氯仿，将富勒醇纳米核的醇溶液作为醇相，醇溶液为乙醇或者甲醇，将去离子水作为水相，油相、醇相、水相的体积比为1:(1-2):(8-12)，油相、醇相、水相的流速比为1:(0.8-1.2):(8-12)，微流控芯片通道宽度为100 µm -200 µm，总流速为40 ml/min -600 ml/min，采用微流控闪速沉淀工艺，将油相、醇相和水相瞬时混合，形成包裹富勒醇纳米核的含生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物中间层。

12、进一步地，所述步骤（1）中羟基化反应的反应温度为90-110 ℃，反应时间为18-36小时。

13、进一步地，所述步骤（1）中富勒烯为c60、c70、c76、c78、c80、c84、c90中的任意一种，芳香溶剂为苯、甲苯、二甲苯、乙苯、丙苯、均三甲苯、氯苯、二氯苯、三氯苯、硝基苯、苯甲醚、邻二氯苯、1,2,4-三氯苯、二硫化碳中的任意一种，富勒烯的浓度为0.3 mg/ml -8.0 mg/ml，相转移催化剂为四丁基铵溴化物、四丁基铵氯化物、四丁基碘溴化物、十六烷基三甲基铵溴化物、三辛基甲基氯化铵、四苄基氯化膦、四苄基溴化膦、甲基三辛基溴化膦、季胺盐离子液体中的任意一种，用量为富勒烯当量的10%-20%，碱性溶液为氢氧化钠或氢氧化钾水溶液，浓度为20%-40%。

14、进一步地，所述步骤（3）中缓冲液的ph为5-6，缓冲液为2吗啉乙磺酸或醋酸-醋酸钠，偶联剂为碳二亚胺或者羟基琥珀酰亚胺，透明质酸的分子量为8 kda -15 kda。

15、按照本发明的第三方面，提供了一种长效靶向富勒醇鼻咽制剂的应用，所述鼻咽制剂制备为喷雾剂型、雾化剂型、凝胶剂型或软膏剂型，以应用于鼻咽喉处放疗后软组织坏死的局部修复。

16、总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

17、（1）本发明实现了富勒醇与生长因子的协同递送和差异化释放，解决了现有治疗中抗氧化与促修复时效不匹配的问题。富勒醇快速释放（富勒醇48小时累积释放率45%-80%）提供即时抗氧化保护，抑制自由基级联反应；生长因子缓慢释放（72-120小时累积释放率30%-70%）维持长期修复信号，促进血管新生和基质重塑。这种时序性释放模式符合“先抗氧化后修复”的组织修复生理过程，较传统单一释放模式的制剂疗效更加持久稳定。本发明采用透明质酸外层修饰实现鼻黏膜靶向黏附，显著提高了局部药物浓度和作用时间。透明质酸与鼻黏膜cd44受体特异性结合，结合负电荷表面的静电吸附，实现双重靶向机制，局部滞留半衰期达6小时以上，较传统鼻喷剂提高3倍以上。每日给药1-2次即可维持有效治疗浓度，显著提高了患者依从性和治疗效率，解决了传统治疗需要多次给药且药效短暂的问题。本发明鼻咽制剂的活性成分包含三层核壳结构纳米粒，纳米尺度的设计，粒径适配鼻咽腔道，黏膜穿透能力强，滞留时间大幅延长。

18、（2）本发明对三层核壳结构纳米粒的粒径进行限定，纳米粒可随3 μm-5 μm的雾化气雾顺利抵达鼻咽深部，不会因粒径过大被纤毛系统快速清除，也不会因粒径过小被黏膜快速渗透进入体循环，150-220 nm的尺寸可在鼻咽坏死创面的破损组织间隙高效滞留，局部富集量比普通小粒径纳米粒提升40%以上。该整体粒径区间可保证纳米粒在喷雾、凝胶等剂型中长期稳定分散，不会出现颗粒团聚堵塞喷头的问题。富勒醇纳米核的粒径为130 nm-160 nm，具备足够的比表面积，可负载足量的富勒醇活性成分，高效清除放疗产生的氧自由基。含生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物中间层的厚度为10 nm -30 nm，以实现生长因子长效缓释。透明质酸外层的厚度为10 nm -30 nm，在最大化黏膜黏附性能的同时，不影响纳米粒整体分散性。三层尺寸精准匹配，可让纳米粒同时实现“深层递送-长效缓释-黏膜黏附-协同修复”的完整功能链，完全适配鼻咽放疗后软组织坏死的局部修复需求。

