基于序列语法的植物内在无序区功能类群构建及预测方法

本发明属于生物，具体涉及基于序列语法的植物内在无序区功能类群构建及预测方法。

背景技术：

1、近年来，随着蛋白质组学、生物信息学以及分子生物学的发展，蛋白质序列和功能数据库不断完善，研究人员对蛋白质中的功能基序和保守位点逐渐由认知走向改造；同时，蛋白质固有无序区（intrinsically disordered region，idr）作为一类缺乏稳定三维结构的蛋白区域，在植物发育、逆境响应以及信号转导等过程中的作用逐渐受到关注；但是，与高度保守的功能结构域不同，idr通常缺乏序列保守性，现有依赖序列保守性和蛋白质结构的功能注释方法难以对其进行准确的功能分类和跨物种分析；目前，idr研究逐步从无序区识别拓展至序列特征、进化约束以及分子语法分析；然而，现有方法仍缺乏一个统一的跨植物物种分析框架，难以系统地解析idr的序列语法、进行功能分类以及构建跨物种功能图谱并预测新序列的功能。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术存在的上述问题，提供基于序列语法的植物内在无序区功能类群构建及预测方法。

2、本发明的上述目的通过以下技术手段来实现：

3、基于序列语法的植物内在无序区功能类群构建及预测方法，包括以下步骤：

4、步骤1、获取植物物种的全蛋白组数据文件；

5、步骤2、识别植物物种的全蛋白组数据文件中的蛋白质序列中位于内在无序区的idr序列并对idr序列进行清洗；

6、步骤3、采用nardini+算法计算出idr序列的90维截断z-score语法特征向量；

7、步骤4、设置k的取值范围，基于90维截断z-score语法特征向量采用不同k值的gin模型对各个植物物种内的所有idr序列进行聚类，根据各个植物物种的聚类结果分别为各个植物物种选取多个候选k值，并将候选k值的gin模型为候选gin模型，k为gin模型的聚类中心的数量；

8、步骤5、采用各个植物物种的各个候选gin模型分别对对应植物物种内的idr序列进行聚类，得到各个植物物种对应的候选gin-bank，所述候选gin-bank包括idr序列及idr序列的语法簇的归属结果；

9、步骤6、对语法簇进行go富集分析和kegg富集分析，构建出语法簇的功能注释结果表；

10、步骤7、根据各个植物物种的各个语法簇的功能注释结果表分别确定出各个植物物种的物种特异最终聚类数k值及对应的正式gin模型和正式gin-bank；

11、步骤8、构建跨物种语法簇相似图，所述跨物种语法簇相似图包括语法簇节点、保留边以及边权；采用leiden图社区发现算法对跨物种语法簇相似图进行跨物种语法簇社区划分；采用pvclust函数对所有跨物种语法簇社区进行层次聚类，得到多个候选跨物种功能单元；将候选跨物种功能单元升格为正式跨物种植物idr功能类群pifc；

12、步骤9、构建序列级植物idr功能预测器pifcmap，所述pifcmap以待测idr序列为输入，将待测idr序列映射到植物物种的正式gin-bank的语法簇，并根据语法簇与pifc的对应关系，输出待测idr序列的pifc功能类别预测结果。

13、如上所述候选gin-bank还包括idr序列的植物物种、语法簇的归属编号、idr序列到最近聚类中心的映射距离、idr序列到次近聚类中心的映射距离以及映射区分度指标；以各个聚类中心为中心构建语法簇，idr序列的语法簇的归属结果为以最近聚类中心为中心的语法簇，语法簇的归属编号为以最近聚类中心为中心的语法簇编号；所述映射区分度指标为；将映射区分度指标小于设定阈值的idr序列标记为低区分度映射条目；

14、所述语法簇的功能注释结果表包括植物物种、候选gin-bank所对应的候选k值、语法簇编号、显著富集go注释条目、显著富集kegg通路以及各显著富集go注释条目和各显著富集kegg通路各自的校正后p值和富集倍数。

15、如上所述跨物种语法簇相似图具体通过以下步骤构建：

16、步骤8.1、将每个植物物种的正式gin-bank中每个语法簇定义为一个语法簇节点，语法簇节点的序列语法特征采用对应语法簇的聚类中心的90维截断z-score语法特征向量；

