激活内质网应激的小分子化合物在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用及高通量筛选方法

本发明属于生物医药，具体涉及到激活内质网应激的小分子化合物在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用及高通量筛选方法。

背景技术：

1、多发性骨髓瘤是一种无法治愈的血液系统恶性肿瘤，其特征是骨髓中浆细胞的克隆性增殖，导致严重的骨骼病变、肾功能障碍和免疫缺陷。尽管在过去十年中靶向治疗和免疫治疗取得了重大进展，但药物耐药性和疾病复发仍给多发性骨髓瘤的临床治疗带来重大挑战。因此，仍需新的药物或治疗策略来治疗多发性骨髓瘤。

2、多发性骨髓瘤细胞本质是浆细胞，因此多发性骨髓瘤细胞的一个显著特征是大量合成免疫球蛋白，这一过程给内质网带来了巨大的未折叠蛋白处理的需求。与正常细胞或其他癌细胞不同，多发性骨髓瘤细胞本质上对内质网功能过度依赖：大量生成的免疫球蛋白重链和轻链需要高效的内质网伴侣机制来确保蛋白质正确折叠。这种强大的免疫球蛋白合成导致多发性骨髓瘤细胞中持续存在基础内质网应激状态。为了应对这种固有的蛋白质毒性压力，多发性骨髓瘤细胞进化出适应性机制来过度激活未折叠蛋白反应（upr）——这是一种保守的信号通路，通过增强蛋白质折叠能力、促进内质网相关降解错误折叠的蛋白质以及调节细胞代谢来恢复内质网稳态。然而，这种适应性未折叠蛋白反应（upr）激活也使多发性骨髓瘤细胞对进一步诱导内质网应激变得极其敏感：

3、与拥有强大内质网应激耐受储备的正常细胞不同，多发性骨髓瘤细胞处于内质网应激的“边缘”，即使是轻微的额外内质网应激也会超出未折叠蛋白反应（upr）的适应能力，从而引发内质网应激诱导的细胞死亡。这种独特的生物学脆弱性使内质网应激成为多发性骨髓瘤极具吸引力且具有选择性的治疗靶点，因为能增强内质网应激的药物可以优先清除骨髓瘤细胞，同时不杀伤内质网应激基础水平较低的正常细胞。因此，获得这种可以特异性恶化内质网应急的化合物有望为治疗多发性骨髓瘤提供新的潜在药物。

4、长期以来，源自植物、微生物和海洋生物的天然产物一直是抗癌药物研发的重要基石，其将临床前潜力转化为临床成功的记录十分出色。迄今为止，许多从植物、真菌和海洋生物中提取的生物活性化合物通过靶向恶性肿瘤中失调的关键细胞通路，彻底改变了癌症治疗。值得注意的是，许多天然产物通过扰乱蛋白质稳态发挥其抗癌作用。这种利用癌症特有的代谢和应激适应脆弱性的内在能力，突显了天然产物既可用作阐明疾病驱动途径的机制探针，也可用作开发靶向治疗药物的优先化合物。鉴于多发性骨髓瘤是一种以异常蛋白质合成和超高的基础内质网应激为特征的疾病，天然产物代表了一种尚未充分开发的资源，可用于探索能够选择性进一步加剧内质网应激并诱导内质网应激介导的细胞死亡的新型药物。

技术实现思路

1、本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

2、鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

3、因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供激活内质网应激的小分子化合物在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。

4、为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：所述激活内质网应激的小分子化合物为结构式如式i所示的葫芦素e(cucurbitacin e，cue)；

5、

6、式i。

7、作为本发明所述激活内质网应激的小分子化合物在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用的一种优选方案，其中：所述葫芦素e以浓度依赖的方式触发人多发性骨髓瘤细胞的内质网应激。

8、作为本发明所述激活内质网应激的小分子化合物在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用的一种优选方案，其中：所述人多发性骨髓瘤细胞包括h929细胞系、rpmi-8226细胞系和多发性骨髓瘤.1s细胞系。

9、作为本发明所述激活内质网应激的小分子化合物在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用的一种优选方案，其中：所述葫芦素e增强人多发性骨髓瘤细胞内ire1α和eif2α的磷酸化水平。

10、作为本发明所述激活内质网应激的小分子化合物在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用的一种优选方案，其中：所述葫芦素e以浓度依赖的方式上调人多发性骨髓瘤细胞内grp78和ddit3的蛋白表达。

11、作为本发明所述激活内质网应激的小分子化合物在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用的一种优选方案，其中：所述葫芦素e具有特异性的抗多发性骨髓瘤活性。

12、本发明的再一目的是，提供一种治疗多发性骨髓瘤的药物，所述药物靶向内质网应激信号分子，触发细胞发生内质网应激，包含葫芦素e以及其他药学上可接受的辅料。

13、本发明的再一目的是，提供一种激活内质网应激的小分子化合物的高通量筛选方法。

14、为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：所述筛选方法基于ire1/xbp1信号通路，构建ire1/xbp1报告系统的高通量筛选平台，包括，

15、将含有mneongreen荧光片段的xbp1质粒通过慢病毒转染导入人多发性骨髓瘤细胞；

16、通过嘌呤霉素筛选稳定表达株，获得荧光报告体系；

17、荧光报告体系的细胞过夜处理，向其中加入待检测的小分子化合物，培养24h后利用流式细胞术检测人多发性骨髓瘤细胞的荧光强度以及细胞活率，筛选得到荧光强度比值＞2.0、细胞活率比值＜0.4的小分子化合物，即得到激活内质网应激的小分子化合物。

18、作为本发明所述激活内质网应激的小分子化合物的高通量筛选方法的一种优选方案，其中：所述人多发性骨髓瘤细胞选自h929细胞。

19、作为本发明所述激活内质网应激的小分子化合物的高通量筛选方法的一种优选方案，其中：所述含有mneongreen荧光片段的xbp1报告质粒含xbp1基因部分可变剪切片段，所述xbp1基因部分可变剪切片段在内质网应激诱导ire1rnase活性激活时被特异性切除，引发翻译移码，从而实现荧光蛋白mneongreen的表达。

20、本发明有益效果：

21、（1）本发明首次证实葫芦素e可通过激活多发性骨髓瘤细胞的内质网应激用于抗多发性骨髓瘤活性，并明确其以浓度依赖的方式触发人多发性骨髓瘤细胞的内质网应激，能够增强人多发性骨髓瘤细胞内ire1α和eif2α的磷酸化水平并以浓度依赖的方式上调人多发性骨髓瘤细胞内grp78和ddit3的蛋白表达。

22、（2）本发明提供的葫芦素e对多发性骨髓瘤细胞表现出强效杀伤作用，而对正常细胞毒性很低，可实现肿瘤选择性治疗，避免传统药物广谱毒性带来的副作用，提高治疗安全性，具备良好的成药潜力和临床转化价值。

23、（3）本发明同时建立了一种激活内质网应激的小分子化合物的高通量筛选方法，该方法基于ire1/xbp1荧光报告系统，可同步检测xbp1剪接激活与细胞活力，实现多个化合物的快速、无偏筛选，筛选结果真实可靠。