19、（3）本发明中生长因子为egf+vegf组合时，可同时实现上皮快速修复与微血管新生，解决放疗后黏膜破损+局部缺血的双重核心问题，生长因子0.1%-5%的质量占比既保证有效修复浓度，又避免过量生长因子引发的潜在组织增生风险。≥90%的活性保留率，可大幅减少活性成分的无效损耗，在低载药量下仍能实现高效修复，同时降低制剂的整体生产成本。3:2-4:1的乳酸/羟基乙酸摩尔比，可实现生长因子的匀速长效释放，避免突释或释放滞后问题。

20、（4）本发明设计的1:(0.8-2)的纳米核与中间层质量比，可保证富勒醇纳米核被完全包裹，不会出现内核外露泄漏的问题，1:(0.3-1.2)的纳米核与透明质酸层质量比，可充分暴露黏膜黏附位点。本发明设计的富勒醇纳米核、含生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物中间层和透明质酸外层质量配比下，功能权重分配合理，可实现富勒醇抗氧化抗炎、生长因子促血管生成、透明质酸基质修复的协同作用，无单一成分冗余或不足的缺陷。

21、（5）本发明制备过程中使富勒烯发生羟基化反应，富勒醇经多羟基化修饰后细胞毒性较原始富勒烯显著降低，采用微流控闪速沉淀技术实现了精确可控的规模化生产，产品质量稳定性显著优于传统制备方法。使用偶联剂活化含生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物中间层分子链末端的羧基，羧基与透明质酸的羟基或氨基形成共价键，由此完成透明质酸外层的稳定接枝。由此制备得到的产品实现了富勒醇与生长因子的协同递送和差异化释放，富勒醇快速释放提供抗氧化保护，生长因子缓慢释放维持修复信号，透明质酸外层赋予鼻黏膜靶向黏附性，显著延长局部药效维持时间，尤其适于鼻咽部沉积。由此制备得到的产品组分选择安全性良好，临床应用风险低。富勒醇经多羟基化修饰后细胞毒性较原始富勒烯显著降低，聚乳酸羟基乙酸共聚物为fda批准的gras级生物可降解材料，透明质酸为人体内源性成分且分子量范围内无免疫原性。整体制剂通过了细胞毒性、刺激性、过敏性等安全性评价，为临床转化奠定了安全基础。

22、（6）本发明中油相、醇相、水相的体积比为1:(1-2):(8-12)，可实现有机溶剂快速反溶剂析出，避免中间层出现孔洞或厚度不均的缺陷。匹配的流速比可让三相在微通道内实现毫秒级均匀湍流混合，保证纳米粒粒径均一。100-200 μm的通道宽度搭配40-600 ml/min的总流速，兼顾混合效率与连续化放大生产能力，批次间质量差异远小于传统工艺。

23、（7）本发明提出的90-110℃的加热条件搭配18-36小时的反应时长，可让富勒烯表面接枝足量羟基，保证富勒醇的水溶性与抗氧化活性达标。多类型富勒烯搭配适配芳香溶剂，可保证富勒烯完全溶解，0.3-8.0 mg/ml的浓度区间避免团聚，反应体系均一稳定。10%-20%当量的相转移催化剂，可高效穿梭两相界面，大幅提升羟基化反应速率，无催化剂过量残留风险。20%-40%的高浓度强碱体系，可保证富勒烯表面羟基接枝量均匀可控，产物水溶性与抗氧化活性达标。

24、（8）本发明提出的弱酸性区间，是碳二亚胺/羟基琥珀酰亚胺活化plga羧基的最优反应区间，透明质酸接枝率比中性条件提升30%以上。2-吗啉乙磺酸、醋酸-醋酸钠均为非氨基类缓冲液，不会与活化羧基发生副反应，完全适配共价接枝反应要求。8-15 kda的中低分子量透明质酸，既保证足够的黏膜黏附位点，又不会因分子量过大导致纳米粒团聚。

25、（9）本发明的长效靶向富勒醇鼻咽制剂可应用于制备针对鼻咽喉处放疗后软组织坏死局部修复的生物医药制品，例如，本发明鼻咽制剂可制备为喷雾剂型、雾化剂型、凝胶剂型或软膏剂型，这属于生物药品制造，喷雾剂型可直接喷洒于鼻咽入口浅表创面，雾化剂型可随气雾深入鼻咽深部隐窝，凝胶/软膏可涂抹于外部皮肤及鼻孔周边坏死区域，实现全鼻咽喉部位的无死角给药。凝胶、软膏剂型的高黏附特性，可在创面局部形成长效保护膜，隔绝外界刺激；喷雾、雾化剂型可快速分散，实现大面积黏膜的均匀给药，适配不同修复阶段的需求。多剂型组合可根据患者放疗后坏死的不同程度灵活选择给药方式，大幅降低给药不适感，提升长期修复治疗的依从性。