17、步骤8.2、将来自不同植物物种的任意两个语法簇节点的连接定义为候选边，计算任意两个语法簇节点的候选边的边权，基于以下公式计算边权：

18、；

19、式中，和分别为两个语法簇节点的聚类中心的90维截断z-score语法特征向量，和分别为和在第维截断z-score语法特征上的坐标值，序号取1~90；为两个语法簇节点的候选边的边权；

20、步骤8.3、设置边权阈值，筛选出边权大于边权阈值的候选边为保留边，所有语法簇节点、保留边以及对应的边权构成跨物种语法簇相似图；

21、所述跨物种语法簇社区通过以下步骤划分：

22、步骤8.4.1、采用leiden图社区发现算法为跨物种语法簇相似图中的每个语法簇节点输出一个社区编号，将具有相同社区编号的语法簇节点划分到一个跨物种语法簇社区，所有跨物种语法簇社区构成社区划分结果；

23、步骤8.4.2、预先设定一个基准随机种子，采用基准随机种子的leiden图社区发现算法对跨物种语法簇相似图划分得到基准社区划分结果，再采用多个随机种子的leiden图社区发现算法对跨物种语法簇相似图划分分别得到多组对照社区划分结果，基准社区划分结果和多组对照社区划分结果构成总共n1次社区划分结果；

24、步骤8.4.3、首先，在基准社区划分结果中的跨物种语法簇社区中，将跨物种语法簇社区内部的任意两个语法簇节点构建为一个内部节点对，跨物种语法簇社区的所有内部节点对构成的跨物种语法簇社区的内部节点对集合；

25、其次，通过以下方式根据内部节点对集合对跨物种语法簇社区计算出稳定性得分：

26、统计内部节点对中的两个语法簇节点在n1次社区划分结果中被划分至同一社区的次数，并将次数除以n1，得到内部节点对的共社区支持率；计算跨物种语法簇社区的内部节点对集合中所有内部节点对的共社区支持率的平均值为跨物种语法簇社区的稳定性得分；

27、最后，设置稳定性阈值，筛选出基准社区划分结果中所有稳定性得分大于稳定性阈值的跨物种语法簇社区进入层次聚类；稳定性得分小于稳定性阈值的跨物种语法簇社区不进入层次聚类。

28、如上所述采用pvclust函数对所有跨物种语法簇社区进行层次聚类，得到多个候选跨物种功能单元具体包括以下步骤：

29、步骤8.5.1、将跨物种语法簇社区中的语法簇节点按照植物物种进行分组，若组内只包括一个语法簇节点，则以语法簇节点的聚类中心的90维截断z-score语法特征向量为所属植物物种在跨物种语法簇社区中的物种代表向量；若组内包括多个语法簇节点，则以组内所有语法簇节点的聚类中心的90维截断z-score语法特征向量的平均值为所属植物物种在跨物种语法簇社区中的物种代表向量；

30、最后将跨物种语法簇社区内所有植物物种的物种代表向量求平均，得到跨物种语法簇社区的90维社区平均语法向量；

31、构建跨物种语法簇社区的候选社区语法矩阵，候选社区语法矩阵的每一行对应一个跨物种语法簇社区，每一列对应90维社区平均语法向量中的一个语法特征维度；

32、步骤8.5.2、以候选社区语法矩阵为输入，采用pvclust函数进行层次聚类，输出跨物种语法簇社区之间的层次聚类树和各聚类分支的au值；

33、若多个跨物种语法簇社区在层次聚类树中被归为同一聚类分支，且同时满足以下条件时，将聚类分支视为候选合并分支：

34、条件一、聚类分支不是包含全部跨物种语法簇社区的根分支；条件二、聚类分支至少包括两个跨物种语法簇社区；条件三、聚类分支的au值不低于设定au值阈值；

35、然后，将所有互不包含的候选合并分支，分别确定为一个最终合并分支；对于存在父子包含关系的多个候选合并分支，仅保留其中跨物种语法簇社区最多的候选合并分支为最终合并分支；

36、最后，将每个最终合并分支内的所有跨物种语法簇社区合并为一个候选跨物种功能单元。

37、如上所述将候选跨物种功能单元升格为正式跨物种植物idr功能类群pifc具体包括以下步骤：

38、步骤8.6.1、首先，构建候选跨物种功能单元的功能证据汇总表，功能证据汇总表包括候选跨物种功能单元包括的植物物种、植物分类学纲、语法簇编号以及显著富集go注释条目；并统计功能证据汇总表中相同的显著富集go注释条目对应的语法簇数量、植物物种数量以及植物分类学纲数量；

39、步骤8.6.2、当功能证据汇总表中有显著富集go注释条目满足跨物种功能一致性要求时，则将候选跨物种功能单元升格为正式跨物种植物idr功能类群pifc；

40、其中，跨物种功能一致性要求为：若候选跨物种功能单元中支持某显著富集go注释条目的植物物种支持比例和支持某显著富集go注释条目的植物分类学纲支持比例均不低于预设阈值，则显著富集go注释条目满足跨物种功能一致性要求；

41、所述支持某显著富集go注释条目的植物物种支持比例为：支持某显著富集go注释条目的植物物种数量占所属候选跨物种功能单元的植物物种数量的比例；所述植物分类学纲支持比例为支持某显著富集go注释条目的植物分类学纲数量占所属候选跨物种功能单元的植物分类学纲数量的比例；

42、步骤8.6.3、对所有正式跨物种植物idr功能类群pifc进行排序和编号：

43、条件一：满足跨物种功能一致性要求的显著富集go注释条目更多；

44、条件二：正式跨物种植物idr功能类群pifc覆盖更多的植物分类学纲；

45、条件三：正式跨物种植物idr功能类群pifc覆盖更多的植物物种；

46、条件四：在n1次社区划分结果中，正式跨物种植物idr功能类群pifc中所有构成内部节点对的两个语法簇节点被划分到同一社区的次数的总和更多；

47、当前一条件相同时才进入下一条件的比对；排序完成后，依照排序顺序对所有正式跨物种植物idr功能类群pifc依次编号。

48、如上所述序列级植物idr功能预测器pifcmap通过以下步骤得到待测idr序列的pifc功能类别预测结果：

49、步骤9.1、构建序列级植物idr功能预测器pifcmap的pifcmap参考包，pifcmap参考包包括编号后的正式跨物种植物idr功能类群pifc，pifcmap参考包还包括各植物物种的正式gin模型、正式gin-bank以及正式gin-bank中各个语法簇的功能注释结果表；pifcmap参考包还包括各植物物种的54维组成类背景统计参数；

50、步骤9.2、序列级植物idr功能预测器pifcmap对待测idr序列进行清洗；

51、步骤9.3、序列级植物idr功能预测器pifcmap再将清洗后的待测idr序列计算相对于不同植物物种的54维组成类背景统计参数的90维截断z-score语法特征向量；

52、步骤9.4、序列级植物idr功能预测器pifcmap采用pifcmap参考包中各植物物种的正式gin模型计算待测idr序列到正式gin-bank中各语法簇的聚类中心的映射距离，然后对待测idr序列到所有植物物种的正式gin-bank中的所有语法簇的聚类中心的映射距离进行从小到大进行排序，得到待测idr序列的语法簇的归属结果排序表；

53、步骤9.5、序列级植物idr功能预测器pifcmap获取待测idr序列的语法簇的归属结果排序表中排名前3的语法簇和语法簇对应的功能注释结果表分别为待测idr序列的功能预测参考语法簇和功能预测结果；

54、步骤9.6、序列级植物idr功能预测器pifcmap判断待测idr序列的功能预测参考语法簇是否属于正式跨物种植物idr功能类群pifc，若待测idr序列的功能预测参考语法簇中存在一个或多个语法簇属于正式跨物种植物idr功能类群pifc，则以待测idr序列的功能预测参考语法簇所属的全部正式跨物种植物idr功能类群pifc去重后为待测idr序列的pifc功能类别预测结果；若待测idr序列的语法簇的归属结果排序表中排名前3的语法簇均不属于任何正式跨物种植物idr功能类群pifc，则待测idr序列无pifc功能类别预测结果；

55、步骤9.7、序列级植物idr功能预测器pifcmap输出待测idr序列的pifcmap预测结果表，待测idr序列的pifcmap预测结果表包括待测idr序列的语法簇的归属结果排序表、待测idr序列的功能预测参考语法簇和功能预测结果以及待测idr序列的pifc功能类别预测结果。

56、如上所述idr序列的90维截断z-score语法特征向量包括idr序列的90维z-score语法特征向量的截断z-score值，所述idr序列的90维z-score语法特征向量包括idr序列的54维组成类z-score和idr序列的36维排列类z-score；

57、所述idr序列的54维组成类z-score通过以下方式得到：

58、首先，预计算每个植物物种的54维组成类背景统计参数：对于植物物种的每一条idr序列，分别计算在54个组成类特征上的原始特征值；对于每一个组成类特征，以植物物种的全部idr序列分别在各个组成类特征上的原始特征值构成的集合为植物物种在对应组成类特征上的背景分布；然后分别计算每一个组成类特征上的背景分布的均值和标准差，共得到植物物种的54维组成类背景统计参数；

59、其次，计算每条idr序列的54维组成类z-score，每条idr序列的54维组成类z-score包括每条idr序列分别在54个组成类特征上的z-score；

60、idr序列在单个组成类特征上的z-score通过以下方式得到：idr序列在单个组成类特征上的原始特征值减去idr序列所属植物物种的对应组成类特征上的背景分布的均值后再除以idr序列所属植物物种的组成类特征上的背景分布的标准差；

61、所述idr序列的36维排列类z-score通过以下步骤得到：

62、步骤3.3、残基类型识别：将idr序列的氨基酸组成按照理化性质划分为8类残基类型，所述8类残基类型分别为极性残基、疏水残基、带正电残基、带负电残基、芳香族残基、丙氨酸、脯氨酸以及甘氨酸；

63、残基排列类原始特征计算：对8类残基类型两两组合，得到36类残基组合；计算出每一类残基组合在线性的idr序列中的排列参数作为idr序列的对应类残基组合的残基排列类原始特征，共得到idr序列的36维残基排列类原始特征；

64、步骤3.4、残基类型比例计算为：分别统计8类残基类型中每一类残基类型在idr序列中的残基数，并将每一类残基类型在idr序列中的残基数除以idr序列的总长度，分别得到各个残基类型在该idr序列中的残基比例；对于36维残基排列类原始特征中的任一残基排列类原始特征，若残基排列类原始特征所对应的一类残基类型或两类残基类型中的任意一类残基类型在idr序列中的残基类型比例低于设定阈值，则将对应的残基排列类原始特征标记为低频排列特征，低频排列特征对应的残基组合为低频残基组合；

65、同组成随机打乱：在保持idr序列的氨基酸组成不变的条件下，对idr序列进行随机打乱n2次，每次随机打乱得到一个随机序列，共得到idr序列的n2个随机序列，n2个随机序列共同构成idr序列自身的同组成随机背景序列集合；

66、36维排列类随机背景统计参数计算：对idr序列的任意单一类别的残基组合，计算单一类别的残基组合分别在idr序列自身的同组成随机背景序列集合中所有随机序列中的排列参数，然后计算单一类别的残基组合的所有排列参数的均值和标准差，得到单一类别的残基组合的排列类随机背景统计参数；对36类的残基组合分别计算出排列类随机背景统计参数，得到idr序列的36维排列类随机背景统计参数；

67、步骤3.5、36维排列类z-score计算：计算每条idr序列的36维排列类z-score：每条idr序列的36维排列类z-score包括每条idr序列分别在36类残基组合上的z-score；

68、idr序列分别在单一类别的残基组合上的z-score通过以下方式得到：首先，将idr序列在低频残基组合上的z-score直接置为0；再将idr序列在除低频残基组合之外的其余的单一类别的残基组合上的残基排列类原始特征减去idr序列在对应残基组合的排列类随机背景统计参数中的均值后再除以idr序列在对应残基组合的排列类随机背景统计参数中的标准差；

69、在计算36维排列类z-score时，将idr序列中的各氨基酸按预设编码规则转换为整数型数字序列，再基于idr序列对应的整数型数字序列执行残基类型识别、残基排列类原始特征计算、残基类型比例计算、同组成随机打乱、36维排列类随机背景统计参数计算以及36维排列类z-score计算；再采用编译加速或并行计算或向量化计算方式进行加速；

70、再将所有植物物种的全部idr序列按照预设数量划分为多个计算分块，每个计算分块包括多条idr序列；在同一计算分块内，各条idr序列分别按照其自身氨基酸组成独立构建各条idr序列自身的同组成随机背景序列集合，再分别计算得到各条idr序列的36维排列类随机背景统计参数和36维排列类z-score；最后，每个计算分块计算完成后输出对应的分块结果文件，待全部计算分块完成后，将分块结果文件合并，得到所有植物物种的全部idr序列的36维排列类z-score。

71、如上所述候选gin模型通过以下方式选取：

72、步骤4.1、筛选植物物种内的所有长度在设定长度范围内的idr序列构建为物种内gin模型训练子集；提取物种内gin模型训练子集的每条idr序列的90维截断z-score语法特征向量，形成植物物种的gin模型的训练特征矩阵，训练特征矩阵的每一行分别对应一条idr序列，训练特征矩阵的每一列分别对应90维截断z-score语法特征向量中的一个语法特征维度；

73、步骤4.2、采用不同k值的gin模型对训练特征矩阵进行kmeans聚类，以inertia值最小的聚类结果为对应k值对应的聚类结果；

74、步骤4.3、绘制inertia值随k值变化的inertia曲线，采用kneedle算法和tail-fitelbow算法对inertia曲线识别出的拐点对应的k值分别为k1和k2；

75、当k1与k2不同时，计算k1与k2的算术平均数并四舍五入为整数，得到k3，若k1与k2不为相邻整数，取k1、k2以及k3为三个候选k值；若k1与k2为相邻整数，k3取k1与k2中的较大值再加1，若k3超出预设k值范围，则k3取k1与k2中的较小值再减1；

76、当k1与k2相同时，取k0-2、k0以及k0+2为三个候选k值，k0=k1=k2；

77、步骤4.4、以植物物种的三个候选k值的gin模型分别为植物物种的三个候选gin模型。

78、如上所述显著富集go注释条目、显著富集kegg通路以及各显著富集go注释条目和各显著富集kegg通路各自的校正后p值和富集倍数具体通过以下步骤得到：

79、步骤6.1、提取语法簇中所有idr序列所属基因，形成语法簇的基因集合；

80、将始位置距蛋白n端或者终止位置距蛋白c端小于10个氨基酸残基的idr序列标记为非连接类idr序列，否则标记为连接类idr序列；

81、在≥1.5的idr序列中筛选出非连接类idr序列长度不小于35个氨基酸残基或连接类idr序列长度不小于45个氨基酸残基的idr序列及对应基因构建为功能富集分析子集；对于候选gin-bank，将进入功能富集分析子集的全部非冗余基因定义为候选gin-bank的背景基因集；对于候选gin-bank中的任一语法簇，将语法簇的基因集合内进入功能富集分析子集的非冗余基因定义为语法簇的待检验基因集；

82、步骤6.2、首先，获取原始go注释表：以语法簇的待检验基因集和语法簇所属候选gin-bank的背景基因集涉及的基因编号为检索对象，通过ensembl plants biomart获取基因与go注释条目之间的对应关系，形成原始go注释表；

83、其次，获取go本体文件和植物go slim定义文件；

84、再次，将原始go注释表中的go注释条目映射至植物go slim定义文件中的go注释条目，得到植物go slim注释表；

85、最后，将植物go slim注释表整理为go-term2gene和go-term2name两类文件；

86、步骤6.3、对语法簇的待检验基因集进行go富集分析：

87、首先，将语法簇的待检验基因集中在植物go slim注释表的非冗余基因定义为语法簇的go待检验基因集，将语法簇所属候选gin-bank的背景基因集中在植物go slim注释表的非冗余基因定义为go背景基因集；

88、其次，以go背景基因集为统计背景，采用enricher函数，以go-term2gene和go-term2name为参考文件，对语法簇的go待检验基因集进行富集分析，得到go待检验基因集对应的各go注释条目的原始p值和富集倍数；对各go注释条目的原始p值采用benjamini-hochberg方法进行多重检验校正，得到各go注释条目的校正后p值；将校正后p值不大于第一设定p值阈值的go注释条目标注为语法簇的显著富集go注释条目；

89、步骤6.4、对具有kegg物种编号的植物物种，获取植物物种的kegg通路列表，并获取语法簇的待检验基因集和语法簇所属候选gin-bank的背景基因集涉及的基因与kegg通路之间的对应关系，并整理为本地快照kegg-term2gene和本地快照kegg-term2name；

90、步骤6.5、对语法簇的待检验基因集进行kegg富集分析：

91、首先，将语法簇的待检验基因集中具有kegg通路注释的非冗余基因定义为语法簇的kegg待检验基因集；将语法簇所属候选gin-bank的背景基因集中具有kegg通路注释的非冗余基因定义为kegg背景基因集；

92、其次，以kegg背景基因集为统计背景，采用enricher函数，以本地快照kegg-term2gene和本地快照kegg-term2name为参考文件，对语法簇的kegg待检验基因集进行kegg通路富集分析，得到语法簇的kegg待检验基因集对应的各kegg通路的原始p值和富集倍数；对各kegg通路的原始p值采用benjamini-hochberg方法进行多重检验校正，得到各kegg通路的校正后p值；将校正后p值不大于第二设定p值阈值的kegg通路标注为语法簇的显著富集kegg通路。

93、如上所述植物物种的物种特异最终聚类数k值及对应的正式gin模型和正式gin-bank通过以下步骤得到：

94、首先，构建候选k综合评价表，候选k综合评价表包括候选k值、低区分度映射条目比例、具有显著功能注释的语法簇数量以及功能注释覆盖度；

95、其次，根据候选k综合评价表通过以下条件从植物物种的三个候选k值中选出物种特异最终聚类数k值：条件一：具有更多的显著功能注释的语法簇数量；

96、条件二：具有更广的功能注释覆盖度；

97、条件三：具有更低的低区分度映射条目比例；

98、当前一条件相同的比对结果时才进入下一条件的比对；

99、其中，低区分度映射条目比例为候选gin-bank中小于1.5的idr序列的数量占所属植物物种的全部idr序列的数量的比例；具有显著功能注释的语法簇为至少一个显著富集go注释条目或显著富集kegg通路的语法簇；功能注释覆盖度为具有显著功能注释的语法簇数量占所属候选gin-bank的全部语法簇数量的比例；

100、以物种特异最终聚类数k值对应的候选gin模型和候选gin-bank分别为正式gin模型、正式gin-bank以及正式gin-bank中各语法簇的功能注释结果表。

101、本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

102、（1）、本发明以不同植物物种的物种内语法簇为基本单元，基于语法簇聚类中心的相似性构建跨物种语法簇相似图，并结合图社区发现和功能证据形成正式跨物种植物idr功能类群pifc；由此，即使不同植物物种中的idr序列本身缺乏显著保守性，也能够根据序列语法相似性建立跨物种功能对应关系，实现植物idr功能类群的自动划分和图谱化组织。

103、（2）、本发明进一步将正式gin-bank和正式跨物种植物idr功能类群pifc及其功能注释结果整合为pifcmap预测参考体系，对待测idr序列重新计算语法特征并映射至语法簇和正式跨物种植物idr功能类群pifc；由此，本发明不仅可用于已有参考蛋白组植物的idr功能注释，还可用于非模式植物、注释不完善作物以及人工设计idr序列的功能预测和候选序列筛选。

104、（3）、本发明将候选gin-bank的低区分度映射条目比例、具有显著功能注释的语法簇数量以及功能注释覆盖度结合起来确定正式gin模型及正式gin-bank；由此，最终形成的物种内语法簇不仅是数学意义上的聚类结果，而且具有对应的功能倾向，可用于植物idr的条目级功能注释和候选功能区域筛选。

105、（4）、本发明通过对idr序列进行识别，将识别并清洗后的idr序列进一步转换为90维截断z-score语法特征向量，由此，将缺乏稳定三维结构和序列保守性较弱的植物idr转化为可量化和可比较的语法特征表示，从而降低对现有序列同源比对、保守结构域以及稳定蛋白结构的依赖。

106、（5）、本发明针对36维残基排列类特征计算量大的问题，对残基类型识别、残基排列类原始特征计算、残基类型比例计算、同组成随机打乱、36维排列类随机背景统计参数计算以及36维排列类z-score进行了加速处理，在不减少随机打乱次数、不改变残基类别划分规则以及语法特征定义的前提下，显著降低植物idr序列资源集pidrome中90维语法特征计算的时间成本，使多物种植物idr语法图谱的构建具有实际可实施性。